Name: Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Ontdek hoe je serumvrije embryoïde lichamen ontwikkelt van hiPSCs voor het bestuderen van menselijke corticale ontwikkeling en neurale netwerken in 3D. Deze methode ondersteunt drug screening voor neurologische aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Elizabeth Benevides voor het proeflezen van het artikel. Wij danken Drs. John Hussman en Gene Blatt voor hun goede discussies en opmerkingen.

1. Generatie van neurale progenitorcellen <ol><li> Houd hiPSC&#39;s afkomstig van fibroblasten en PBMC&#39;s in 6-putjesplaten op een y-bestraalde membraanvoeder (MEF) cellaag in humaan iPSC-medium aangevuld met kleine moleculen (zie de Material Table). OPMERKING: Dagelijks onderhoud is een gewijzigde versie van eerder gemelde procedures 1 , 16 . <ol><li> Plaat 6 x 10 5 MEF&#39;s op elke putje van een 6-putje weefselkweekgraadplaat in 300 μl / well aanbevolen medium (volgens fabrikantprotocol). </li><li> Na 48 uur vervang MEF&#39;s medium met 300 μL / well hiPSC medium gedurende 1 uur voordat u hiPSCs toevoegt. </li><li> Droog de hiPSCs snel in een waterbad van 37 ° C en voeg druppelgewijs 1 ml hiPSC-medium langzaam toe. Plaats de hiPSCs en het medium in een 15 ml conische buis. Voeg medium toe om het totale volume tot 5 ml te brengen. Centrifugeer gedurende 4 minuten bij 129 xg, aspireer de supernataNt, zet de pellet voorzichtig op in 1 mL hiPSC medium met ROCK inhibitor bij 1: 1000 concentratie. </li><li> Plaat de celsuspensie (meestal gezaaid met 300.000 cellen / putje) op de MEF cellaag en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid. </li><li> Monitor de iPSC cultuur nauw met behulp van een lichtmicroscoop. Verwijder na 48 uur culturen die ongelijke randen hebben, zijn gegroeid tot cystisch of verschijnen geelbruin onder de lichtmicroscoop om spontane differentiatie te minimaliseren. OPMERKING: Na 7 - 10 dagen zouden hiPSC kolonies moeten vormen. Kolonies zouden rond moeten zijn, met duidelijk gedefinieerde grenzen en uniforme celdichtheid en zonder losse, niet-uniforme cellen. </li><li> Selecteer handmatig ronde hiPSC kolonies om de cultuur van spontaan gedifferentieerde cellen te wissen. Vergroot de kolonies door ze op verse MEF-lagen te plaatsen. Vergroot 1: 3 elke 7 dagen wanneer culturen in de buurt van samenvloeiing en bevriezen 1 , 16 . </li></ol></li><li> Na uitbreiding en bevriezing van cellen (voor back-up), groei hiPSC kolonies op platen tot ze 50 tot 75% samenvloeiing bereiken. </li><li> Zeven dagen postplating, gebruik een milde enzymatische behandeling (5-10 minuten met 300 μL enzymoplossing) en zachte trituratie (2-4 keer met een 1000 μL pipet) om hiPSC&#39;s te ophalen en voorbereiden op neurale precursorcel-differentiatie. </li><li> Centrifugeer de cel suspensie bij 129 xg gedurende 4 minuten, aspirateer de supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml menselijk iPSC medium. Zet de celsuspensie over op een 0,1% gelatine beklede 5 cm celcultuurschotel gedurende 1 uur bij 37 ° C om MEF&#39;s te elimineren en de hiPSC-opbrengst te maximaliseren. Breng het medium (met niet-aanhechtende cellen) over op een andere 5 cm gelatine gecoate schotel. </li><li> Breng de niet-aanhechtende cellen over op een 15 ml centrifugebuis met behulp van een transferpipet. Spoel de platen voorzichtig af met 3 ml medium en voeg deze toe aan de 15 ml buis. </li><li> Centrifugeer de cel suspensie bij 129 xg gedurende 4 minuten, aspireren de superNatant, en verzacht de pellet zachtjes in medium. Bepaal de celtelling met behulp van een geautomatiseerde celteller. Platte 9.000 cellen / putje in een 96-putjes met lage hechting V-bodemplaat. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 163 xg gedurende 3 minuten. Incubeer de plaat bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. Gebruik een pipet met 50% medium om de andere dag te veranderen door de helft van het medium te verwijderen en gedurende 14 dagen met vers chemisch gedefinieerd differentierend medium 1 (DM1, Figuur 1 , Tabel) te vervangen. </li></ol> 2. Inductie van de Serumvrije Embryoidlichaam (SFEB) ( Figuur 2 ) <ol><li> Plaats 40 μm celkweekinzetten in 6-putjesplaten en voeg 1 ml DM1-medium tenminste 1 uur voorafgaand aan de toevoeging van aggregaten toe. </li><li> Op dag 14 overdragen de aggregaten met 20 μl medium met behulp van een 200 μL brede mondpunt op 40 μm celkweekinzetten en verander het medium naar DM2. <br/&gt; OPMERKING: De celkweekstukken zijn gespecialiseerde inserts die iets van de bodem van de put zitten en bestaan ​​uit een polytetrafluoroethyleenmembraan dat over een plastic frame hangt. Dit membraan is biocompatibel en kan het nutriënt- en zuurstoftransport efficiënt ondersteunen aan de SFEB&#39;s, die bovenop geplaatst zijn. Ze worden meestal gebruikt met organotypische hippocampale plakculturen die zijn genomen uit de muis of rat 7 , 17 , 18 . <ol><li> Verplaats 4-6 aggregaten naar een celkweekinzet en laat voldoende ruimte tussen de aggregaten. Verwijder zoveel mogelijk overmaat oplossing met een fijne pipet tip ( bijv. 200 μL tip). OPMERKING: Het is aanvaardbaar om de SFEB kortstondig te storen, aangezien ze op de celcultuurinzet zullen bewegen, aangezien de oplossing van de SFEB&#39;s verwijderd is. </li><li> Handhaaf de kweken in 1 ml DM2 bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. Gebruik een pipet, verander 75%Middelmatig elke andere dag door drie kwartier van het medium te verwijderen en te vervangen door drie kwartier vers medium. Verwijder bijvoorbeeld 750 μl medium en voeg 750 μL vers medium toe. </li></ol></li><li> Na 14 dagen cultuur, overstappen naar DM3 medium met 75% gemiddelde verandering elke andere dag en nog eens 16 dagen. </li><li> Om de SFEB&#39;s op celcultuurinzetten te handhaven na 30 dagen, verander het medium elke andere dag gedurende 60, 90 en 120 dagen. OPMERKING: De SFEBs zullen