Name: Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer een methode voor het verwerken van mammaweefsel in toto preparaten om laesies microscopisch te identificeren. Deze techniek verbetert de nauwkeurigheid van histopathologische evaluaties in reproductief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zouden Pam Ovwigho, Tenette Jones en Natasha Clayton, NIEHS, willen erkennen voor hun technische expertise en ondersteuning bij dit project.

Alle dierengebruik en procedures voor deze studie werden goedgekeurd door het NIEHS Laboratory Animal Zorg- en Gebruikskomitee en in een Vereniging voor Beoordeling en Akkreditering van Laboratorium dierenzorg geaccrediteerde faciliteit. 1. Mammary Whole Mount Preparation 2 , 3 , 6 , 7 <ol><li> Verwijder de ingewanden van de ingewanden van de ene kant van een niet-zwangere CD-1 vrouwelijke muis, zoals beschreven in referentie 3 , en plaats ze op een elektrostatisch geladen dia. </li><li> Bedek de klier met een non-stick papier of een film en plaats een andere glijbaan bovenop. Voeg druk ( dwz watergewichten) aan de glijbaan toe om de klier uit te spreiden zodat de klier aan de glijbaan vasthoudt voor fixatie. </li><li> Onderdompel de dia&#39;s in fixatief ( bijv. 100% ethanol, chloroform en ijsazijn in een verhouding van 6: 3: 1)Overnacht bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de klieren uit de fixatie en wrijf 15-30 minuten in ethanol. Na de 30 minuten wassen, veranderen geleidelijk aan water door 1/3 van de ethanol uit te gieten en water toe te voegen. Laat de was elke keer ongeveer 5 minuten zitten en herhaal 3 keer met water. </li><li> Stain ( bijv. Carmine alum oplossing) gedurende 12-24 uur. OPMERKING: Dikkere weefsels hebben langere vlektijden nodig. Zie referentie 3 voor kleuring details. </li><li> Giet de vlek na de toegestane tijd af en doe de dia&#39;s 30 minuten in water af. De weefsels uitdrogen door de glijbanen in 70% ethanol gedurende 15 minuten te wassen, gevolgd door een 15 minuten wassen in 95% ethanol en een laatste was in 100% ethanol gedurende 20 minuten. </li><li> Verwijder het vet uit de weefsels door ze gedurende minstens 24 uur in xyleen te plaatsen, of langer als het weefsel dik is, zodat eventuele ondoorzichtige of witte gebieden verwijderd worden. </li><li> Verwijder het weefsel uit het xyleen en voeg snel m toeOnstuimig medium naar de glijbaan om uitdroging van het weefsel te vermijden; Plaats een deklap bovenaan. Laat de glijbaan minstens 48 uur drogen. </li><li> Evalueer het gehele weefsel voor abnormaliteiten, zoals beschreven in 2 . OPMERKING: Wanneer er sprake is van laesies in gehele mounts en er is een sectie nodig om hun identiteit vast te stellen, dienen de volgende stappen te worden gevolgd. </li></ol> 2. Verwijdering van de hele mammop van een mammoet uit een glazen glijbaan <ol><li> Verwijder de deksel en het montagemedium door de volledige diafragma van de membraan in een glazen vlekpotje te vullen die met xyleen overnacht wordt gevuld. OPMERKING: Dikkere weefsels en glijbanen met overmatige montageoplossing kunnen extra tijd nodig hebben voor het verwijderen van de deklaag. </li><li> Na de eerste nacht overnacht, plaats de glijbanen in verse xyleen en week gedurende 6 uur. Voer een laatste blik in verse xyleen overnacht. OPMERKING: De deklip zal na de laatste week gemakkelijk uit de glijbaan vallen. </li><li> Met agGeliefde hand, houd de glijbaan en verwijder de deksel met een paar tangjes zorgvuldig om ervoor te zorgen dat het in een stuk verwijderd wordt. OPMERKING: Als het dekglas nog steeds aan de glazen glijbaan is bevestigd, moet u doordrenken totdat het met weinig moeite verwijderd kan worden. </li><li> Zodra de deklaag is verwijderd, houd de dia loodrecht op een glazen Petri-schotel die xyleen bevat, neem een ​​scherp, wegwerp scheermesje voorzichtig en schuif het mes in een enkele beweging in de