Name: Microkristallografie van eiwitkristallen en In Cellulo Diffractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer röntgendiffractie van microkristallen in levende cellen zonder complexe zuivering. Deze methode vereenvoudigt kristallografie voor diverse eiwitten en biologische systemen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Chan-Sien Lay erkennen voor het leveren van foto&#39;s van gezuiverde microkristallen, Daniel Eriksson en Tom Caradoc-Davies voor ondersteuning bij de MX2-straal van de Australische Synchrotron, en Kathryn Flanagan en Andrew Fryga van de FlowCore-faciliteit van Monash University voor hun Onschatbare hulp.

<ol><li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 0(2014).</li>
<li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li>
<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="https://elifesciences.org/articles/01345">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2 (0), e01345(2013).</li>
<li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0889311X.2010.527964">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li>
<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/CH/CH14455">Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography.</a> Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cypovirus+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cypovirus polyhedra.</a> Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li>
<li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451(2015).</li>
<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
<li>Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029405000956">Protein crystallization in vivo.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Bombyx+mori+cytoplasmic+polyhedrosis+virus+polyhedrin+in+insect+cells+by+using+a+baculovirus+expression+vector%2C+and+its+assembly+into+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra.</a> J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).</li>
<li>Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Virus-like+Particles+for+Vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Production+and+Purification+of+Recombinant+Murine+Kindlin-3+from+Insect+Cells+for+Biophysical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Berger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MultiBac+Protein+Complex+Production+Platform+at+the+EMBL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
<li>Margine, I., Palese, P., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Functional+Recombinant+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Proteins+from+the+Novel+H7N9+Influenza+Virus+Using+the+Baculovirus+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Baskaran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+cellulo-derived+structure+of+PAK4+in+complex+with+its+inhibitor+Inka1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1.</a> Nat Comm. 6, 1-11 (2015).</li>
<li>Armour, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+Parallel+Processing+Approach+for+Gene-to-structure+Determination+of+the+Influenza+Polymerase+PB2+Subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).</li>
<li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?a15572">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).</li>
<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
<li>Rey, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virology%3A+holed+up+in+a+natural+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Virology: holed up in a natural crystal.</a> Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).</li>
<li>Schönherr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+investigation+of+dynamic+protein+crystallization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells.</a> Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).</li>
<li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Nass, K. <a target="_blank" href="NULL">Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers</a>. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol bevat twee benaderingen om microkristallen te analyseren met als doel het analyseren van zeer kleine kristallen die in het verleden zouden zijn over het hoofd gezien. Kritieke stappen voor microkristalzuivering Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd met behulp van Bombyx mori CPV1 polyhedrine uitgedrukt in Sf9-cellen als model systeem. In vivo microkristallen tonen echter een grote variabiliteit in mechanische weerstand. Bijvoorb...