groeien tot ongeveer 1000 μm in diameter en zijn typisch 100-150 μm dik 1 . </li></ol> 3. Bepaling van SFEB-samenstelling <ol><li> Verwijder de SFEB&#39;s uit het inzetstuk door zacht pipetterend medium met behulp van een 200 μL brede mondpipetpunt. Om de SFEB&#39;s over te brengen, gebruik een brede mondpipetpunt om de lichamen zachtjes in de pipetpunt te zuigen. Na het laden van SFEB in de pipettaart, zachtjes overbrengen naar platen met 12 putjes en wassen met 300 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing(PBS) per putje. OPMERKING: SFEB&#39;s worden opgeschort in oplossing in de 12-putjesplaten. Dit is belangrijk om de volledige penetratie van het fixatief, de blokkerende oplossing en antilichamen mogelijk te maken. Als u meerdere SFEB&#39;s gebruikt voor het vullen, kunnen maximaal 10 SFEB&#39;s per putje van een 12-putjesplaat worden toegevoegd. Dit bespaart oplossingen en antilichamen. </li><li> Fix SFEB&#39;s met 300 μL per putje 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 30-45 min. Was SFEB&#39;s tweemaal met 300 μL PBS, 3-5 minuten per was. Voorzichtigheid: Draag geschikte persoonlijke beschermende uitrusting bij het hanteren van paraformaldehyde. OPMERKING: Probe voor immunoreactiviteit aan markers om volwassenheid, celtype, enz. Te bepalen. Voor het markeren van neuronen in deze studie werd kuik-Tuj1 gebruikt om 1: 500, voor extra markers zie tabel 2 en referenties 1 , 16 . </li><li> Permeabiliseren en blokkeren met 0,1% Triton-X100 in PBS en 10% normaal ezelserum (blokkerende oplossing; 300 μl; L per putje) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de blokkerende oplossing en behandel SFEB&#39;s met 300 μL primaire antilichamen in blokkerende oplossing. Incuberen bij 4 ° C overnacht. Was SFEB&#39;s driemaal (3-5 minuten per was) in 300 μL PBS die 0,1% Triton-X bevat. </li><li> Bereid secundaire antilichamen 1: 1000 in blokkerende oplossing. Incubeer SFEB&#39;s gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met secundaire antilichamen. Was SFEB&#39;s met 300 μL PBS, 3 keer voor 3-5 minuten elk. OPMERKING: SFEB&#39;s kunnen op dit moment worden voorbereid voor beeldvorming. </li><li> Naar beeld, pipet SFEB&#39;s op een glazen glijbaan met behulp van een brede boorpipet. Verwijder de overtollige oplossing rond de SFEB met behulp van zachte zuigkracht. OPMERKING: Voor soortgelijke kleuringstoestanden kunnen meerdere SFEB&#39;s op dezelfde glazen glijbaan worden geplaatst. </li><li> Voeg een druppel montagemedium op de SFEBs toe, plaats een glazen deklip en druk voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn. Laat het montagemedium verharden en ga verder naar beeldvorming en kwantificering (stap 3.8). <br/&gt; OPMERKING: Nadat het montagemedium is verhard, zijn de SFEB&#39;s klaar voor beeldvorming. </li><li> Voer celkwantificatie uit door meerdere regio&#39;s van belangstelling (ROI) over de SFEB te nemen en gebruik een z-stapel gecombineerd met een maximale projectiebeeld via elke ROI op een standaard confocale microscoop zoals beschreven in referenties 1 , 16 . OPMERKING: Hele SFEB&#39;s kunnen worden gekwantificeerd met behulp van beeldgebaseerde tegels (zie referenties 1 , 16 voor details). Aangezien de SFEB&#39;s dunne zijn tot ongeveer 100 μm, is er minimale verstrooiing van licht in het weefsel en dus is er geen behoefte aan 2-foton microscopie. Eerder gebruik van dit protocol met fibroblast-afgeleide iPSC&#39;s produceerde een SFEB-noodlotkaart dat complexe en uiteenlopende structuur met subpopulaties van interneuronen met transcriptie-identiteiten onthulde die lijken op CGE en anterior forebrain fates 1 , 16. </sup&gt; </li></ol> 4. Neuronale activiteit opnemen in SFEB&#39;s met behulp van MEA&#39;s <ol><li> Bereid 12-putjes MEA borden volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Was de MEA platen 3 maal gedurende 5 minuten met steriel H2O onder aseptische omstandigheden te reinigen. Was gedurende 5 minuten met 75% ethanol en dan met 100% ethanol om de plaat te steriliseren. </li><li> Bak de plaat gedurende 4-5 uur bij 50 ° C in een oven om het sterilisatieproces te voltooien. </li><li> Voeg 500 μL 0,2% polyethyleenimine oplossing (PEI) toe aan elke put en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Aspireren PEI en was de putjes 4x met steriel gedestilleerd H2O droging in de zuurkast gedurende de nacht. </li><li> Bereid een 20 μL / ml oplossing van laminine in L15 medium en voeg 10 μL laminine in het midden van elke put. OPMERKING: Niet de omliggende referentie- en aardingselektroden bedekken. </li><li> Voeg steriele dH 2 O tot het omringende medium reservoirs of laminine verdamping te voorkomen.Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Voeg SFEB&#39;s (zie rubrieken 1 en 2) toe aan de laminine-gecoate MEA-platen door ze zachtjes in een brede mondpipetpunt te zuigen en over te brengen. Voeg 200 ul DM2 medium aan elk putje en incubeer gedurende de nacht bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. </li><li> Voeg een extra 200 μl medium na 24 uur toe en laat het gedurende 30 minuten bij 37 ° C, 95% vochtigheid, 5% CO 2 herstellen alvorens de plaat te lezen. </li><li> Plaats de MEA-plaat in de plaatlezer (voorverwarmd tot 37 ° C) om neuronale activiteit op te nemen. Record activiteit gedurende 10 minuten met de bijbehorende MEA opname software. Zie referentie 19 voor details. </li><li> Genereer ruwe data-continue stromen en raster plots neuronale activiteit met behulp van statistische analyse software 19 . OPMERKING: MEA opnames worden 7 dagen na SFEB plating genomen. Voor deze studie werden opnamen genomen gedurende 10 minuten om netwerkbreukactiviteit, conTrage trace en raster plots. SFEB&#39;s kunnen langdurig op MEA-platen worden gehandhaafd en kunnen over langere tijdsperioden worden opgeslagen met behulp van milieu-gecontroleerde omstandigheden ( Figuur 6 ). </li></ol>