glijbaan. </li><li> Zodra het weefsel verwijderd is, onderdompel u het mammary pad snel in een xyleen-gevulde Petri-schotel om ervoor te zorgen dat het weefsel niet droogt. OPMERKING: Wees voorzichtig met deze stap. De gehele berg is dun (≤ 1 mm), en breekbaar van xyleenverwerking. Elke indrukken of tranen kunnen de morfologie van het weefsel veranderen en latere evaluaties compliceren. </li></ol> 3. Weefselverwerking <ol><li> Zodra het weefsel in de Petri-schotel zit, zorg het voorzichtigNaar een gelabelde histologiecassette. Pak de rand van het vetpaneel met stompe, gekartelde tangjes om de weefselschade te minimaliseren. <ol><li> Met behulp van een scheermes, snijd grotere weefsels (vooral voor ratten) in de helft en plaats ze in twee losse gelabelde cassettes die de weefselgrootte opvangen. Plaats het weefsel rechtsom (gebruik het lymfeknoop als referentie). Zorg ervoor dat het weefsel zonder lymfeklieren in dezelfde, rechtopstaande positie wordt gehouden als het overgebracht wordt naar de cassette. </li></ol></li><li> Plaats de cassette in een container xylene gedurende maximaal 2 uur voordat u deze in de weefselprocessor plaatst. OPMERKING: Het is aan te raden om de monsters te verwerken op dezelfde dag dat ze in de cassette worden geplaatst. Uitgebreide inslag in xyleen is niet getest. </li><li> Laad het maximale aantal cassettes met de hand in de weefselprocessor. </li><li> Voorafgaand aan het begin, programma alle reagentia die voor dit proces worden gebruikt in de reagentielijst van de processor. Om de beweging te automatiserenVan een station naar de volgende, gebruik de menuopties en maak een nieuw programma. Als alle stappen zijn voltooid, selecteert u &#39;OK&#39; om door te gaan. OPMERKING: De processor zorgt ervoor dat alle stationsgegevens worden herzien voordat u begint. <ol><li> Automatiseer de processor om de cassettes in xyleen gedurende 30 minuten bij 37 ° C te slikken, gevolgd door een tweede week in verse xyleen onder dezelfde omstandigheden. Automatiseer de processor om de cassettes van de xyleenoplossing te verwijderen en de weefsels naar het volgende station over te brengen met een 1: 1 xyleen: gesmolten paraffine mengsel, ingesteld op 60 ° C gedurende 30 minuten. OPMERKING: De processor zal dan de cassettes overbrengen naar een nieuwe kamer die gesmolten paraffine gedurende 1 uur bevat. Na 1 uur worden de monsters automatisch overgebracht naar een nieuwe kamer van vers gesmolten paraffine en worden deze nog 2 uur verwerkt. Beide stappen worden uitgevoerd bij 60 ° C. </li><li> De processor overbrengt dan de cassettes naar het station met gesmolten paraFf gedurende 1 uur. Vervolgens worden de monsters automatisch overgebracht naar het eindstation van vers gesmolten paraffine en nog 2 uur bewerkt. Beide stappen worden uitgevoerd bij 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Inbedding van de Verwerkte Mammary Tissue <ol><li> Plaats de cassettes in de 58 ° C paraffine houder van het embedding station tot u klaar bent om het weefsel in de vorm te plaatsen. </li><li> Verwijder de cassettehoes om de beste vormgrootte voor het weefsel te bepalen. Zorg ervoor dat de vorm groot genoeg is om het weefsel op te vangen, en laat genoeg ruimte om een ​​weefselvrije grens van paraffine rond de omtrek te hebben. </li><li> Voeg 3-4 mm gesmolten paraffine toe aan de matrijs en geef het gehele oppervlakteschuim van de mammier aan, die naast de bodem van de glazen glijbaan en de bodem van de cassette naar boven in de vorm stond. </li><li> Breng de vorm over op een koelplaat en pas het weefsel zo snel mogelijk aan, zodat het evenwijdig aan de vorm b isottom. OPMERKING: Zodra de paraffine verhardt, zal het weefsel op zijn plaats worden beveiligd. </li><li> Plaats de gelabelde, onderste helft van de cassette bovenop de vorm met behulp van warme tang. Druk stevig met behulp van de tang. </li><li> Voeg extra gesmolten paraffine