Het gebruik van röntgenkristallografie voor de bepaling van hoge resolutie structuren van biologische macromoleculen heeft de afgelopen twee decennia een constante progressie beleefd. De groeiende opname van röntgenkristallografie door niet-deskundige onderzoekers illustreert de democratisering van deze benadering op vele gebieden van de levenswetenschappen 1 . Historisch gezien zijn kristallen met afmetingen onder ~ 10 μm beschouwd als uitdagend, indien niet onbruikbaar, voor structuurbepaling. De toenemende beschikbaarheid van toegewijde microfocus bundellijnen voor synchrotron stralingsbronnen wereldwijd en technologische vooruitgang, zoals de ontwikkeling van gereedschappen om microkristallen te manipuleren, hebben veel van deze barrières verwijderd die het brede gebruik van röntgen microkristallografie hebben verbannen. Vooruitgang in seriële röntgen microkristallografie 2 , 3 en micro elektronen diffractie 4 haHet is gebleken dat het gebruik van micro- en nanokristallen voor het bepalen van de structuur niet alleen haalbaar is, maar ook soms voor het gebruik van grote kristallen 5 , 6 , 7 . Deze vooruitgang werd eerst toegepast op de studie van peptiden 8 en natuurlijke kristallen geproduceerd door insectenvirussen 9 , 10 . Ze worden nu gebruikt voor een breed scala van biologische macromoleculen, waaronder de moeilijkste systemen zoals membraanproteïnen en grote complexen 11 . Om de analyse van deze microkristallen te vergemakkelijken, zijn ze geanalyseerd in meso , in het bijzonder membraaneiwitten 12 en in microfluidica chips 13 . De beschikbaarheid van deze nieuwe microkristallografie methodologieën heeft de mogelijkheid geboden om in te gebruikenVivo kristallisatie als een nieuwe route voor structurele biologie 14 , 15 , 16 die een alternatief biedt voor klassieke in vitro kristallogenese. Helaas, zelfs wanneer in vivo kristallen kunnen worden geproduceerd, blijven verschillende obstakels zoals de afbraak of verlies van liganden tijdens de zuivering van cellen, moeilijkheid bij manipulatie en visualisatie van de kristallen bij de synchrotronbundel en vervelende röntgendiffractie-experimenten. Als alternatieve kristallen zijn ook direct in de cel geanalyseerd zonder enige zuiveringstap 17 , 18 , 19 . Een vergelijkende analyse suggereert dat dergelijke in cellulo- benaderingen efficiënter kunnen zijn dan de analyse van gezuiverde kristallen en levert data van hogere resolutie 20 op . Dit protocol is inGeneigd om onderzoekers nieuw te helpen bij microcrystallografie van eiwitten. Het biedt methodologieën die zich richten op steekproefbereiding en manipulatie voor röntgendiffractie-experimenten op een synchrotronbundel. Twee opties worden voorgesteld met behulp van geïsoleerde kristallen voor klassieke microkristallografie of kristalbevattende cellen gesorteerd door flowcytometrie voor celluloanalyse ( Figuur 1 ).

<table><tbody><tr><td>Sf9 cellen</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM insectenmedium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L celcultuurkolf</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schudende incubator voor insectencelcultuur</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buisjes</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge met slingeremmers voor 50 mL buisjes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator uitgerust met een 19 mm sonde</td><td>MSE Soniprep 150&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazend glas</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Influx celsorteerder&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Heavy atom schermen</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25 mazen bieden een groter oppervlak. Geïndiceerde mazen kunnen worden gekocht voor systematische studies.</td></tr><tr><td>Papieren wiek</td><td>Mitigen</td><td></td><td>De grootte van de papierwiek kan worden gevarieerd voor optimale stroming. Dit zal grotendeels afhangen van de aard van de kristallen en het gebruikte cryoprotectant.</td></tr><tr><td>Ethyleenglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 microfocus bundellijn</td><td>Australian Synchrotron</td><td></td><td>Een lijst van beschikbare microfocus bundellijnen is te vinden in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash;1806, doi:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; in cellulo</em&gt; diffractie

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

De komst van microfocus van hoge kwaliteit bij veel synchrotronfaciliteiten heeft de routineanalyse van kristallen kleiner dan 10 μm in hun grootste dimensie toegestaan, die een uitdaging vertegenwoordigde. We presenteren twee alternatieve workflows voor de structuurbepaling van eiwitmicrokristallen door röntgenkristallografie met een speciale focus op in vivo gekweekte kristallen. De microkristallen worden ofwel geëxtraheerd uit cellen door sonicatie en gezuiverd door differentiële centrifugatie, of geanalyseerd in cellulose na celsortering door stromingscytometrie van kristalbevattende cellen. Eventueel worden gezuiverde kristallen of kristalbevattende cellen geweekt in zware atoomoplossingen voor experimentele fase. Deze monsters worden vervolgens op diffra- tieve experimenten op soortgelijke wijze bereid door toepassing op een micromesh-ondersteuning en flashkoeling in vloeibare stikstof. We beschrijven en vergelijken serie-diffractie-experimenten van geïsoleerde microkristallen en kristal-Bevattende cellen met behulp van een microfocus synchrotron beamline om datasets te produceren die geschikt zijn voor fasering, modelbouw en verfijning. Deze werkstromen worden geïllustreerd met kristallen van het Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrine geproduceerd door infectie van insectencellen met een recombinant baculovirus. In deze casestudy is celluloanalyse efficiënter dan analyse van gezuiverde kristallen en levert een structuur in ~ 8 dagen van expressie tot verfijning.