<ol><li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+serum-free+embryoid+bodies+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks.</a> Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Song, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development+and+remapping+through+spike+timing-dependent+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity.</a> Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).</li>
<li>Pre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+course+analysis+of+the+electrophysiological+properties+of+neurons+differentiated+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs).</a> PLoS One. 9 (7), e103418(2014).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+molecular+profiling+of+PSEN1+familial+Alzheimer%27s+disease+iPSC-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors.</a> PLoS One. 9 (1), e84547(2014).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).</li>
<li>Cukier, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+of+extended+families+with+autism+reveals+genes+shared+across+neurodevelopmental+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.</a> Mol Autism. 5 (1), (2014).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Choi, S. H., Tanzi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSCs+to+the+rescue+in+Alzheimer%27s+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPSCs to the rescue in Alzheimer's research.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).</li>
<li>Yagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+familial+Alzheimer%27s+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells.</a> Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).</li>
<li>Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promises+and+challenges+of+human+brain+organoids+as+models+of+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease.</a> Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).</li>
<li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Inducible+Pluripotent+Stem+Cells+and+Autism+Spectrum+Disorder%3A+Emerging+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Res%22%5BJournal%5D)">Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies.</a> Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).</li>
<li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+subpopulation+of+developing+cortical+interneurons+from+human+iPSCs+within+serum-free+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).</li>
<li>Nestor, M. W., Hoffman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cycling+rates+of+Kv4.2+channels+in+proximal+and+distal+dendrites+of+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).</li>
<li>Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+neuron-glial+interactions+mediated+by+astrocytic+EphARs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs.</a> J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).</li>
<li>Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-Derived+Dopamine+Neurons+Reveal+Differences+Between+Monozygotic+Twins+Discordant+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease.</a> Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).</li>
<li>Huang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+stabilizes+axin+and+antagonizes+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling.</a> Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+reprogrammed+from+human+mesenchymal-like+stem%2Fprogenitor+cells+of+dental+tissue+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin.</a> Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+clinical-grade+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+Xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 223(2015).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Differentiation+of+a+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Line+%28FS-1%29+Derived+from+Newborn+Foreskin+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts.</a> Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li>
<li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells Int. , 738910(2012).</li>
<li>Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+and+Spatial+Interaction+Govern+Stem+Cell+Differentiation+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics.</a> Sci Rep. 5, 12617(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Het hier beschreven protocol geeft de voorwaarden om een ​​hiPSC bron te differentiëren in een 3-D structuur die een vroeg stadium van ontwikkeling van de frontale cortex recapituleert. Deze procedure levert structuren op die kunnen worden ondervraagd voor elektrofysiologie, terwijl ze ook voor microscopie vatbaar zijn. De uiteindelijke morfologie van het SFEB lijkt op die van organotypische breinschijfculturen en zorgt voor hoge kwaliteit gedetailleerde confocal beeldvorming. Dit protocol kan SFEB&#39;s succesvol gener...

