Microkristallografie van eiwitkristallen en

Het algemene doel van dit protocol is om röntgenkristallografische methodologieën te introduceren die worden toegepast op microkristallen, en in het bijzonder op microkristallen die in cellen zijn geproduceerd en als in vivo kristallen worden beschouwd. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat het een eenvoudig en efficiënt proces biedt om microkristallen te produceren, te detecteren en te analyseren. Deze methode is erop gericht het gebruik van microkristallen te vergemakkelijken door gebruik te maken van kristallen die in levende cellen zijn gegroeid, waardoor complexe zuiveringsprocessen en Aprocox-sedatieproeven overbodig worden.

In deze video richten we ons op de eenvoudige preparatie en manipulatie voor röntgendeflectie-experimenten bij een synchrotron-beamline. We laten de stappen zien die het meest verschillen van de klassieke kristallografie. In deze demonstratie maken we gebruik van kristallen van het vitale polyhedere eiwit die met succes zijn gekweekt, maar de methode kan ook worden toegepast op eiwitten die kristallen vormen in elke bacteriële, insecten-, zoogdier- of gistcel.

Incubeer eerst 30 milliliters Sf9-cellen die het cypovirus polyhedron-eiwit overexpresseren gedurende drie dagen bij 27 °C op een roterend platform. Draag 500 microliters van de Sf9-celcultuur over naar een microcentrifugebuis met een steriele serologische pipet, waarbij u er zorg voor draagt dat de steriliteit van de hoofdcultuur behouden blijft door gebruik te maken van een klasse II biologische veiligheidskabinet en standaard aseptische technieken te volgen. Pipetteer vijf microliters cellen vanuit de microcentrifugebuis op een objectglas.

Plaats vervolgens voorzichtig een glazen dekglas onder een hoek over het monster, waarbij één rand de druppel raakt, en laat het dekglas voorzichtig op de vloeistof zakken om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Maak daarna beelden van het preparaat met een omgekeerde microscoop. Onderzoek de cellen zorgvuldig, beginnend bij een 200-voudige vergroting en inzoomend tot de maximale vergroting bij het detecteren van een potentieel kristal.

Letten op scherpe randen en veranderingen in de refractiviteit. Indien kristallen worden geïdentificeerd, moet de cultuur dagelijks worden onderzocht om de kristalgroei te monitoren door de voorgaande stappen te herhalen. Oogst Sf9-cellen door de cultuur over te brengen naar een centrifugebuis.

Plaats de buis op ijs en ga zo snel mogelijk door naar de volgende stap. Pipetteer voor de isolatie van kristalbevattende cellen vier milliliter geïnfecteerde Sf9-cellen in een buis die geschikt is voor flowcytometrieanalyse. Bereid een tweede buis voor met een gelijk aantal Sf9-cellen uit een mock-geïnfecteerde cultuur als controle.

Voeg vervolgens, vlak voor de flowcytometrische evaluatie, propidiumjodide toe aan beide monsters tot een eindconcentratie van 1 µg/mL. Pas nu de controlemonstercellen toe op een standaard flowcytometer die in staat is tot cel sortering op basis van FSC en SSC. Analyseer ten minste 20.000 events.

Nadat dode cellen, celaggregaten en debris uit de analyse zijn verwijderd, wordt de FSC-SSC-plot gegenereerd. Analyseer vervolgens ten minste 20.000 events van de kristalbevattende sample. Vergelijk de FSC-SSC-plot met de controle en let op de verschijning van een aparte populatie die overeenkomt met de kristalbevattende cellen.

Definieer de gates rond de celpopulatie die kristallen bevat, die gewoonlijk verschijnt bij een hogere SSC of FSC. Sorteer met behulp van deze gating ongeveer 150.000 tot 200.000 van de kristalbevattende cellen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die vooraf is gevuld met 50 microliters PBS-buffer. Beeld de gesorteerde monsters af met lichtmicroscopie zoals eerder beschreven om te bevestigen welke populatie geassocieerd is met de kristalbevattende cellen.

In deze fase kunnen de cellen worden geïncubeerd met zware-atoomoplossingen als experimentele fasering vereist is. Deze aanpak volgt op de screening van diverse verbindingen en incubatietijden zoals beschreven in de tekst en in andere reviews. Bereid de hulpmiddelen voor het monteren van het monster voor door eerst een micro-mesh die op een pin is gemonteerd aan het uiteinde van een magnetische staaf te bevestigen.