Een overzicht van beide alternatieve methoden voor structuurbepaling met behulp van in vivo microkristallen wordt gepresenteerd ( Figuur 1 ). Polyhedra kan gemakkelijk worden gezuiverd door sonicatie en centrifugatie. Door hun dichtheid vormen ze een laag aan de onderzijde van de buis onder een laag afval die door pipettering kan worden verwijderd ( Figuur 3a en 3b ). Het monster wordt dan onderworpen a...

Een protocol wordt gepresenteerd voor röntgenkristallografie onder toepassing van eiwitmicrokristallen. Twee voorbeelden die in vivo- gegroeide microkristallen analyseren na zuivering of in cellulose worden vergeleken.

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Het algemene doel van dit protocol is om röntgenkristallografische methodologieën te introduceren die worden toegepast op microkristallen, en in het bijzonder op microkristallen die in cellen zijn geproduceerd en als in vivo kristallen worden beschouwd. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat het een eenvoudig en efficiënt proces biedt om microkristallen te produceren, te detecteren en te analyseren. Deze methode is erop gericht het gebruik van microkristallen te vergemakkelijken door gebruik te maken van kristallen die in levende cellen zijn gegroeid, waardoor complexe zuiveringsprocessen en Aprocox-sedatieproeven overbodig worden.In deze video richten we ons op de eenvoudige preparatie en manipulatie voor röntgendeflectie-experimenten bij een synchrotron-beamline. We laten de stappen zien die het meest verschillen van de klassieke kristallografie. In deze demonstratie maken we gebruik van kristallen van het vitale polyhedere eiwit die met succes zijn gekweekt, maar de methode kan ook worden toegepast op eiwitten die kristallen vormen in elke bacteriële, insecten-, zoogdier- of gistcel.Incubeer eerst 30 milliliters Sf9-cellen die het cypovirus polyhedron-eiwit overexpresseren gedurende drie dagen bij 27 °C op een roterend platform. Draag 500 microliters van de Sf9-celcultuur over naar een microcentrifugebuis met een steriele serologische pipet, waarbij u er zorg voor draagt dat de steriliteit van de hoofdcultuur behouden blijft door gebruik te maken van een klasse II biologische veiligheidskabinet en standaard aseptische technieken te volgen. Pipetteer vijf microliters cellen vanuit de microcentrifugebuis op een objectglas.Plaats vervolgens voorzichtig een glazen dekglas onder een hoek over het monster, waarbij één rand de druppel raakt, en laat het dekglas voorzichtig op de vloeistof zakken om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Maak daarna beelden van het preparaat met een omgekeerde microscoop. Onderzoek de cellen zorgvuldig, beginnend bij een 200-voudige vergroting en inzoomend tot de maximale vergroting bij het detecteren van een potentieel kristal.Letten op scherpe randen en veranderingen in de refractiviteit. Indien kristallen worden geïdentificeerd, moet de cultuur dagelijks worden onderzocht om de kristalgroei te monitoren door de voorgaande stappen te herhalen. Oogst Sf9-cellen door de cultuur over te brengen naar een centrifugebuis.Plaats de buis op ijs en ga zo snel mogelijk door naar de volgende stap. Pipetteer voor de isolatie van kristalbevattende cellen vier milliliter geïnfecteerde Sf9-cellen in een buis die geschikt is voor flowcytometrieanalyse. Bereid een tweede buis voor met een gelijk aantal Sf9-cellen uit een mock-geïnfecteerde cultuur als controle.Voeg vervolgens, vlak voor de flowcytometrische evaluatie, propidiumjodide toe aan beide monsters tot een eindconcentratie van 1 µg/mL. Pas nu de controlemonstercellen toe op een standaard flowcytometer die in staat is tot cel sortering op basis van FSC en SSC. Analyseer ten minste 20.000 events.Nadat dode cellen, celaggregaten en debris uit de analyse zijn verwijderd, wordt de FSC-SSC-plot gegenereerd. Analyseer vervolgens ten minste 20.000 events van de kristalbevattende sample. Vergelijk de FSC-SSC-plot met de controle en let op de verschijning van een aparte populatie die overeenkomt met de kristalbevattende cellen.Definieer de gates rond de celpopulatie die kristallen bevat, die gewoonlijk verschijnt bij een hogere SSC of FSC. Sorteer met behulp van deze gating ongeveer 150.000 tot 200.000 van de kristalbevattende cellen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die vooraf is gevuld met 50 microliters PBS-buffer. Beeld de gesorteerde monsters af met lichtmicroscopie zoals eerder beschreven om te bevestigen welke populatie geassocieerd is met de kristalbevattende cellen.In deze fase kunnen de cellen worden geïncubeerd met zware-atoomoplossingen als experimentele fasering vereist is. Deze aanpak