We hebben eerder een 3-D model systeem gemeld, geproduceerd door patiëntgerelateerde door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) die sommige aspecten van de vroege corticale netwerkontwikkeling 1 herhaalt. Dit 3-D model, een serumvrij embryoidlichaam (SFEB), verbetert bij eerdere eenvoudige aggregatie hiPSC modellen 2 , 3 . Een groeiend werkstuk laat zien dat 3-D structuren zoals onze SFEB&#39;s, benaderende aspecten van neurale ontwikkeling die in vivo en op een vroeger tijdstip algemeen waargenomen worden, dan waargenomen in 2-D-dimensionale (2-D) / monolaag hiPSC modellen 4 , 5 . Initiële studies zijn gericht op de zelf-organiserende complexiteit van 3-D lichamen zonder hun fysiologische complexiteit 2 aan te tonen . Het hier beschreven protocol is toegepast op ongedifferentieerde hiPSCs afgeleid van fibroblasten en<html> Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC&#39;s). Deze cellen worden gehandhaafd op y-bestraalde muis embryonale voeders (MEF&#39;s). Deze hiPSC kolonies worden handmatig gereinigd van spontaan gedifferentieerde cellen, enzymatisch geoogst en geresuspendeerd in medium dat Rho-Kinase inhibitor Y-27632 (ROCKi) bevat. Niet-gedifferentieerde hiPSC&#39;s worden onderworpen aan dissociatie en centrifugatie voordat ze worden overgebracht naar 96-putjes met lage hechting V-bodemplaten. Na plating wordt neurale inductie ingeleid door gebruik te maken van dubbele SMAD remming (SB431542 en LDN193189, samen met dickkopf 1 (DKK-1)) om een ​​neuronale-afwijking van anterior-frontale voorhoofd 6 te leiden . Na 14 dagen worden de SFEB&#39;s overgebracht naar celkweekinzetten in een 6-putjesplaat. Eenmaal overgebracht, beginnen de ronde SFEB&#39;s te verspreiden en dunken, terwijl lokale netwerkverbindingen worden gehandhaafd, zoals vaak wordt waargenomen in hippocampale organotypische plakcultuurpreparaten onder gebruikmaking van vergelijkbare celkweekinzetten 1 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 7. Het gebruik van een SFEB-gebaseerd 3-D-platform in dit formaat is vatbaar voor de efficiënte productie van corticale netwerken die geïnterviewd kunnen worden met behulp van cel gebaseerde fysiologische analyses, zoals calciumbeeldvorming of elektrofysiologische analyses, zoals single-cell opnames of multi-electrode array (MEA ) 1 . Hoewel 3-D-systemen de markers van vroege corticale ontwikkeling dragen, hebben andere studies aangetoond dat deze 3-D-lichamen langer incubatietijden nodig hebben om het inherent langzamere tempo van de ontwikkeling van menselijk weefsel te kunnen veroorzaken 8 . Dit SFEB protocol genereert succesvol 3-D SFEB&#39;s van ongedifferentieerde hiPSCs die aspecten van de vroege ontwikkeling van de cortex vastleggen. Het potentieel van SFEB&#39;s om netwerkafwijkingen in neurologische aandoeningen te modelleren is een kracht van dit systeem. De hiPSC&#39;s afgeleid van patiëntweefsel kunnen worden gekweekt in cellen van het zenuwstelsel dat onderworpen zijn aan ezelAys die betrekking hebben op celbiologie evenals gelijktijdige genexpressie. Menselijke iPSC&#39;s worden gebruikt om het genetische profiel van grote groepen individuen met verschillende neurologische aandoeningen te bepalen met complexe etiologieën zoals autisme spectrum stoornis (ASD), schizofrenie 9 , Rett syndroom 10 en de ziekte van Alzheimer 11 , 12 . Tot voor kort waren iPSC-modellen typisch monolaagpreparaten die, hoewel geschikt voor het evalueren van moleculaire interacties, onvoldoende waren in het ontcijferen van de complexe cellulaire interacties die in vivo werden gezien. Diermodellen zijn de standaardvervanger voor het herstellen van het hele orgelplatform. Deze diermodellen worden geplaagd door een slechte vertaling van bevindingen en hebben een beperkte mogelijkheid om menselijke genetische profielen te identificeren die zijn geïdentificeerd door grote genetische screeningsstudies. Zo voegt de ontwikkeling van 3-D systemen van iPSCs een vereiste laag van complexiteit in het menselijk toeZiekte modelleren 13 , 14 . De volgende stap voor 3D-hiPSC-platforms is om de grote schaalvereisten van high-throughput screening op te vangen met behulp van cel gebaseerde assays 15 .