in de vorm in een continue beweging om de hele cassette te bedekken. Verplaats de mal van de warme plaat naar een koude plaat om het blok te verharden. </li><li> Verwijder het blok uit de vorm wanneer de paraffine helemaal stollt om scheuren of luchtbellen te vermijden. OPMERKING: Bewaar de paraffine-ingebedde weefsels bij kamertemperatuur tot aan de afwerking. </li></ol> 5. Sectie van de paraffine-embedded Mammary Tissue op de Microtome <ol><li> Voorafsnijden van de paraffineblokken bij -20 ° C gedurende 1 uur. OPMERKING: Er zal een restmonteringsmedium in het blok zijn van het originele deklaagde full-mount weefsel. Het blokkeren van het blok verbetert de doorsnede en het linten van het blok. </li><li> Bereid de microfoon voorRotome door het waterbad aan te zetten, met vers gedestilleerd water en de temperatuur aan te passen op 42-45 ° C. Leg een fris, laag profielblad op de microtome en zet het op 4 μm. OPMERKING: Sectiekwaliteit wordt verminderd met secties die dikker zijn dan 4 μm door aanwezigheid van restmonteringsmedium in het weefsel. </li><li> Steek het blok in de microtome met de wax naar het mes en in lijn met het verticale vlak. Vocht dan een gedeelte van de gaasblok in koud water en leg hem enkele minuten op het blok. </li><li> Deel het blok door het grote wiel in de klok mee te draaien, in combinatie met het grove geavanceerde wiel, tot een volledig gezicht of representatief blokblok is verkregen. OPMERKING: Het weefsel is dun door het verwijderen van xyleen tijdens het gehele proces. Breng het blok goed uit met het mes om het aantal snijpunten te minimaliseren bij het verkrijgen van een representatieve sectie. </li><li> Kies het lintSnij het handje voorzichtig in het warme (45 ° C) waterbad (vooraf voorbereid), laat het weefsel rimpels doordringen en zorgvuldig een gedeelte op een schone glijbaan glijden. </li><li> Plaats de glijbanen rechtop op een droogrek om overtollig water te verwijderen. Incubeer de glijbanen in een licht geopende glijbaan bij nacht bij 37 ° C. </li></ol> 6. Geautomatiseerde en handmatige H &amp; E-kleuring van gesneden weefsels <ol><li> Vóór het vullen worden de slides bij kamertemperatuur opgeslagen. </li><li> Voor geautomatiseerde kleuring selecteert u H &amp; E uit de vlekopties in het hoofdmenu. Deparaffinisatie, vlekken en uitdroging worden allemaal voltooid op de geautomatiseerde vlekplaat. Gebruik montagemedium en een deklaag om de secties op te bergen. </li><li> Als u de dia&#39;s handmatig kent, verdeelt u de secties door de dia&#39;s in xyleen gedurende 5 minuten te dompelen. Vervoer naar frisse xyleen en herhaal gedurende 5 minuten. </li><li> Rehydrateer de glijbanen door het dompelen van thTwee keer in 100% ethanol gedurende 3 minuten elk, gevolgd door twee herhalingen in verse 95% ethanol en twee aparte wasjes in 1X wasbuffer bij 5 minuten elk. </li><li> Spoel de glijbanen af ​​in gedistilleerd water. </li><li> Voeg de dia&#39;s toe aan de hematoxyline gedurende 1-2 minuten. Verwijder de glijbanen en spoel ze 5 minuten met rioolwater. OPMERKING: Filter hematoxyline voorafgaand aan elk gebruik. </li><li> Plaats de glijbanen in 1% ijsazijn gedurende 30 s om de kleurdifferentiatie te bevorderen, en spoel daarna met leidingwater 1 minuut. </li><li> Voeg dia&#39;s toe aan 1X PBS gedurende 30 s tot 1 min. Om de weefselsecties te blauwen, gevolgd door een 5 min spoeling in kraanwater en vervolgens in 95% alcohol gedurende 15 - 20 s. </li><li> Counterstain met eosinoplossing gedurende 30 s tot 1 min. Vervolgens de slides uitdrogen tweemaal in verse 95% ethanol, gevolgd door twee verse herhalingen in 100% ethanol. Doe elke was gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de glijbanen in xyleen, met twee veranderingen in xyleen gedurende 5 minuten elk. </li><li> CoverslipDe weefsel sectie met montage medium en droog platte overnacht bij kamertemperatuur. </li></ol>