volgt op de screening van diverse verbindingen en incubatietijden zoals beschreven in de tekst en in andere reviews. Bereid de hulpmiddelen voor het monteren van het monster voor door eerst een micro-mesh die op een pin is gemonteerd aan het uiteinde van een magnetische staaf te bevestigen.Plaats de wand zijwaarts in de inkeping van een dialyse-drijver. Pak vervolgens met een pincet een papieren lont op en vergrendel deze. Controleer dubbel of de opstelling volledig is voordat u verdergaat.Meng nu de cellen met een gelijk volume 0,4% trypaanblauw-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,2%. Pipetteer na het resuspenderen van de cellen 0,5 µL van de gesorteerde cellen op het micromesh. Nadat de cellen op het oppervlak van het micromesh zijn neergedaald, wordt het grootste deel van de overtollige vloeistof verwijderd door te blotten met een papieren lont. Als het micromesh niet voldoende is geblot, zullen de cellen zich op verschillende dieptes in de overtollige vloeistof bevinden, wat hun uitlijning met de röntgenbundel in de synchrotron zal bemoeilijken.Bovendien zal overtollige vloeistof de achtergrondruis van de röntgenverstrooiing verhogen. Als het micro-gaas te veel wordt gedroogd, wordt de vloeistof volledig verwijderd en zal het monster niet in de openingen van het rooster blijven zitten. Bij een optimale blotting blijft er slechts een dunne laag vloeistof op het micro-gaas achter, waardoor het monster wordt beschermd en in de openingen van het rooster wordt gedwongen.Sommige kristallen vereisen het gebruik van een cryoprotectant. In dit geval is dat niet nodig, maar de procedure zou hetzelfde zijn als bij het aanbrengen van het monster en het daaropvolgende drogen. Zorg ervoor dat er slechts een dunne vloeistoflaag overblijft.Koel het micromesh onmiddellijk snel af in vloeibare stikstof en breng het over naar een robot-puck voor transport naar een synchrotron microfocus-beamline. Vanwege de kleine afmetingen van de in vivo-kristallen moet diffractiegegevens worden verzameld op een microfocus-crystallografie-beamline. Monteer eerst het micromesh op de goniometer.Begin nu met het centreren van het micromesh ten opzichte van de straalpaden met behulp van de frontale en zijdelingse oriëntaties. Richt de uitlijning nauwkeurig bij terwijl het micromesh frontaal is geplaatst, door het midden van een van de horizontale banen van het micromesh uit te lijnen. Verzamel gegevens langs deze horizontale baan met slechts minimale heraanpassingen van de uitlijning.Zodra alle kristallen in de lane zijn getest, gaat u over naar de volgende lane en herhaalt u de uitlijningsprocedure. Zorg ervoor dat de lanes die zijn verwerkt duidelijk worden geïdentificeerd, zodat er geen kristallen worden overgeslagen of twee keer worden gefotografeerd, waarbij de kleurverandering van trypaanblauw als leidraad dient. Er wordt een overzicht gegeven van twee methoden voor structuurbepaling met behulp van in vivo microkristallen.De bovenste rij beschrijft de klassieke aanpak waarbij kristallen uit cellen worden gezuiverd, terwijl de onderste rij de in cellulo crystallografie-aanpak laat zien, waarbij de kristallen in de gastcellen blijven voor gegevensverzameling. Voor de in cellulo aanpak wordt het flowcytometrie-profiel van niet-geïnfecteerde cellen vergeleken met een profiel van kristalhoudende cellen; dit wordt gebruikt om te bepalen welke celpopulatie geselecteerd moet worden om kristalhoudende cellen van de andere cellen te scheiden. In dit voorbeeld hebben cellen die polyhedra bevatten een hogere zijwaartse verstrooiing dan niet-geïnfecteerde cellen.Cellen die zijn gekleurd met trypaanblauw kunnen eenvoudig worden gevisualiseerd met camera's die bij de meeste synchrotron-beamlines beschikbaar zijn. Hoewel gezuiverde kristallen vanwege hun geringe omvang arbeidsintensief zijn om te identificeren en uit te lijnen met de röntgenstraal, is het bij het verzamelen van gegevens het beste om in een rasterpatroon te werken. Dit minimaliseert de centreringsprocedures en voorkomt dat dezelfde cel of hetzelfde kristal twee keer wordt blootgesteld of dat cellen en kristallen worden gemist. Eenmaal beheerst, neemt deze workflow ongeveer een halve dag in beslag, van het oogsten van de kristalbevattende cellen tot de gegevensverzameling.Deze procedure is compatibel met heavy-atom soaks voor experimentele fasering. In het geval van het polyeder werd de normale structuur verkregen binnen acht dagen na de start van de eiwitexpressie. Vergeet niet dat werken met vloeibare stikstof extreem gevaarlijk kan zijn en dat er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tegen verstikking en brandwonden.