<table><tbody><tr><td>SFEB Neuronal Differentiatie Cellencultuur Media. Reagentia. Componenten&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>0-5835</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)</td><td>GlobalStem</td><td>GSM-2001</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>DM1 Media Componenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax vloeistof, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>385 mL</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>20% 100 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Aminozuren Oplossing 10 mM (100x), vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1.000x), vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td>900 &mu;L</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>DM2 Media Componenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax vloeistof, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x), vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>DM3 Media Componenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL Medium (1x), vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Kleine moleculen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>2 &mu;M</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010-10</td><td>1:1.000 (10 &mu;M)</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td>1 &mu;M</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074-10</td><td>250 nM</td></tr><tr><td>Y27632 (ROCKi)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012-10</td><td>10 &mu;M</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Recombinante Eiwitten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DKK-1</td><td>Peprotech</td><td>120-30</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Componenten/Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture inserts 0,4 &mu;M, 30mm Diameter</td><td>Millicell</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6301G</td><td></td></tr><tr><td>96 well V bottom met deksels</td><td>Evergreen</td><td>222-8031-01V</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociatie Reagens</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>ThermoFisher</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferd Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11415114</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DRAQ5 (Nucleair Marker)</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0880-96</td><td></td></tr><tr><td>MEA Plates</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-GL1-30Pt200</td><td></td></tr><tr><td>6 well platte bodem</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antilichaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td></td></tr><tr><td>Brn-2</td><td>Protein tech</td><td>14596-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>VGLUT1</td><td>Synaptic Systems</td><td>135 303</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Calretinin</td><td>abcam</td><td>ab702</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin</td><td>abcam</td><td>ab11426</td><td></td></tr><tr><td>CoupTFII</td><td>R&amp;D Systems</td><td>PPH714700</td><td></td></tr><tr><td>Nkx 2.1</td><td>abcam</td><td>ab12650</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>abcam</td><td>ab41489</td><td></td></tr><tr><td>Reelin</td><td>Millipore</td><td>MAB5364</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1</td><td>Millipore</td><td>MAB2261</td><td></td></tr><tr><td>NFH</td><td>Dako</td><td>M0762</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van hipsc-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-d stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Hoewel een aantal in vitro ziekte modellen is ontwikkeld met behulp van hiPSCs, is één beperking dat deze tweedimensionale (2-D) systemen niet de onderliggende cytoarchitectural en functionele complexiteit van de getroffen personen kunnen voorstellen die vermoedelijke ziektevarianten dragen. Conventionele 2-D modellen blijven onvolledige representaties van in vivo- achtige structuren en behalen de complexiteit van de hersenen niet voldoende. Zo is er een opkomende behoefte aan meer 3-D hiPSC-gebaseerde modellen die de cellulaire interacties en functies die in een in vivo systeem worden gezien, beter kunnen herkapituleren. Hier rapporteren we een protocol om een ​​3-D systeem te ontwikkelen van ongedifferentieerde hiPSCs op basis van het serumvrije embryoidlichaam (SFEB). Dit 3-D model weerspiegelt aspecten van een ontwikkelde geventraliseerde neocortex en maakt het mogelijk om te onderzoeken naar functies die integreren in levende neurale cellen en intact weefsel zoals migratie, connectiviteit, communicatie en matUUR. Specifiek wijzen wij aan dat de SFEB&#39;s die ons protocol gebruiken kunnen worden ondervraagd met behulp van fysiologisch relevante en hoogwaardige cel gebaseerde assays, zoals calciumbeelden en multi-electrode array (MEA) opnames zonder cryosectie. In het geval van MEA-opnamen tonen we aan dat SFEB&#39;s zowel spijkeractiviteit als netwerkbreukactiviteit verhogen tijdens de lange termijn cultuur. Dit SFEB protocol biedt een robuust en schaalbaar systeem voor de studie van het ontwikkelen van netwerkvorming in een 3-D model dat aspecten van de vroege corticale ontwikkeling vastlegt.

