Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus
7 augustus 2017
Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.
Het algemene doel van deze bemonsteringsmethode voor slijmvliesvloeistof is het bestuderen van de lokale immuunsignatuur van de luchtwegen zonder dat stimulatieprocedures nodig zijn. Deze methode stelt u in staat om kernvragen te onderzoeken op het gebied van pediatrische luchtwegaandoeningen, zoals infecties, astma en allergie. De voordelen van deze methode zijn dat zeer lage concentraties immuunmediatoren in het ongestimuleerde slijmvlies van de luchtwegen in vivo gemeten kunnen worden.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Wolsk. Knip voor de afname van neonatale monsters eerst ten minste twee stroken van 3 bij 15 millimeter uit vezelige gehydroxyleerde polyester filtervellen. Plaats vervolgens de neonatus op een bed en noteer eventuele symptomen van een luchtweginfectie.
Gebruik vervolgens een pincet om in elk neusgat van de zuigeling een stukje filterpapier ongeveer één centimeter diep in het voorste gedeelte van de onderste neusmuschel in te brengen en geef de pasgeborene naar behoefte suikerwater voor comfort. Noteer eventueel niezen, aanhoudend huilen of epistaxis dat optreedt tijdens de bemonsteringsperiode. Na twee minuten absorptie worden de filterpapieren overgebracht naar een gelabelde buis voor onmiddellijke bewaring bij -80 °C.
De experimentele procedure wordt gedemonstreerd door Lisbeth Rosholm, een technicus in mijn laboratorium. Voor de kwantificering van immuunmediatoren in de luchtwegen worden tot 10 monsters uit opslag bij -80 °C op ijs geplaatst en worden hun identificatienummers genoteerd. Zodra de monsters zijn ontdooid, worden beide filterpapieren per proefpersoon ondergedompeld in 150 µL vers bereide buffer per filterpapier, aangevuld met één complete protease-inhibittor tablet per 25 mL bufferstockoplossing.
Breng de monsters over naar een plaatshaker bij 400 rpm gedurende vijf minuten. Breng de buffer en filterpapieren over naar de cups van individuele celluloseacetaat buisfilters. Centrifugeer de monsters om het gefilterde neusextract onderin de microcentrifugebuisjes te verzamelen.
Verwijder daarna de bekers en plaats de buisjes op ijs. Zet vervolgens aliquots van 150 µL van het neusextract over in afzonderlijke wells van storage plates met lage eiwitbinding en bewaar de platen bij -80 °C tot aan de analyse. Meet daarna de concentratie van de relevante nasale immuunmediatoren met een multiplexed array op basis van elektrochemiluminescentie met hoge gevoeligheid volgens de standaard assay-protocollen.
In deze representatieve analyse van 620 pasgeborenen vertoonden de meeste gemeten immuunmediatoren een laag detectieniveau. De IFN gamma-spiegels lagen in bijna de helft van de monsters onder de onderste detectiegrens, terwijl de spiegels van TNF alpha, CCL4 en TGF beta in minder dan 1% van de monsters onder de onderste detectiegrens lagen. Er was sprake van een sterke multicollineariteit voor de 20 gedetecteerde mediatorniveaus, zoals geïllustreerd door de heatmap.
Bij asymptomatisch met picornavirussen geïnfecteerde pasgeborenen werd een opgereguleerd profiel waargenomen, dat hoofdzakelijk bestond uit immuunmediatoren van type 1, wat wijst op een immuuntriggerende rol van koloniserende bacteriën en virussen in de vroegste fase van het leven. Er werd ook een associatie vastgesteld tussen de aanwezigheid van broertjes of zusjes in het huishouden bij de geboorte en een specifieke mucosaal immuunrespons gericht op type 1 en type 17, met bewijs voor een correlatie van dit fenomeen met een in utero immuunpriming-effect dat omgekeerd gecorreleerd is aan de tijd sinds de laatste bevalling. Daarnaast werden kinderen van moeders die hoge supplementen versus placebo's ontvingen gekenmerkt door een opregulatie van specifieke immuunmediatoren, wat suggereert dat vitamine D een antibacteriële immuunrespons bevordert, onafhankelijk van die welke wordt geïnduceerd door virussen, bacteriën, broertjes/zusjes of maternale atopie.
Deze methode van microsampling kan ook via een bronchoscoop worden toegepast, waardoor de immuunmediatoren in de onderste luchtwegen kunnen worden bestudeerd. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in het meten van mediatoren in het ongestimuleerde luchtwegslijmvlies in vivo bij neonaten en oudere kinderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een niet-invasieve techniek voor het bemonsteren van ongestoord slijmvliesvloeistof uit de bovenste luchtwegen. Hiermee kunnen in vivo-niveaus van eiwitmediatoren, zoals cytokinen en chemokinen, worden gekwantificeerd bij proefpersonen van alle leeftijden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Respiratoire aandoeningen
- Immunologie
- Pediatrie
Achtergrond
- Deze methode bestudeert de lokale immuunhandtekening van de luchtwegen zonder stimuleringsprocedures.
- Het is toepasbaar op pediatrische ademhalingsziekten zoals infecties, astma en allergie.
- De techniek maakt het mogelijk om lage concentraties immuunmediatoren in ongestimuleerd luchtwegslijmvlies in vivo te meten.
- De demonstratie van de procedure wordt uitgevoerd door Dr. Wolsk.
Doel van de studie
- Om de immuunrespons in het slijmvlies van de luchtwegen te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in pediatrische respiratoire aandoeningen.
