Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

Het algemene doel van dit protocol voor de 3D-menselijke iPSC-serumvrije embryoïde lichamen is om een in-vitro-systeem te bieden dat het vroege corticale ontwikkeling van de mens benadert, dat kan worden gebruikt voor geneesmiddelontdekking. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het stamcelgebied te beantwoorden, zoals hoe neuronen afkomstig zijn van iPSC's, functionele netwerken vormen in 3D-weefsel. Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt aspecten van corticale ontwikkeling te modelleren in een schaal, van menselijk weefsel dat de genetica bevat van zieke individuen, dus het systeem dient als een op cellen gebaseerd platform voor geneesmiddelenscreening dat schaalbaar is en kan worden gebruikt om veel verschillende neurobiologische stoornissen te bestuderen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in neurobiologische of neuro-ontwikkelingsstoornissen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals die welke zich richten op modellen van neuro-immuunfunctie of neurale informatie. Voor dit protocol begint u met het vestigen van foetale cellen. Om deze cultuur te vestigen, plateert u 600.000 foetale cellen in elke put van een zes-putsplaat, met 300 milliliter medium per put.

Na het kweken van de foetale cellen gedurende 48 uur, vervangt u het medium. Incubeer de platen een uur, terwijl u de stamcellen voorbereidt. Ontdooi de stamcellen in een waterbad van 37 graden Celsius.

Nadat ze zijn ontdooid, brengt u de cellen over in een 15 milliliter conische buis en vult u de buis tot vijf milliliter met kweekmedium, druppelsgewijs toegevoegd. Centrifugeer vervolgens de cellen zachtjes gedurende vier minuten, aspireer de supernatant en suspendeert u voorzichtig de pellet in één milliliter stamcelmedium met ROCK-remmer. Na het kwantificeren van de celdichtheid, plateert u 300.000 stamcellen op de feedercellen.

Laat vervolgens de culturen groeien en uitbreiden, periodiek selecteren voor gezonde cellen, na uitbreiding en het invriezen van cellen voor back-up. Laat de stamcelkolonies groeien op standaard platen totdat ze 50% tot 70% confluentie bereiken. Gebruik vervolgens een mild enzymatisch behandeling en voorzichtig trituratie met de een milliliter pipette tip om de hiPSC's te verzamelen voor neuro voorloper celdifferentiatie.

Centrifugeer voorzichtig de suspensie, aspireer de supernatant en suspendeer de pellet in vijf milliliter menselijk iPSC-medium. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 0,1% gelatine gecoate vijf centimeter celcultuurschaal en incubeer de plaat gedurende een uur. Na een uur brengt u de niet-adherente cellen over naar een 15 milliliter centrifugeerbuis.

Spuit vervolgens de plaat voorzichtig af met drie milliliter medium en breng het over in dezelfde buis. Herhaal vervolgens de resuspenderingsstap met zachte centrifugatie, bepaal vervolgens de celdichtheid en plateer de cellen in een 96-wel, lage hechting V-bodemplaat bij 9.000 cellen per put. Draai nu de plaat gedurende drie minuten en begin met het kweken van de cellen.

Gedurende de volgende 14 dagen, vervangt u om de dag de helft van het medium met vers differentiatiemedium één. Na twee weken van het kweken van de cellen, bereidt u zes wel platen voor met 40 micron celcultuur inserts en één milliliter DM1-medium. Incubeer deze platen gedurende minimaal vier uur voordat u de gekweekte cellen toevoegt.

Gebruik vervolgens een 200 microliter brede mond pipette tip om twee weken oude celaggregaten waard ongeveer 20 microliter medium te verzamelen. Breng vier tot zes aggregaten over naar elke insert met minimale oplossing, verwijder eventueel overtollig. Tijdens deze stap is het belangrijk om snel te werken en met een stevige hand, terwijl u medium rond SFEB's verwijdert, kunt u de SFEB's zien bewegen over de oplossing vanwege oppervlaktespanning.

Het is prima om ze opnieuw te positioneren nadat het medium is verwijderd. Zodra alle aggregaten op inserts zijn geladen, verandert u het medium in één milliliter DM2 en blijft u de cellen om de dag kweken. Vervang drie vierde van het medium met vers medium.

Na 14 dagen van cultuur, begin met het toevoegen van DM3-medium aan de culturen. Ga door met het kweken gedurende 16 meer dagen om de SFEB's te laten groeien. Los vervolgens de SFEB's voorzichtig los van de inzet, met behulp van een 200 microliter brede mond pipette tip.

Breng de SFEB's over naar 12-wel platen, laad vier tot acht per wel. Vervolgens kleurt u ze zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de 12 wel en de acht platen voor te bereiden, wast u ze eerst drie keer met steriel water.

Was ze vervolgens eenmaal met 75%ethanol en nogmaals met 100%ethanol. Bak vervolgens de platen 4-5 uur op 50 graden Celsius ondersteboven, om het sterilisatieproces te voltooien. Na het bakken, voegt u 500 microliter 0,2% PEI-oplossing toe aan elke wel en laat de plaat een uur op kamertemperatuur staan.

Aspireer vervolgens de PEI en was de wels vier keer met steriel gedistilleerd water en laat ze 's nachts drogen. De volgende dag bereidt u vers laminant in L15-medium voor en voegt u 10 microliter toe aan het midden van elke wel. Voeg vervolgens gedistilleerd water toe aan de omringende reservoirs om verdamping te voorkomen en incubeer de plaat een uur bij 37 graden Celsius.

Zorg ervoor dat u de laminant in het midden van de elektroden bestraalt, wees voorzichtig om de ruimte van de aardelektroden niet te overschrijden, als deze ruimte wordt overschreden, zullen neuronen over de aardelektroden groeien, wat geluidsartefacten veroorzaakt en de nauwkeurigheid van de opname beïnvloedt. Voeg nu een voorbereide SFEB toe aan elke wel, met behulp van zachte zuiging met een brede boring pipette. Voeg vervolgens 200 microliter DM2 toe aan elke wel en kweek de plaat een nacht.

Later, om neurale activiteit op te nemen, plaats u een plaat in de pla