SFEB&#39;s gegroeid met behulp van onze techniek, leverden weefsel met morfologische eigenschappen op, die lijken op een vroegtijdige ontwikkelende corticale subventriculaire zone vol met uitgebreide Tuj1-positieve neuronen, evenals neurale voorvaders ( Figuur 3A ). Tal van ontwikkelende corticale rozetten werden waargenomen in de buitenste lagen en binnenste lagen van het SFEB ( Figuur 3B ). De buitenste rand van het SFEB lijkt...

Hier rapporteren we een protocol voor het ontwikkelen van een driedimensionaal (3-D) systeem van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het serumvrije embryoïde lichaam (SFEB) genoemd. Dit 3-D model kan gebruikt worden als een organotypische plakcultuur om menselijke corticale ontwikkeling te modelleren en voor de fysiologische ondervraging van neurale ontwikkelingen.

Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Het algemene doel van dit protocol voor serumvrije embryoid bodies van menselijke iPSC's in 3D, is het bieden van een in-vitro systeem dat de vroege menselijke corticale ontwikkeling benadert, wat gebruikt kan worden voor drug discovery. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het stamcelveld, zoals hoe neuronen afgeleid worden van iPSC's en functionele netwerken vormen in 3D-weefsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om aspecten van de corticale ontwikkeling in een kweekschaal te modelleren, gebruikmakend van menselijk weefsel dat de genetica van zieke individuen bevat; hiermee dient het systeem als een schaalbaar celgebaseerd platform voor drugscreening dat kan worden gebruikt om vele verschillende neurobiologische aandoeningen te bestuderen.Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in neurobiologische stoornissen of stoornissen in de neuro-ontwikkeling, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals systemen die gericht zijn op modellen van neuro-immuunfuncties of neurale informatie. Begin bij dit protocol met het vestigen van foetale cellen. Om deze cultuur te vestigen, worden 600.000 foetale cellen per well in een six-well plaat geplaatst, met 300 milliliters medium per well.Vervang het medium na het cultiveren van de foetale cellen gedurende 48 uur. Incubeer de platen gedurende een uur, terwijl de stamcellen worden voorbereid. Ontdooi de stamcellen in een waterbad van 37 °C.Zodra de cellen ontdooid zijn, brengt u deze over naar een conische buis van 15 milliliter en vult u de buis aan tot vijf milliliter met kweekmedium, druppelgewijs toegevoegd. Centrifugeer de cellen vervolgens voorzichtig gedurende vier minuten, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet voorzichtig in één milliliter stamcelmedium met ROCK-inhibitor. Nadat de celdichtheid is bepaald, plaatst u 300 000 stamcellen op de feeder-cellen.Kweek en breid de culturen vervolgens uit, waarbij periodiek wordt geselecteerd op gezonde cellen, waarna de cellen na expansie worden ingevroren als reserve. Kweek de stamcelkolonies op standaardplaten totdat ze een confluentie van 50% tot 70% bereiken. Gebruik vervolgens een milde enzymatische behandeling en voorzichtig tritureren met de ene milliliter pipetpunt om de hiPSCs te oogsten voor differentiatie naar neurale precursorcellen.Centrifugeer de suspensie voorzichtig, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet in vijf milliliter medium voor menselijke iPSC's. Breng vervolgens de cel-suspensie over naar een vijf centimeter cellenkweekschaal die is gecoat met 0,1% gelatine en incubeer de plaat gedurende één uur. Zet na een uur de niet-adherente cellen over in een centrifugebuis van 15 milliliter.Spoel de plaat vervolgens voorzichtig af met drie milliliter medium en breng deze over naar dezelfde buis. Herhaal daarna de resuspensie-stap met een zachte centrifugatie, bepaal vervolgens de celdichtheid en zaai de cellen uit in een 96-well low-adhesion V-bottom plaat bij 9.000 cellen per well. Centrifugeer de plaat nu gedurende drie minuten en start de celkweek.Vervang gedurende de volgende 14 dagen om de dag de helft van het medium door vers differentiatiemedium één. Bereid na twee weken kweken van de cellen zes wellplaten voor met celkweekinserts van 40 micron en één milliliter DM1-medium. Incubeer deze platen gedurende ten minste vier uur voordat de gekweekte cellen worden toegevoegd.Verzamel vervolgens met een 200 microliter wide mouth pipetpunt twee weken oude celaggregaten in ongeveer 20 microliters medium. Breng vier tot zes aggregaten met een minimale hoeveelheid vloeistof over naar elke insert en verwijder alle overtollige vloeistof. Tijdens deze stap is het