<ol><li>Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+exposures+and+mammary+gland+development%3A+State+of+the+science%2C+public+health%2C+implications%2C+and+research+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations.</a> Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).</li>
<li>Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+via+Nurture%3A+Effect+of+Diet+on+Health%2C+Obesity%2C+and+Safety+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment.</a> Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).</li>
<li>Stanko, J. P., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/55789/quantifying-branching-density-rat-mammary-gland-whole-mounts-using">Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method.</a> J Vis Exp. , In press (2017).</li>
<li>Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf">http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf</a> (2011).</li>
<li>Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf">http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf</a> (2011).</li>
<li>Mammary gland whole mount processing and staining. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm">http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm</a> (2016).</li>
<li>Whole mount preparations. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149">http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149</a> (2016).</li>
<li>Filgo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+evaluation+in+juvenile+toxicity+studies%3A+Temporal+developmental+patterns+in+the+male+and+female+Harlan+Sprague+Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+high-quality+hematoxylin+and+eosin-stained+sections+from+rodent+mammary+gland+whole+mounts+for+histopathologic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+preparation+of+tissue+sections+from+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Path%22%5BJournal%5D)">An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland.</a> Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).</li>
<li>Munoz-de-Toro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+exposure+to+bisphenol-A+alters+peripubertal+mammary+gland+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice.</a> Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).</li>
<li>Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+exposure+to+the+phytoestrogen+genistein+alters+mammary+gland+growth+and+developmental+programming+of+hormone+receptor+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels.</a> Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).</li>
<li>Nikaido, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+maternal+xenotestrogen+exposure+on+development+of+the+reproductive+tract+and+mammary+gland+in+female+CD-1+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring.</a> Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen om te verklaren in verband met het onderzoek, auteurschap en / of publicatie van dit artikel.