Plaats de wand zijwaarts in de inkeping van een dialyse-drijver. Pak vervolgens met een pincet een papieren lont op en vergrendel deze. Controleer dubbel of de opstelling volledig is voordat u verdergaat.

Meng nu de cellen met een gelijk volume 0,4% trypaanblauw-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,2%. Pipetteer na het resuspenderen van de cellen 0,5 µL van de gesorteerde cellen op het micromesh. Nadat de cellen op het oppervlak van het micromesh zijn neergedaald, wordt het grootste deel van de overtollige vloeistof verwijderd door te blotten met een papieren lont. Als het micromesh niet voldoende is geblot, zullen de cellen zich op verschillende dieptes in de overtollige vloeistof bevinden, wat hun uitlijning met de röntgenbundel in de synchrotron zal bemoeilijken.

Bovendien zal overtollige vloeistof de achtergrondruis van de röntgenverstrooiing verhogen. Als het micro-gaas te veel wordt gedroogd, wordt de vloeistof volledig verwijderd en zal het monster niet in de openingen van het rooster blijven zitten. Bij een optimale blotting blijft er slechts een dunne laag vloeistof op het micro-gaas achter, waardoor het monster wordt beschermd en in de openingen van het rooster wordt gedwongen.

Sommige kristallen vereisen het gebruik van een cryoprotectant. In dit geval is dat niet nodig, maar de procedure zou hetzelfde zijn als bij het aanbrengen van het monster en het daaropvolgende drogen. Zorg ervoor dat er slechts een dunne vloeistoflaag overblijft.

Koel het micromesh onmiddellijk snel af in vloeibare stikstof en breng het over naar een robot-puck voor transport naar een synchrotron microfocus-beamline. Vanwege de kleine afmetingen van de in vivo-kristallen moet diffractiegegevens worden verzameld op een microfocus-crystallografie-beamline. Monteer eerst het micromesh op de goniometer.

Begin nu met het centreren van het micromesh ten opzichte van de straalpaden met behulp van de frontale en zijdelingse oriëntaties. Richt de uitlijning nauwkeurig bij terwijl het micromesh frontaal is geplaatst, door het midden van een van de horizontale banen van het micromesh uit te lijnen. Verzamel gegevens langs deze horizontale baan met slechts minimale heraanpassingen van de uitlijning.

Zodra alle kristallen in de lane zijn getest, gaat u over naar de volgende lane en herhaalt u de uitlijningsprocedure. Zorg ervoor dat de lanes die zijn verwerkt duidelijk worden geïdentificeerd, zodat er geen kristallen worden overgeslagen of twee keer worden gefotografeerd, waarbij de kleurverandering van trypaanblauw als leidraad dient. Er wordt een overzicht gegeven van twee methoden voor structuurbepaling met behulp van in vivo microkristallen.

De bovenste rij beschrijft de klassieke aanpak waarbij kristallen uit cellen worden gezuiverd, terwijl de onderste rij de in cellulo crystallografie-aanpak laat zien, waarbij de kristallen in de gastcellen blijven voor gegevensverzameling. Voor de in cellulo aanpak wordt het flowcytometrie-profiel van niet-geïnfecteerde cellen vergeleken met een profiel van kristalhoudende cellen; dit wordt gebruikt om te bepalen welke celpopulatie geselecteerd moet worden om kristalhoudende cellen van de andere cellen te scheiden. In dit voorbeeld hebben cellen die polyhedra bevatten een hogere zijwaartse verstrooiing dan niet-geïnfecteerde cellen.

Cellen die zijn gekleurd met trypaanblauw kunnen eenvoudig worden gevisualiseerd met camera's die bij de meeste synchrotron-beamlines beschikbaar zijn. Hoewel gezuiverde kristallen vanwege hun geringe omvang arbeidsintensief zijn om te identificeren en uit te lijnen met de röntgenstraal, is het bij het verzamelen van gegevens het beste om in een rasterpatroon te werken. Dit minimaliseert de centreringsprocedures en voorkomt dat dezelfde cel of hetzelfde kristal twee keer wordt blootgesteld of dat cellen en kristallen worden gemist. Eenmaal beheerst, neemt deze workflow ongeveer een halve dag in beslag, van het oogsten van de kristalbevattende cellen tot de gegevensverzameling.

Deze procedure is compatibel met heavy-atom soaks voor experimentele fasering. In het geval van het polyeder werd de normale structuur verkregen binnen acht dagen na de start van de eiwitexpressie. Vergeet niet dat werken met vloeibare stikstof extreem gevaarlijk kan zijn en dat er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tegen verstikking en brandwonden.