belangrijk om snel en met een vaste hand te werken; terwijl u het medium rond de SFEB's verwijdert, kan het gebeuren dat de SFEB's door oppervlaktespanning over de vloeistof bewegen.Het is geen probleem om ze opnieuw te positioneren nadat het medium is verwijderd. Zodra alle aggregaten op de inserts zijn geplaatst, wordt het medium vervangen door één milliliter DM2 en worden de cellen om de dag verder gekweekt. Vervang driekwart van het medium door vers medium.Voeg na 14 dagen kweek DM3-medium toe aan de culturen. Zet de kweek nog 16 dagen voort om de SFEB's te laten groeien. Detacheer nu voorzichtig de SFEB's van de insert met behulp van een 200 µL wide mouth pipetpunt.Breng de SFEB's over naar 12-well platen, waarbij vier tot acht per well worden geladen. Kleur ze vervolgens zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de 12-well plaat en de acht platen voor te bereiden, moeten ze eerst drie keer worden gewassen met steriel water.Was ze vervolgens één keer met 75% ethanol en nogmaals met 100% ethanol. Bak de platen daarna vier tot vijf uur lang ondersteboven op 50 °C om het sterilisatieproces te voltooien. Voeg na het bakken 500 µL 0,2% PEI-oplossing toe aan elke put en laat de plaat een uur bij kamertemperatuur staan.Aspireer vervolgens het PEI en was de wells vier keer met steriel gedestilleerd water en laat ze gedurende de nacht aan de lucht drogen. Bereid de volgende dag vers laminant in L15-medium en voeg 10 µL toe aan het midden van elke well. Voeg vervolgens gedestilleerd water toe aan de omliggende reservoirs om verdamping te voorkomen en incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C.Zorg ervoor dat het laminaat in het centrum van de elektroden wordt gestraald, waarbij u er alert op bent dat u de ruimte van de grounding-elektroden niet overschrijdt; als deze ruimte wordt overschreden, zullen neuronen over de grounding-elektroden groeien, wat ruisartefacten veroorzaakt en de getrouwheid van de registratie beïnvloedt. Voeg nu één voorbereide SFEB toe aan elke put, waarbij u voorzichtig zuigt met een pipette met een wijde opening. Voeg vervolgens 200 µL DM2 toe aan elke put en kweek de plaat gedurende de nacht.Plaats later een plaat in de plaatlezer om de neurale activiteit vast te leggen. Verwarm deze voor tot 37 °C. Gebruik vervolgens de software om gedurende 10 minuten de activiteit van elke well te registreren.SFEB wordt gekweekt volgens de beschreven methode en leverde weefsel op met morfologische kenmerken die lijken op een vroeg ontwikkelende corticale subventriculaire zone, rijk aan uitgebreide Tuj1-positieve neuronen alsof wel als neurale progenitoren. Talrijke ontwikkelende corticale rozetten werden waargenomen in de buitenste lagen en in de binnenste lagen van de lichamen. De buitenrand van de lichamen vertoont gelijkenissen met een ontwikkelende corticale plaat die postmitotische neuronen bevat; dit wordt ondersteund door de expressie van Brn2, een marker voor neurale progenitoren en de meest ventraliseerde buitenste corticale lagen.De buitenste lagen bevatten ook Reelin-positieve cellen die mogelijk casuïstische gratzel-cellen of hun voorlopers zijn. De cellichamen vertoonden tevens markers die consistent zijn met een gemengde oorsprong uit de codale en mediale ganglionale eminentia, gebaseerd op de expressie van TF2- en Nkx2.1-markers.De gekweekte SFEB's leveren zowel CalR- als CalB-positieve interneuronen op. Daarnaast worden VGLUT-positieve exciterende neuronen en Tbr1-positieve glutamaterge neurale progenitorcellen gegenereerd. In overeenstemming met andere rapporten was 61% van de cellen uit de lichamen VGLUT-positief en 43% was Tbr1-positief.MEM-opnames gemaakt van de cellichamen kunnen gedurende lange perioden worden uitgevoerd, en de opnames toonden de ontwikkeling van bursting op het niveau van het corticale netwerk. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u SFEB's kweekt uit menselijke iPSC's, hoe u de neurale inhoud van punitief ontwikkelende corticale rozetten karakteriseert met NSFEB's, en hoe u neurofysiologische assays uitvoert op maturerende SFEB's.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat het tijd en oefening kost om de nodige wetenschappelijke expertise te ontwikkelen met betrekking tot het gedrag van iPSCs en de differentiatie van iPSCs tot neuronen in kweek. De gekweekte cellen moeten dagelijks worden gemonitord. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals calcium-imaging, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van bepaalde medicamenteuze behandelingen op corticale netwerkoscillaties.