De volledige membraan van de borstklier is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de normale ontwikkeling van de borstvoeding en morfologische veranderingen te illustreren die kunnen optreden en voortzetten na blootstelling aan chemicaliën, waaronder endocriene verstoringen. Wanneer een hele berg- en H &amp; E-sectie van hetzelfde dier samen worden beoordeeld, kunnen ze een nauwkeurige visuele snapshot van vroege veranderingen verschaffen, die in een ziekere toestand kunnen komen. <p class="jove_content"...

De mammary whole mountis is een nuttige en goedkope methode geïmplementeerd in veel ratten- en muisstudies om zowel normale als chemisch geïnduceerde, abnormale ontwikkeling te begrijpen. In het algemeen zal een membraan die op verschillende stadia wordt verzameld tijdens het ontwikkelen van knaagdieren (dat wil zeggen adolescentie, puberteit, midden- tot late-zwangerschap en invasiefase) morfologische veranderingen in weefsel- en cellulaire architectuur beïnvloeden, beïnvloed door paracrine, endocriene en autocrine factoren 1 . In de verouderende rat worden de epitheliale en stromale delen van de klier steeds dichter, waardoor de morfologische parameters van meetinstrumenten moeilijk in een gehele berging moeilijk zijn. Zo is het gebruikelijk om een ​​klier te verzamelen voor histologische evaluatie om veranderingen op microscopisch niveau te identificeren. Beide processen zijn vooral nuttig in studies waarbij chemische blootstelling (dat wil zeggen milieu- of farmaceutisch) of de morfologische veranderingen die vergezeld gaan van genetische alterna- tuuraties. Technieken en mogelijkheden voor het gebruik van de borstklier bij risico-evaluatie blijven evolueren. Terwijl de volledige montage voorbereiding routine en gestandaardiseerd is, blijven wijzigingen in sectie 2 , 3 . Vele onderzoeksgroepen met verschillende achtergronden (dwz, universiteiten, overheid en bedrijfsleven) hebben coronale / langsdoorsneden van borstweefsel als voorkeursmethode ingericht, terwijl sommige laboratoria nog kopse gedeeltes heeft door de huid 4. De laatste methode resulteert in een buitensporige weergave van de epidermis (huid), in plaats van het weefsel van belang: het membraanepitheel 2 . Coronale of longitudinale secties zijn nuttiger om het normale weefsel 5 te karakteriseren en de detectie van abnormaliteiten en letsels sterk te verbeteren door het verhoogde oppervlak en het aantal aanwezige structuren. Over het algemeen maakt dit de hele maGeen geschikte methode voor de vergelijkende histopathologische beoordeling van de borstklier 1 , 2 . Of het nu gaat met behulp van een muis of een rat, retrieval, en het behoud van de 4 e en 5 e liesklieren wordt ten zeerste aanbevolen voor de vergelijking van het geheel te monteren op een contralaterale H &amp; E sectie. Bij gebruik in combinatie, geven de H &amp; E sectie en de volledige mount een nauwkeurig overzicht van de cellulaire en morfologische veranderingen die door blootstelling aan het milieu worden veroorzaakt. Dit is vooral waar bij bepaalde knaagdierstammen waarin het model een lage vatbaarheid heeft voor tumorvorming of een tumor niet grof zichtbaar is. In sommige gevallen kan het verkrijgen van het benodigde weefsel niet altijd mogelijk zijn met beide technieken ( dwz onvoldoende weefselhoeveelheid, middelen of onverwachte experimentele resultaten). In ons geval werden abnormaliteiten waargenomen in de volledige berghok, terwijl histopathoLogische bevindingen in de contralaterale H &amp; E klier waren meestal normaal. De overweldigende discrepantie tussen de contralaterale klieren leidde ons tot een economische en efficiënte procedure om de abnormaliteiten in de gehele mounts te identificeren. Met behulp van een gewijzigde verwerkings- en embedingsprocedure werden hoogwaardige H &amp; E-gekleurde secties bereid uit paraffine-ingebedde gehele montages. We beschouwen dit protocol als een krachtig detectiemiddel voor chemische blootstellingseffecten, waardoor inter-lab vergelijkingen worden verbeterd.

<table><tbody><tr><td>Xyleen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>montage media voor coverslips van gehele preparaten en H&amp;E secties</td></tr><tr><td>Leica geautomatiseerde processor</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S automatisch microtoom</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscoopglaasjes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>elektrostatisch geladen</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>coverslips</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES automatische glasjeskleuring</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>vloeibaar kleefmiddel; gebruikt in waterbad bij het doorsnijden</td></tr><tr><td>Gemodificeerd Harris Hematoxyline 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (onderdeel van Thermo Scientific)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosine</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumcarbonaat</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>IJsazijn</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>nodig voor Carnoy's fixeermiddel</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td><td>nodig voor Carnoy's fixeermiddel</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>nodig voor Carnoy's fixeermiddel en het wassen van glasjes</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumkaliumsulfaat dodecahydraat, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Automatiseringswasbuffer, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

sectie mammary gland whole mounts voor lesion identificatie

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

De normale ontwikkeling van de borstklier kan worden veranderd door blootstelling aan milieuspecifieke stoffen en farmaceutische producten, overmatige blootstelling aan hormonen en genetische veranderingen. Mammary gland complete mounts zijn een goedkope methode om de voortgang van morfologische veranderingen vast te stellen die na blootstelling kunnen ontstaan. Echter, in het latere leven, wanneer abnormaliteiten meer geneigd zijn om te ontwikkelen, kan alleen vertrouwen op deze methode niet altijd voldoende informatie verschaffen om een ​​goede diagnose van de abnormaliteit te maken. Historisch, in chemische test richtlijnen studies, wordt een enkele mammierklier bij necropsy verwijderd en bereid als een hematoxyline en eosine (H &amp; E) -verfde sectie. De incorporation van contralaterale mammary full-mount collectie en analyse vermindert de kans op een valse negatieve beoordeling. Evaluatie van de gehele berg wordt beperkt door de aanwezigheid van één of twee hele borstklippen op een dia, en in sommige gevallen zijn de abnormaliteiten waargenomen in de gehele berg, geenT uniform vertegenwoordigd in de H &amp; E sectie. Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een protocol voor het omzetten van de gehele membraan in de mantel naar H &amp; E-gekleurde secties, zodat letsels die anders gemist of moeilijk te diagnosticeren kunnen worden geïdentificeerd. Hier worden we een methode beschreven om een ​​hoogwaardige, paraffine-ingebedde H &amp; E-sectie van een membraan te produceren die oorspronkelijk als een hele berg werd voorbereid. In vergelijking met een weefsel dat opzettelijk was voorbereid voor H &amp; E sectie, vereist de hele berg extra voorbereiding op het verwijderen en verwerken van weefsels. Deze methode wordt echter beschouwd als goedkoop, aangezien het gebruikelijke laboratoriumreagentia en kleine extra tijd nodig heeft. Als resultaat kan deze methode onschatbare informatie verstrekken over hoe chemische en milieublootstelling de normale ontwikkeling van de borst verandert, evenals veranderingen die optreden als gevolg van genetische wijzigingen weergeven.