microcrystallography-of-protein-crystals-and-in-cellulo-diffraction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten. Het microfabricatieproces maakt het mogelijk om een semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan te integreren met elke moleculaire gewichtsafsnijd, tussen twee lagen van de chip.

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

Hier beschrijven we de procedures die in ons laboratorium zijn ontwikkeld voor het bereiden van poeders van kleine molecuulkristallen voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) -experimenten.

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.

On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Cryo-EM-kaarten met hoge resolutie van macromoleculen kunnen ook worden bereikt met behulp van 200 kV TEM-microscopen. Dit protocol toont de best practices voor het instellen van nauwkeurige optische uitlijningen, data-acquisitieschema's en selectie van beeldvormingsgebieden die allemaal essentieel zijn voor het succesvol verzamelen van datasets met hoge resolutie met behulp van een 200 kV TEM.

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige aanpak voor het screenen van eiwitkristallisatieomstandigheden en kristalgroei met behulp van een 96-well high-throughput dialyseplaat. Het gebruik van dialysatorbuizen voor de grootschalige groei van microkristallen wordt ook gedemonstreerd voor seriële kristallografie en MicroED-toepassingen.

High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

Leer röntgendiffractie van microkristallen in levende cellen zonder complexe zuivering. Deze methode vereenvoudigt kristallografie voor diverse eiwitten en biologische systemen.

Microkristallografie van eiwitkristallen en

Meer video's verkennen