Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen
14 juni 2017
Spiercellen (MSC's) met neurale potentieel bestaan in het beenmerg. Ons protocol verrijkt deze populatie van cellen via hypoxische preconditioning en wijst hen vervolgens op om volwassen Schwann cellen te worden.
Het algemene doel van deze celkweektechniek is om neurale voorlopercellen uit beenmerg te verrijken om hun differentiatie in functionele Schwann-cellen te vergemakkelijken. Deze methode lost een sleutelprobleem op in stamcel- en regeneratieve geneeskunde: hoe een beperkte bron van neurovoorlopers te gebruiken om gliacellen te genereren om te helpen bij posttraumatische axonale groei en remyelinisatie. Een voordeel van deze techniek is het gebruik van efficiënte kweekcondities om neurale celexpansie uit beenmerg-stromacellen te vergemakkelijken voor hun gebruik in autologe celtherapie.
Na twee dagen in kweek, verwijder 75%van het uitgeputte medium en de niet-aderente cellen en spoel de aderente cellen met drie 10 millimeter PBS-wasbeurten. Na de derde wasbeurt, vervang de PBS met 10 milliliter beenmerg stromacellen, of MSC, groeimedium en zet de kweek terug in de incubator. Zichtbare kolonies zouden moeten verschijnen op dag zes tot zeven.
Op dag 10, was de kweek in vers PBS en los de cellen op met 1,5 milliliter recombinant enzymatisch celdissociatiereagens. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, voeg drie milliliter MSC-groeimedium toe om de reactie te neutraliseren en verzamel de losgekomen cellen door centrifugatie. Resuspendeer het pellet in vijf milliliter vers MSC-groeimedium en zaai de cellen met een dichtheid van vier keer 10 tot de vierde cellen per vierkante centimeter in een nieuwe 10 centimeter weefselkweekplaat.
De cellen zouden binnen twee dagen na het overzetten 80 tot 90%confluency moeten bereiken. Voor hypoxische preconditionering, los eerst de ringklem en maak de blootgestelde delen schoon met 70%ethanol. Demonteer vervolgens de hypoxiekamer in componenten en plaats ze in een laminaire flowkap voor sterilisatie onder UV-licht gedurende 15 minuten.
Was vervolgens een 80 tot 90%confluente MSC-kweek met 10 milliliter PBS zoals zojuist gedemonstreerd en behandel de kweek met vers MSC-groeimedium aangevuld met 25 millimolair hepes. Plaats de behandelde kweek in de gereconstrueerde hypoxiekamer en draai de ringklem vast. Dicht de verbindingspunten van de kamer af om ervoor te zorgen dat er geen gaslekkage is en spoel een gasmengsel van 99%stikstof en 1%zuurstof in de kamer met een stromingssnelheid van 10 liter per minuut.
Na vijf minuten, plaats de kamer in de celkweekincubator gedurende 16 uur. De volgende ochtend, los de cellen op zoals zojuist gedemonstreerd en verzamel ze door centrifugatie. Resuspendeer het pellet in neurale voorlopermedium en zaai zes keer 10 tot de derde cellen per vierkante centimeter op laag-aderente 6 welplaten voor hun kweek bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende 12 dagen.
Aanzienlijke niet-aderente celsferen zouden moeten worden waargenomen op dag zes tot zeven. Met meer neurosferen in hypoxische geconditioneerde kweek dan die onder normoxie gedurende dag 10 tot 12. Op dag 12, gebruik een 10 milliliters pijp om de neurosferen over te brengen naar een 15 milliliters conische buis en verzamel de neurosferen door centrifugatie.
Resuspendeer de sferen in DMEM/F12 en plateer vijf tot 10 neurosferen per vierkante centimeter op poly-D-lysine laminine gecoate 6 welplaten in 1,5 milliliter gliale inductiemedium per wel. Bewaar de sfeercelkweek gedurende ten minste zeven dagen, ververs het medium elke drie dagen. Om de dorsale wortelganglia te oogsten, breng de eerste embryo over in een 10 centimeter kweekschaal met kamertemperatuur PBS onder een dissectiemicroscoop in de buikligging en voer microdissectietangen in langs beide zijden van de wervelkolom.
Gebruik doffe dissectie om het ruggenmerg van het omringende zachte weefsel te scheiden met behulp van forceps om het ruggenmerg langs de nekopening en staartpunt te excideren. Verwijder het resterende zachte weefsel van het bevrijde ruggenmerg tot alleen het ruggenmerg, zenuwwortels en aangehechte dorsale wortelganglion overblijven. Los de individuele dorsale wortelganglia los van hun verbindende zenuwwortels.
Gebruik vervolgens een pijppen uitgerust met een 1 milliliter pijptip om maximaal 100 dorsale wortelganglia over te brengen naar 1,5 milliliter microcentrifugebuis met PBS. Verzamel de ganglia door centrifugatie en resuspendeer de pellets in 200 microliter recombinant enzymatisch celdissociatiereagens per buis. Na 10 minuten bij 37 graden Celsius, centrifugeer de dorsale wortelganglia opnieuw met behulp van een 200 microliter pijptip om de pellets voorzichtig te tritureren in dorsale wortelganglion neuron onderhoudsmedium.