Deze methode is effectief om te helpen bij diagnoses die anders zouden zijn gemist als de originele contralaterale H &amp; E sectie van het mammary pad geen histologische veranderingen vertoonde. Het resultaat is echter alleen nuttig als u tijdens de eerste voorbereiding van de volledige berging zorgvuldig gebruikt, evenals tijdens de bereiding van het weefsel voor de histologische evaluatie. Paraffine inbedding zorgt voor bescherming en zal helpen om het weefsel te behouden voor toekoms...

We ontwikkelden een methode om succesvol te verwijderen, verwerken, delen en vlek voor histopathologische evaluatie, mammariumweefsel dat oorspronkelijk op glijbanen was vastgezet als gehele mounts. Deze methode kan de verzameling en evaluatie van de hele membraan van de borstklier bevorderen in onderzoeken voor reproductieve en ontwikkelingstest.

Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Het algemene doel van deze procedure is het maken van hoogwaardige gekleurde coupes van volledig gemonteerd borstweefsel van muizen voor de identificatie van laesies op microscopisch niveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de evaluatie van de melkklier, zoals de histopathologische identificatie van laesietypen die macroscopisch zijn vastgesteld in volledige montages van de melkklier. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de kans vergroot om laesies te identificeren die in de melkklieren aanwezig kunnen zijn wanneer gebruik wordt gemaakt van volledig gemonteerde weefsels.Het idee voor deze methode ontstond toen we whole mount-fenotypes vergeleken met histopathologische rapporten van contralaterale klieren van dezelfde dieren, die waren gefixeerd in formaline en gekleurd met H&amp;E. We stelden een verschil in diagnoses vast, waarbij meer laesies zichtbaar waren in de whole mounts. Een visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, aangezien de stappen voor het verwijderen en inbedden van de whole mount cruciaal zijn voor het succes van deze procedure.De klier is fragiel vanwege de dunne, brokkelige aard ervan. Nadat de gehele preparaten van geheugenmonsters zijn klaargemaakt en het weefsel op abnormaliteiten is geanalyseerd volgens het tekstprotocol, worden de dekglasjes en het montage medium verwijderd door de coupes onder te dompelen in een glazen kleurpot gevuld met xyleen. Incubeer dit gedurende één nacht of langer.Breng de objectglazen over naar vers xyleen en laat de monsters zes uur weken. Breng de monsters vervolgens opnieuw over naar vers xyleen en laat ze een nacht weken. Houd daarna het objectglas met een gehandschoende hand vast en gebruik een pincet om het dekglas voorzichtig in één stuk te verwijderen.De mate van gemak bij het verwijderen van het dekglas kan variëren, afhankelijk van de dikte van het insluitmiddel en de tijd die is verstreken sinds het monster volledig is gedekt. Daarom is het essentieel dat de preparaatglasplaat in xyleen blijft totdat het dekglas gemakkelijk loslaat. Zodra het dekglas is verwijderd, gebruikt u een scherp wegwerpscheermesje om het monster te verwijderen door het mesje in één vloeiende beweging over de glasplaat te schuiven.Dompel het geheugenkussen vervolgens snel onder in een glazen petrischaal gevuld met xyleen om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt aan de lucht. Gebruik een scheermes om grotere weefsels doormidden te snijden. Om weefselschade te minimaliseren, gebruikt u stompneuzige pincetten met gekartelde punten om de rand van het vetkussen vast te pakken en plaatst u de helften met de bovenkant naar boven in twee aparte, gelabelde cassettes die geschikt zijn voor de weefselgrootte.Plaats de cassette tot twee uur lang in een bak met xyleen voordat u deze in de weefselprocessor plaatst. Laad vervolgens handmatig het maximale aantal cassettes in de weefselprocessor. Programmeer de processor voor weefselverwerking voordat u begint.Om de procedure te automatiseren, selecteert u het station, de temperatuur en zet u het vacuüm aan. Stel de processor zo in dat de cassettes 30 minuten in xyleen worden geweekt bij 37 graden celsius, gevolgd door een tweede weken in vers xyleen onder dezelfde omstandigheden. Automatiseer vervolgens de processor om de cassettes uit de xyleenoplossing te halen en de weefsels over te brengen naar een kamer in de processor die een mengsel van xyleen en gesmolten paraffine in een verhouding van één-op-één bevat, ingesteld op 60 graden celsius voor 30 minuten.Wanneer alle stappen zijn voltooid, selecteer oké of start om door te gaan. Plaats de cassettes in het opvangreservoir van een paraffinebad van 58 °C tot ze in de mal geplaatst kunnen worden. Verwijder de cassettedeksels om de beste