- Om niet-invasieve bemonsteringstechnieken voor onderzoek te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van slijmvliesvloeistof uit de bovenste luchtwegen.
- Gebruik van vezelige gehydroxyleerde polyesterfiltervellen voor monsterverzameling.
- Observatie van symptomen van luchtweginfectie bij pasgeborenen.
- Kwantificering van cytokinen en chemokinen in de verzamelde monsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle afname van slijmvliesvloeistof zonder invasieve procedures.
- Mogelijkheid om immuunmediatoren in vivo te meten.
- Inzichten in het immuunprofiel van pediatrische patiënten.
- Potentiële toepassingen bij het begrijpen van respiratoire aandoeningen.
Conclusies
- De niet-invasieve bemonsteringsmethode is effectief voor het bestuderen van de immuniteit van de luchtwegen.
- Deze techniek kan het onderzoek naar de respiratoire gezondheid bij kinderen verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op de bevindingen met betrekking tot immuunmediatoren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze niet-invasieve bemonsteringsmethode voor slijmvliesvloeistof maakt directe kwantificering van in vivo immuunmediatoren in het slijmvlies van de bovenste luchtwegen mogelijk zonder stimulatie, wat een fysiologisch relevante weergave geeft van de immuunactiviteit in de luchtwegen. De techniek ondersteunt immuunprofilering in de vroege levensfase en longitudinale monitoring, wat mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van respiratoire therapieën faciliteert door genetische en omgevingsblootstellingen te koppelen aan immuunfenotypen. De toepassing ervan bij neonatale en pediatrische cohorten biedt voorspellende waarde voor endotypering en het monitoren van ziekteprogressie, in het bijzonder in de context van astma, allergieën en infectieziekten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het meten van baseline- en geïnduceerde spiegels van immuunmediatoren in ongestimuleerd slijmvliesweefsel.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare, minimaal invasieve matrix voor functionele targetvalidatie in pediatrische populaties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door correlatie van mediatorprofielen met klinische fenotypen, zoals asymptomatische virale infectie en effecten van blootstelling via broers en zussen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert geëlueerde eiwitmonsters die compatibel zijn met hooggevoelige elektrochemiluminescentie-multiplex-arrays voor kwantitatieve immuunprofilering.
- Standaardisatie: Maakt gebruik van consistente absorptie- en elutieprotocollen voor filterpapier om een reproduceerbare terugwinning van analyten over verschillende proefpersonen en tijdstippen te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Aantoonbare haalbaarheid in grote neonatale cohorten (n=620), wat high-throughput screening-applicaties in epidemiologische en interventionele studies ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt longitudinale bemonstering mogelijk van de geboorte tot in de kindertijd, waarbij immuunsignaturen uit de vroege levensfase worden gekoppeld aan latere uitkomsten van luchtwegaandoeningen.
- Afstemming van biomarkers: Detecteert upregulatie van type 1 en type 17 immuunmediatoren bij asymptomatisch met picornavirus geïnfecteerde neonaten, wat wijst op bruikbaarheid bij het identificeren van immuunendotypen.
- Mechanische risicoreductie: Toont associaties aan tussen supplementatie van vitamine D bij de moeder en antibacteriële immuunresponsen, wat bijdraagt aan de prioritering van targets voor immunomodulerende interventies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fase van discovery biology doordat deze directe meting van immuunmediatoren in vivo mogelijk maakt, wat bijdraagt aan de selectie van targets en de verduidelijking van signaalpaden voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van immuunpadactivatie in slijmvliesweefsel zonder ex vivo manipulatie of stimulatie-artefacten.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde eluaten die geschikt zijn voor multiplex immunoassay-uitlezingen, wat vergelijkende analyses tussen behandelings- of blootstellingsgroepen vergemakkelijkt.
- Analytica: Genereert kwantitatieve mediatorniveaus die statistische beoordeling van collineariteit, activiteit van het immuunnetwerk en fenotype-associaties mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt neonatale immuunprofielen met respiratoire symptomen in de kindertijd en omgevingsblootstellingen, ter ondersteuning van risicogestratificeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vertegenwoordigt een platformcompatibele bemonsteringstechniek die toepasbaar is op diverse modellen van respiratoire aandoeningen en therapeutische modaliteiten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door endogene immuunactiviteit in de natuurlijke mucosale micro-omgeving vast te leggen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde procedures voor collectie, elutie en opslag, waardoor pre-analytische variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door immunomodulerende mechanismen te koppelen aan immuunsignaturen uit de vroege levensfase, wat het biologische risico in een laat stadium binnen respiratoire programma's vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van aangetoonde effecten op mucosale immuunpaden in relevante, longitudinale humane modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist training in de anatomie van de neonatale luchtwegen en een zachte bemonsteringstechniek om het comfort van de proefpersoon en de integriteit van het monster te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot ultrafiltratiebuisjes, plaatshakers en een infrastructuur voor elektrochemiluminescentie-immunoassay voor de detectie van analyten.
- Vereist gestandaardiseerde bufferbereiding met protease-remmers om degradatie van mediatoren tijdens de extractie te voorkomen.
- Vereist aanpassing van de bemonsteringsduur of filtergrootte wanneer dit wordt toegepast op oudere kinderen of alternatieve mucosale locaties.
- Beperkt door de abundantie van analyten, waarbij sommige mediatoren zich vaak onder de detectielimiet bevinden, wat optimalisatie van de assay-gevoeligheid voor targets met een lage expressie noodzakelijk maakt.