Zaai de dorsale wortelganglion cellen met vijf keer 10 tot de derde cellen per vierkante centimeter op poly-D-lysine laminine gecoate 6 welplaten in 1,5 milliliter dorsale wortelganglion neuron onderhoudsmedium per wel. Na twee dagen in kweek bij 37 graden Celsius en 5%CO2, was de cellen en zet de neuronale celkweek terug in de incubator in vers dorsale wortelganglion neuron zuiveringsmedium gedurende nog eens twee dagen. Na drie tot vier onderhouds- en zuiveringscycli, zouden de dorsale wortelganglion celkweek positief moeten testen op de neuronale marker Tuj-1 en negatief op de gliacellenmarker S100 beta.
Op dag zeven van de Schwann-cel-achtige celkweek, spoel de cellen in PBS gevolgd door dissociatie met 0,5 milliliter recombinant enzymatisch celdissociatiereagens per wel bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Resuspendeer het cellenpellet in co-kweekmedium en zaai de Schwann-cel-achtige cellen op de gezuiverde dorsale wortelganglion neuroncultuur met een dichtheid van een keer 10 tot de derde cellen per vierkante centimeter voor 14 dagen co-kweek bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Gezonde MSC's vertonen een taps toelopende morfologie in tegenstelling tot het vierhoekige uiterlijk van MSC's die gedurende een groot aantal passages zijn bewaard en hun multipotentie hebben verloren.
Geëxpandeerde MSC-kolonies zouden de expressie van MSC-markers moeten demonstreren, de afwezigheid van hematopoietische stamcelmarkers en de capaciteit voor differentiatie in adipogene, osteogene en chondrogene lijnen. Gezonde MSC-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol verrijkt beenmerg stromale cellen (MSC's) met neurologisch potentieel door middel van hypoxische voorconditioning, waardoor hun differentiatie naar volwassen Schwann-cellen wordt geleid. Deze methode gaat uitdagingen in de regeneratieve geneeskunde aan door gebruik te maken van een beperkte bron van neuroprogenitors voor de generatie van gliacellen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcellenbiologie
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Beenmerg bevat stromale cellen met neurologisch potentieel.
- Schwann-cellen zijn cruciaal voor axonaal herstel en remyelisaties.
- Efficiënte kweektechnieken zijn nodig voor de uitbreiding van neurale cellen.
- Dit onderzoek richt zich op het verbeteren van de opbrengst van neuroprogenitors uit MSC's.
Doel van het onderzoek
- Om neurale voorlopercellen uit beenmerg te verrijken.
- Om differentiatie naar functionele Schwann-cellen te bevorderen.
- Om autologe celtherapie voor zenuwblessures te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Hypoxische voorconditioning van MSC's.
- Celcultuurtechnieken om neurale differentiatie te bevorderen.
- Protocollen voor mediumvervanging en spoelen.
- Observatie van kolonievorming over een week.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verrijking van neurale voorlopercellen uit MSC's.
- Zichtbare kolonies van Schwann-cellen tegen dag zes tot zeven.
- Aangetoond potentieel voor toepassingen in autologe celtherapie.
- Belangrijke kwesties in posttraumatische zenuwherstel aangepakt.
Conclusies
- Het protocol verbetert effectief de opbrengst van Schwann-cellen.
- Het biedt een haalbare methode voor het gebruik van MSC's in regeneratieve therapieën.
- Toekomstige toepassingen kunnen de resultaten bij zenuwblessurebehandelingen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables the generation of mature Schwann cells from marrow stromal cells, addressing the limited availability of neural progenitors for autologous cell therapy in peripheral nerve injury. By enriching neuroprogenitors through hypoxic preconditioning, the approach supports predictive confidence in glial cell production for remyelination strategies. It provides a scalable, reproducible system for preclinical modeling of demyelinating diseases and spinal cord injury repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural progenitor commitment pathways from mesenchymal sources.
- Operational Value: Provides a defined, reproducible system to validate glial differentiation potential.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating hypoxia as a preconditioning variable for neurogenic enrichment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates Schwann cell-like cells with quantifiable S100β/p75 expression for phenotypic screening.
- Operational Value: Establishes a standardized co-culture assay with dorsal root ganglion neurons to assess myelination competence.
- Operational Value: Enables scalable neurosphere production for high-throughput progenitor expansion assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Produces fate-committed Schwann cells that form myelin segments, validating translational relevance.
- Operational Value: Supports preclinical continuity from progenitor expansion to functional myelination assays.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions for autologous cell therapies in demyelinating indications.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling progenitor enrichment, differentiation, and functional validation for glial cell therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on hypoxic preconditioning as a modulator of neural progenitor yield from MSCs.
- Screening: Delivers assay-ready Schwann cell-like cells with standardized glial marker expression for compound or condition screening.
- Analytics: Provides quantitative readouts via S100β/p75 co-expression and myelin segment formation to compare differentiation efficiency.
- Translational Research: Connects progenitor expansion to preclinical validation through neuron co-culture and myelination assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating clinical-grade Schwann cells from autologous MSC sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in glial cell generation by reducing variability in neural progenitor enrichment.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized hypoxic preconditioning and neurosphere formation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of myelination capacity in vitro.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of Schwann cell-based therapies for peripheral and central nervous system indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, hypoxic chamber operation, and neural differentiation techniques.
- Depends on specialized instrumentation including hypoxia chambers, low-attachment plates, and glial induction media components.
- Necessitates standardization across teams for consistent neurosphere size, co-culture timing, and marker assessment.
- Involves adaptation considerations when translating from rodent to human MSC sources and scaling for clinical use.
- Limited by the dependency on dorsal root ganglion neurons for final maturation, which may constrain throughput in industrial settings.