malgrootte voor de weefsels te bepalen.Voeg drie tot vier millimeter gesmolten paraffine vanuit de tuit toe aan de mal en oriënteer het weefsel in de gesmolten paraffine zodanig dat het oppervlak van de volledige borstmontage, dat grenst aan de onderkant van de glazen objectglas en de onderkant van de cassette, naar boven is gericht in de mal. Plaats de mal op een koelplaat en pas het weefsel indien nodig snel aan zodat het parallel aan de bodem van de mal ligt. Plaats met een pincet de gelabelde cassette stevig bovenop de mal.Giet in een continue beweging extra gesmolten paraffine in de mal om de gehele cassette te bedekken. Verplaats de mal van de warmteplaat naar een koudeplaat om fixatie in de exacte positie te bevorderen die voor het snijden is gekozen. Wanneer het paraffineblok volledig is gestold, scheidt u het blok van de mal.Bewaar het bij kamertemperatuur tot het moment van doorsnijden. Incubeer de paraffineblokjes vóór het doorsnijden gedurende één uur bij -20 °C. Bereid vervolgens de microtoom voor door het waterbad met vers gedestilleerd water in te schakelen en de temperatuur in te stellen op 42 tot 45 °C.Plaats vervolgens een nieuw laagprofielmes in de microtoom en stel deze in op vier micrometer. Plaats het blok in de microtoom met de was naar het mes gericht en uitgelijnd met het verticale vlak. Maak daarna een gedeelte van een gaasje nat in koud water en plaats dit enkele minuten op het blok.Snijd het blok door het grote wiel met een rechtsomgaande beweging te draaien in combinatie met het grove instelwiel totdat een volledig vlak of een representatieve sectie van het blok is verkregen. Breng de weefselcoupe vervolgens handmatig over naar een warm waterbad voordat deze met een schone objectglas wordt opgepikt. Plaats de objectglazen op een droogrek om overtollig water te verwijderen.Bewaar de weefselcoupes vervolgens gedurende de nacht bij 37 graden celsius. Nadat de objectglazen uit de incubator van 37 graden celsius zijn gehaald, bewaart u ze bij kamertemperatuur tot ze klaar zijn voor kleuring. Selecteer bij geautomatiseerde kleuring H en E uit de kleuringsopties in het hoofdmenu om de objectglazen te kleuren.Deparaffinering, kleuring en dehydratatie worden volledig uitgevoerd in de automatische kleurmachine. Gebruik emulsie en een dekglas om de coupes te monteren. Om de ideale dikte van het borstweefsel te bepalen, werden coupes van vier micrometer en zes micrometer voorbereid.De coupes van vier micrometer gaven optimale resultaten, waarbij epitheliale en stromale gebieden en de overeenkomstige celtypen gemakkelijk van elkaar te onderscheiden waren. Deze figuren tonen histologische coupes van normale klieren. Beide klieren vertonen ductale structuren omringd door een robuuste en homogene, adipocytrijke populatie.Elke afvoeringsgang is bekleed met een enkele laag eenvoudige kubische epitheelcellen en wordt ondersteund door een tweede laag basale cellen. De contralaterale hele mounts bevatten een gebied met verhoogde opaciteit die de afvoeringsgangen van de melkklieren betrof. Het was echter onduidelijk of deze opaciteit het gevolg was van een hyperplastische, inflammatoire of neoplastische alteratie.Contralaterale hele preparaten worden hier getoond. Deze secties werden gediagnosticeerd als perivasculaire ontsteking vanwege het verhoogde aantal lymfocyten rondom een groot bloedvat in de sectie van de melkklieren. In deze monsters bleef de lobulaire architectuur van de melkklier behouden, maar was deze vergroot door een toename in aantal en grootte van normale alveoli en ducten, passend bij lobulair alveolair hyperplasie.De vergrote lobuli bevatten een verhoogd aantal alveoli en gangen die bekleed waren met goed gedifferentieerde, vaak gevacuoleerde epitheelcellen die lumina vormden die eiwitrijk vocht bevatten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het weefsel fragiel is door het xyleen en gemakkelijk kan breken, waardoor uw monster verloren gaat. Hoogwaardige foto's van hele preparaten met een flatbedscanner worden aanbevolen voordat u deze methode probeert.Dit is een kans voor het vakgebied van de toxicologische pathologie om richting whole mount-evaluatie voor chemische screening te bewegen. Wanneer er op dat niveau laesies worden geïdentificeerd, kunnen er nu hoogwaardige coupes worden gemaakt voor histopathologische diagnostiek. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u mammary whole mounts verwijdert, inbesteekt en coupes maakt voor de identificatie van laesies.Vergeet niet dat er bij het werken met xyleen voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van laboratoriumjassen en handschoenen, en dat het werk onder een afzuigkap moet plaatsvinden.

