Voorspellen van genstyling door middel van de spatiotemporale controle van siRNA-vrijgave van foto-responsieve polymere nanocarriers

Het algemene doel van deze methoden is om de voorspelling van de efficiëntie van gen-silencing via small interfering RNA mogelijk te maken en de controle over de resulterende eiwitexpressieniveaus in een spatio-temporele context te vergemakkelijken. Deze methode kan structuur-functierelaties en stimuli-responsieve afgiftedragers verduidelijken. Een betere controle over binding versus afgifte kan de weg vrijmaken voor transleerbare platforms en geneesmiddelenontwikkeling, alsof voor technologieën in de regeneratieve geneeskunde.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat veranderingen in genexpressie kunnen worden gecontroleerd en voorspeld op basis van eenvoudige siRNA-vrijgave-assays en kinetische modellering. Hoewel deze methoden gebruikmaken van innovatieve fotoreactieve polymeren, kan deze reeks assays gemakkelijk worden aangepast om een breed scala aan andere stimulus-responsieve systemen te testen. Begin met het bereiden van een siRNA-oplossing van 32 µg/mL door siRNA toe te voegen aan een 20 µM HEPES-oplossing bij pH 6.

Bereid vervolgens een polymeeroplossing voor door opgeloste mPEG block polyAPN BMA-polymeren toe te voegen aan een 20 millimolaire HEPES-oplossing bij pH zes. Om een concentratie van 220 µg/mL te bereiken, wat zal resulteren in een N/P-ratio van vier, wat betekent dat er vier keer zoveel aminegroepen op het polymeer aanwezig zijn als fosfaatgroepen op het siRNA. Voeg vervolgens de polymeeroplossing druppelsgewijs toe aan een gelijk volume van de siRNA-oplossing, terwijl dit voorzichtig wordt gemengd met een vortexmixer.

Vortex na toevoeging van het polymeer nog 30 seconden. Incubeer de monsters vervolgens 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Voeg de STS-oplossing druppelsgewijs toe aan elke nanodrageroplossing terwijl er voorzichtig wordt gemengd op een vortexmixer.

Vortex na toevoeging van SDS nog eens 30 seconden. Centrifugeer de monsters bij 3 000 Gs gedurende vijf seconden en incubeer de monsters vervolgens 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Kalibreer een UV-laser met een 365 nanometer filter en stel deze in op een intensiteit van 200 watt per vierkante meter.

Snijd vervolgens een gat in een rubberen pakking en plaats de rubberen pakking op een gewassen en gedroogde glazen objectglas. Pipetteer de nanodrager SDS-oplossing op het objectglas in het gat van de rubberen pakking. Breng een overmaat aan van de oplossing op het objectglas, waarbij contact met de rubberen pakking wordt vermeden.

Plaats het tweede objectglas bovenop de objectglasafdichting. Om de vorming van luchtbellen te voorkomen, plaatst u eerst één uiteinde van het glasglas neer en laat u vervolgens het andere uiteinde langzaam zakken. Bevestig aan weerszijden van de glaskamer klemmen om deze stevig gesloten te houden.

Bestraal de monsters gedurende de gewenste tijd met de UV-laser met het 365 nanometer filter bij een intensiteit van 200 watts per square meter. Verwijder de klemmen en open de kamer. Pipetteer vervolgens 25 microliters van de bestraalde nanocarrier SDS-monsters in microcentrifugebuisjes.

Incubeer de oplossingen 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Voeg 5 µL van de loading buffer-oplossing toe aan 25 µL van elk nanocarrier SDS-monster. Incubeer de monsters 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Laad vervolgens 30 µL van elk nanocarrier SDS-monster in een 2% agarosegel, vooraf gekleurd met ethidiumbromide. Laat de gel in het donker lopen bij 100 V gedurende 30 minuten. Maak een afbeelding van de gel met een gel-imagingsysteem voorzien van ethidiumbromidefilters.

Sla de gelafbeeldingsbestanden op en ga over tot de kwantificering van de bandintensiteit zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder de stukjes papier van een dubbelzijdige kleefspacer om het kleefoppervlak bloot te leggen. Bevestig de spacer aan een glazen dekglas.

Pipetteer de nanodrager-SDS-oplossing op het dekglas. Plaats vervolgens een vooraf gewassen glazen objectglas bovenop het dekglas, waarbij het gat van de adhesieve spacer gecentreerd rond het monster wordt geplaatst. Druk op het objectglas om ervoor te zorgen dat het objectglas en het dekglas goed aan elkaar hechten en een afdichting vormen.

Gebruik voor FCS-metingen een confocale microscoop met een 40-voudige water-immersie apochromatische objectief met een numerieke apertuur van 1,2. Gebruik het juiste excitatielaserkanaal om per monster ten minste 30 metingen van elk 10 seconden te verzamelen. Voer vervolgens de siRNA-releasegegevens van de FCS in een kinetisch model in om gen-silencingresponsies te voorspellen, zoals gedetailleerd beschreven in het tekstprotocol.

