Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus
7 augustus 2017
Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.
Het algemene doel van deze methode voor het bemonsteren van mucosale bekledingsvloeistof is om de lokale immuunsignaturen van de luchtwegen te bestuderen zonder de noodzaak van stimulatieprocedures. Deze methode stelt u in staat om belangrijke vragen te bestuderen op het gebied van pediatrische aandoeningen van de luchtwegen, zoals infecties, astma en allergie. De voordelen van de methode zijn dat u zeer lage niveaus van immuunmediatoren in de niet-gestimuleerde luchtwegmucosa in vivo kunt meten.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Wolsk. Voor het verzamelen van monsters bij pasgeborenen, snijdt u eerst minstens twee stroken van drie bij 15 millimeter van vezelige gehydroxyleerde polyester filtervellen. Plaats vervolgens de pasgeborene op een bed en noteer eventuele symptomen van luchtweginfectie.
Gebruik vervolgens een pincet om één stuk filterpapier ongeveer één centimeter in de voorste delen van de inferieure turbinaat van elke neusholte van de baby te steken en geef de pasgeborene naar behoefte suikerwater voor comfort. Let op eventueel niezen, aanhoudend huilen of epistaxis dat optreedt tijdens de bemonsteringsperiode. Na twee minuten absorptie, brengt u de filterpapieren over in een gelabelde buis voor onmiddellijke opslag bij min 80 graden Celsius.
De experimentele procedure wordt gedemonstreerd door Lisbeth Rosholm, een technicus in mijn laboratorium. Voor de kwantificering van immuunmediatoren in de luchtwegen, plaatst u maximaal 10 monsters uit de opslag bij min 80 graden Celsius op ijs en noteert u hun identificatienummers. Wanneer de monsters zijn ontdooid, dompelt u beide filterpapieren per proefpersoon in 150 microliter vers bereide buffer per filterpapier, aangevuld met één complete proteaseremmertablet per 25 milliliter buffervoorraadoplossing.
Breng de monsters over naar een plate shaker op 400 tpm gedurende vijf minuten. Breng de buffer en filterpapieren over in de cups van individuele celluloseacetaatbuisfilters. Centrifugeer de monsters om het gefilterde nasale extract aan de bodem van de microcentrifugebuisjes te verzamelen.
Verwijder vervolgens de cups en plaats de buisjes op ijs. Breng vervolgens 150 microliter aliquots van het nasale extract over in individuele wells van opslagplaten met lage eiwitbinding en bewaar de platen bij min 80 graden Celsius tot analyse. Meet vervolgens de concentratie van de nasale immuunmediatoren van belang door een zeer gevoelige elektrochemiluminescentie-gebaseerde multiplexed array volgens standaard assay protocollen.
In deze representatieve analyse van 620 pasgeborenen, vertoonde de meeste gemeten immuunmediatoren een laag detectieniveau. IFN gamma-niveaus waren onder de onderste detectielimiet in bijna de helft van de monsters, terwijl TNF alfa, CCL4 en TGF beta-niveaus onder de onderste detectielimiet waren in minder dan 1% van de monsters. Er was een sterke multicollineariteit zichtbaar voor de 20 gedetecteerde mediatorniveaus, zoals geïllustreerd door een heatmap.
Bij asymptomatische pasgeborenen geïnfecteerd met picornavirus, werd een opgereguleerd profiel waargenomen, voornamelijk bestaande uit type 1 immuunmediatoren, wat suggereert een immuunactiverende rol van koloniserende bacteriën en virussen in het vroegste deel van het leven. Er werd ook een associatie vastgesteld tussen de aanwezigheid van broers en zussen in het huishouden bij de geboorte en een specifieke Type 1 Type 17 gerichte mucosale immuunrespons, met bewijs voor correlatie van dit fenomeen met een in utero immuunprime-effect dat omgekeerd gecorreleerd is met de tijd sinds de laatste bevalling. Bovendien werden kinderen geboren van moeders die hoge versus placebo supplementen kregen gekenmerkt door een opregulatie van specifieke immuunmediatoren, wat suggereert dat Vitamine D een antibacteriële immuunrespons bevordert onafhankelijk van die geïnduceerd door virus, bacteriën, broers en zussen of maternale atopie.
Deze methode van microbemonstering kan ook worden gebruikt via een bronchoscoop, waardoor het mogelijk wordt om de immuunmediatoren in de lagere luchtwegen te bestuderen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mediatoren kunt meten in de niet-gestimuleerde luchtwegmucosa in vivo bij pasgeborenen en oudere kinderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een niet-invasieve techniek voor het bemonsteren van ongestoord mucosale bekledingsvloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het maakt de kwantificering mogelijk van in vivo-niveaus van eiwitmediatoren, zoals cytokinen en chemokinen, bij proefpersonen van alle leeftijden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijke vakgebied
- Ademhalingsziekten
- Immunologie
- Kindergeneeskunde
Achtergrond
- Deze methode bestudeert het lokale immuunprofiel van de luchtwegen zonder stimulatieprocedures.
- Het is toepasbaar op kinderlijke ademhalingsziekten zoals infecties, astma en allergie.
- De techniek maakt het mogelijk om lage niveaus van immuunmediatoren in niet-ge stimuleerde luchtwegmucosa in vivo te meten.
- Demonstratie van de procedure wordt uitgevoerd door Dr. Wolsk.
Doel van het onderzoek
- Om de immuunrespons in de luchtwegmucosa te onderzoeken.
- Om inzichten te verschaffen in kinderlijke ademhalingstoestanden.
- Om niet-invasieve bemonsteringstechnieken voor onderzoek te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Verzameling van mucosale bekledingsvloeistof uit de bovenste luchtwegen.
- Gebruik van vezelige gehydroxyleerde polyester filterbladen voor monsterverzameling.
- Observatie van symptomen van luchtweginfectie bij pasgeborenen.
- Kwantificering van cytokinen en chemokinen in de verzamelde monsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verzameling van mucosale bekledingsvloeistof zonder invasieve procedures.
- Vermogen om immuunmediatoren in vivo te meten.
- Inzichten in het immuunprofiel van kinderlijke patiënten.
- Mogelijke toepassingen in het begrijpen van ademhalingsziekten.
Conclusies
- De niet-invasieve bemonsteringsmethode is effectief voor het bestuderen van luchtwegimmuniteit.
- Deze techniek kan onderzoek naar kinderlijke ademhalingsgezondheid verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen uitbreiden op de bevindingen met betrekking tot immuunmediatoren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