sectioning-mammary-gland-whole-mounts-for-lesion-identification

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Ons protocol wordt beschreven hoe u de rat buik borstklier ontleden en hoe de borstklier hele mounts voor te bereiden. Het beschrijft ook hoe borstklier morfologie met behulp van drie eindpunten (aantal terminale einde knoppen, epitheliale rek en differentiatie) te analyseren en om deze resultaten te gebruiken om borstkanker het risico te voorspellen bij ratten die werden blootgesteld aan de voeding...

Veranderingen in de borstklier Morfologie en het risico op borstkanker bij ratten

Deze methode beschrijft hoe te ontleden en te evalueren ontwikkeling van de borstklier en de functie van muizen. Weggesneden borstklieren zijn beoordeeld op de mate van ontwikkeling met behulp van ganse berg, terwijl melk ejectie is geëvalueerd met behulp van een oxytocine-based myo cel contractie assay.

Evaluatie van de ontwikkeling van de borstklier en functie in muismodellen

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

We presenteren een benadering voor beeldregistratie voor reconstructie van 3-dimensionale (3D) histologievolumes, die het onderzoek naar de veranderingen van een orgaan op het niveau van macrostructuren van cellen vergemakkelijkt. Met behulp van deze aanpak hebben we de 3D-veranderingen tussen wild-type en Igfbp7-null borstklier beoordeeld.

Reconstructie van 3-dimensionale Histologie Volume en de toepassing ervan te studeren Mouse borstklieren

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

Ontwikkeling van de mammageklier in het knaagdier is typisch geëvalueerd met behulp van beschrijvende beoordelingen of door het meten van basis fysieke attributen. Vertakingsdichtheid is een indicator van de ontwikkeling van de moeders die moeilijk is om objectief te kwantificeren. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de kwantitatieve beoordeling van de vertakkingseigenschappen van de borstklier.

Kwantificerende vertakkingsdichtheid in Rat Mammary Gland Whole-mounts Met behulp van de Sholl Analyse Methode

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige techniek voor de intravitale beeldvorming van de borstklier van de zogende muis door middel van laserscanning, confocale en multifotonenmicroscopie.

Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier

Leer een methode voor het verwerken van mammaweefsel in toto preparaten om laesies microscopisch te identificeren. Deze techniek verbetert de nauwkeurigheid van histopathologische evaluaties in reproductief onderzoek.

Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie

Meer video's verkennen