Voorspellen van genstyling door middel van de spatiotemporale controle van siRNA-vrijgave van foto-responsieve polymere nanocarriers

Het algemene doel van deze methoden is om de voorspelling van de efficiëntie van door kleine interfererende RNA gemedieerde gensilencing mogelijk te maken en om controle mogelijk te maken over de resulterende eiwitexpressieniveaus, op een ruimtelijk-tijdelijke manier. Deze methode kan structuurfunctierelaties en stimuliresponsieve afgiftevoertuigen verduidelijken. Betere controle over binding versus afgifte kan translationele platforms en geneesmiddelontdekking, evenals technologieën voor regeneratieve geneeskunde, ontsluiten.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de veranderingen in genexpressie kunnen worden gecontroleerd en voorspeld op basis van eenvoudige siRNA-afgifte-assays en kinetisch modelleren. Hoewel deze methoden gebruikmaken van nieuwe foto-responsieve polymeren, kan deze reeks assays gemakkelijk worden aangepast om de grote verscheidenheid aan andere stimuli-responsieve systemen te testen. Om te beginnen, bereid een oplossing van 32 microgram per milliliter siRNA voor door siRNA toe te voegen aan een 20 micromolaire HEPES-oplossing bij een pH van zes.

Bereid vervolgens een polymeeroplossing voor door opgeloste mPEG-blok-polyAPN BMA-polymeren toe te voegen aan een 20 millimolaire HEPES-oplossing bij een pH van zes. Om een concentratie van 220 microgram per milliliter te bereiken, zal deze concentratie resulteren in een N tot P-verhouding van vier, wat betekent dat er vier keer zoveel aminegroepen op het polymeer zijn als fosfaatgroepen op siRNA. Voeg vervolgens de polymeeroplossing druppelsgewijs toe aan een gelijk volume van de siRNA-oplossing, terwijl je voorzichtig mengt op een vortexmachine.

Ga door met voorwerpen op de vortex gedurende 30 seconden na toevoeging van het polymeer. Bewaar vervolgens de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg de STS-oplossing druppelsgewijs toe aan elke nanocarrier-oplossing terwijl je voorzichtig mengt op een vortexmachine.

Ga door met voorwerpen op de vortex gedurende 30 seconden na SDS-editie. Centrifugeer de monsters bij 3.000 Gs gedurende vijf seconden, bewaar vervolgens de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Kalibreer en stel een UV-laser in met een 365 nanometer filter tot een intensiteit van 200 watt per vierkante meter.

Snij vervolgens een gat in een rubberen afdichtring, plaats de rubberen afdichtring op een gewassen en gedroogd glasplaatje. Pipet de nanocarrier SDS-oplossing op het glasplaatje binnen het gat van de rubberen afdichtring. Laad een overmaat aan oplossing op het glasplaatje, terwijl je contact met de rubberen afdichtring vermijdt.

Plaats het tweede glasplaatje op de afdichtring. Om luchtbellen te voorkomen, plaats je één uiteinde van het glasplaatje eerst neer en verlaag je vervolgens langzaam het andere uiteinde. Bevestig binderclips aan elke kant van de glazen kamer om deze dicht te houden.

Belicht de monsters gedurende de gewenste tijd, met behulp van de UV-laser met de 365 nanometer filter op een intensiteit van 200 watt per vierkante meter. Verwijder de binderclips en open de kamer. Pipet vervolgens 25 microliter van de bestraalde nanocarrier SDS-monsters op microcentrifugebuisjes.

Bewaar de oplossingen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg vijf microliter van de laadbufferoplossing toe aan 25 microliter van elk nanocarrier SDS-monster. Bewaar de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Laad vervolgens 30 microliter van elk nanocarrier SDS-monster in een 2% agarosegel, vooraf gekleurd met ethidiumbromide. Laat de gel in het donker draaien bij 100 volt gedurende 30 minuten. Beeld de gel af, met behulp van een gelbeeldsysteem met ethidiumbromide filters.

Bewaar de gelbeeldbestanden en ga verder met intensiteitskwantificering van de buiging zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder de stukjes papier van een dubbelzijdige kleefruimte om het kleefoppervlak bloot te leggen. Bevestig de ruimte op een glazen dekglas.

Pipet de nanocarrier SDS-oplossing op het dekglas. Plaats vervolgens een vooraf gewassen glasplaatje bovenop het dekglas met het gat van de kleefruimte, gecentreerd rond het monster. Duw op het glasplaatje om ervoor te zorgen dat het glasplaatje en het dekglas goed zijn bevestigd en een afdichting vormen.

Gebruik een confocale microscoop met een 40-voudige waterimmersie, aperchromale objectief, met een numerieke opening van 1,2 voor FCS-metingen. Gebruik het juiste excitatielaserkanaal om ten minste 30 metingen van 10 seconden elk per monster te verzamelen. Voer vervolgens de siRNA-afgiftegegevens van FCS in een kinetisch model in om gensilencingreacties te voorspellen, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Om in-vitro siRNA-afgifte voor te bereiden, voeg eerst twee milliliter celsuspensie toe aan elke put van de zes-puttenplaat. Laat de cellen 24 uur in de incubator hechten en herstellen. Na het wassen van de cellen met fosfaatgebufferd zout, bereid ze voor op transvectie door 1,5 milliliter serum- en antibioticumvrij transvectiemedium toe te voegen.

Voeg vervolgens 25 microliter nanocarrieroplossing toe, die 30 picomol siRNA bevat, aan elke put. Pipet voorzichtig het medium op en neer om te mengen. Plaats de cellen gedurende drie uur in de incubator.

Verwijder het transvectiemedium en was elke put met PBS. Voeg vervolgens één milliliter gesupplementeerd groeimedium toe en plaats de cellen in de incubator om 30 minuten te herstellen. Om de cellen voor te bereiden op behandeling met een fotostimulus, verwijder het gesupplementeerde groeimedium.

Voeg vervolgens één milliliter transvectiemedium toe aan elke put. Nadat de UV-laser is gekalibreerd zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats de cellen op een hotplate ingesteld op 37 graden Celsius. Verwijder het deksel van de zes-puttenplaat.

Belicht de cellen van bovenaf de plaat gedurende de gewenste tijd, met behulp van de UV-laser met een 365 nanometer filter op een intensiteit van 200 watt per vierkante meter. Verwijder het transvectiemedium en vo