Voor de voorbereiding van in-vitro siRNA-afgifte wordt eerst twee milliliter celсусpensie aan elke put van de zes-putsplaat toegevoegd. Laat de cellen 24 uur in de incubator hechten en herstellen. Na het wassen van de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing worden ze klaargemaakt voor transfectie door het toevoegen van 1,5 milliliter serum- en antibioticavrij transfectiemedium.

Voeg vervolgens 25 µL nanocarrier-oplossing toe, die 30 pmol siRNA bevat, aan elke put. Pipetteer het medium voorzichtig op en neer om te mengen. Plaats de cellen gedurende drie uur in de incubator.

Verwijder het transfectiemedium en was elke put met PBS. Voeg vervolgens één milliliter aangevuld groeimedium toe en plaats de cellen gedurende 30 minuten in de incubator om te herstellen. Verwijder het aangevulde groeimedium om de cellen voor te bereiden op behandeling met een fotostimulus.

Voeg vervolgens één milliliter transvectiemedium toe aan elke well. Nadat de UV-laser is gekalibreerd zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de cellen geplaatst op een warmteplaat die is ingesteld op 37 °C. Verwijder de afdekplaat van de zes-wells plaat.

Bestraal de cellen van bovenaf via de plaat gedurende de gewenste tijd, met gebruik van de UV-laser met een 365 nanometer filter bij een intensiteit van 200 watts per square meter. Verwijder het transvectiemedium en voeg twee milliliters aangevuld groeimedium toe. Plaats de cellen in de incubator tot aan verdere analyse.

Om een fotomasker voor te bereiden dat 365 nanometer licht volledig blokkeert en reflecties minimaliseert, snijdt, ponst en/of freest u eerst de gewenste vorm in het fotomasker. Plak het fotomasker op de bodem van de zeswellenplaat, waarbij het patroon gecentreerd is op de well met de cellen en de antireflecterende zijde naar de plaat is gericht. Plaats twee ringstatieven op ongeveer 25 meters afstand van elkaar en bevestig aan elk ringstatief een platform, zodat de platforms op gelijke hoogte staan.

Hang de celplaat tussen de twee standaarden door de plaat op de platforms te plaatsen. Bestraal de cellen vanaf onder het monster gedurende de gewenste tijd, met gebruik van een UV-laser met een filter van 365 nanometer, bij een intensiteit van 200 watt per vierkante meter. Verwijder het transvectiemedium en voeg twee milliliters aangevuld groeimedium toe.

Plaats de cellen vervolgens in de incubator om gedurende ten minste 24 uur te herstellen. Beeld de cellen af met fluorescentiemicroscopie zoals eerder beschreven. Hier wordt een voorbeeld getoond van eenvoudige kinetische modellering van de dynamiek van gensilencing.

Het model werd uitgevoerd om de concentraties van mRNA, eiwit en siRNA te voorspellen als functie van de tijd na foto-geïnduceerde siRNA-vrijgave. De relatieve hoeveelheden siRNA die werden vrijgegeven na verschillende lichtdosissen, werden ingevoerd als de initiële siRNA-concentratie in het kinetische model. De resulterende modelvoorspellingen voor de eiwitexpressieniveaus waren in overeenstemming met de experimenteel vastgestelde expressieniveaus die via western blotting waren verkregen.

Voor visualisatie werden GFP-expresserende cellen behandeld met GFP-gerichte siRNA en werd vóór bestraling een ringvormig fotomasker op de plaat geplaatst om een circulair patroon te genereren. Cellen die werden beschermd tegen het licht vertoonden een fluorescentie-intensiteit die niet te onderscheiden was van controlemonsters die niet waren behandeld met siRNA en licht. Echter, bijna alle cellen binnen het circulaire patroon vertoonden geen GFP-expressie, wat duidt op een efficiënte afgifte van siRNA en gene knockdown.

Bovendien is het gebruik van licht een trigger voor genexpressie, die op cellulaire lengteschalen kan worden beheerst. Samenvattend maakt deze methode de snelle bepaling van bestralingscondities mogelijk om de afgifte van siRNA spatio-temporeel te beheersen en gen-silencing a priori te voorspellen. Het toepassen van dit protocol zal helpen bij het verduidelijken van de structuur-functierelaties die de stabiliteit en effectiviteit van nanodragers bepalen.

Deze techniek kan toepassingen mogelijk maken in de regeneratieve geneeskunde waarbij spatio-temporele controle over genexpressie vereist is. Deze formuleringen zijn bovendien zeer geschikt voor de behandeling van gelokaliseerde aandoeningen zoals huidkanker, evenals voor dermatologische aandoeningen.