developing-hipsc-derived-serum-free-embryoid-bodies-for-interrogation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Video bioinformatica is de geautomatiseerde verwerking, analyse, begrip, en data mining van biologische ruimte-tijd gegevens uit microscopische video's. Het doel van dit artikel is om aan te tonen een methode voor het meten van menselijke embryonale stamcellen kolonie groei van het gebruik van een video bioinformatica methode.

Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

The video describes the procedure for developing serum-free embryoid bodies (SFEBs) from neuronal progenitor cells using various serum-free differentiation mediums or DM. DM-2 facilitates neurons' maturation and arrangement to form SFEBs, while DM-3 is used for further growth maintenance.

Development and Maintenance of Serum-Free Embryoid Bodies

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Een protocol is bedoeld om te bereiden polyvinyl alcohol-co-itacon zuur hydrogels met verschillende stijfheid, die waren geënt met en zonder oligopeptides, te onderzoeken van het effect van de stijfheid van biomaterialen op de differentiatie en de verspreiding van de cellen van de stam. De stijfheid van de hydrogels werd gecontroleerd door het crosslinking tijd.

Menselijke pluripotente stamcel cultuur op Polyvinyl Alcohol-Co-itacon zuur Hydrogels met verschillende stijfheid onder voorwaarden Xeno-gratis

Dit protocol beschrijft een benadering voor de productie van hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd cultuur systeem en cel zelf montage. Dit protocol is reproduceerbaar in een aantal cellijnen, kostenbesparend en maakt de productie mogelijk van stabiele menselijke hepatosferen voor biomedische toepassing.

Serum vrije productie van driedimensionale menselijke Hepatosferen uit pluripotente stamcellen

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Organoïden zijn waardevolle hulpmiddelen geworden voor het modelleren van ziekten. De extracellulaire matrix (ECM) stuurt het lot van cellen tijdens het genereren van organoïden, en het gebruik van een systeem dat lijkt op het natuurlijke weefsel kan de nauwkeurigheid van het model verbeteren. Deze studie vergelijkt de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide menselijke darmorganoïden in dierlijk ECM en xeno-vrije hydrogels.

Vergelijkende studie van basaalmembraanmatrices voor het onderhoud van menselijke stamcellen en het genereren van darmorganoïden

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Ontdek hoe je serumvrije embryoïde lichamen ontwikkelt van hiPSCs voor het bestuderen van menselijke corticale ontwikkeling en neurale netwerken in 3D. Deze methode ondersteunt drug screening voor neurologische aandoeningen.

Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

Meer video's verkennen