Middelgrote voorbereiding van Drosophila Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Het algemene doel van dit experiment is om een eenvoudige en goedkope aanpak te bieden voor het verzamelen van Drosophilia-embryo's op middelgrote schaal. En het voorbereiden van eiwitextracten die kunnen worden gebruikt in downstream Proteomics-toepassingen, zoals affiniteitszuivering en massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celsignalering en ontwikkelingsbiologie.

Bijvoorbeeld, hoe specifieke eiwit-eiwitinteracties cellulaire communicatie uitvoeren tijdens de ontwikkeling van een organisme. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en goedkope methode is om een Drosophila-embryo-lysat te genereren. Dat kan worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals eiwitaffiniteitszuivering.

Traditioneel verzamelen onderzoekers Drosophila-embryo's in zeer grote populatiekooien. Maar we presenteren een gebruiksvriendelijke procedure om embryo's te verzamelen in middelgrote kooien die eenvoudig in elk lab kunnen worden opgezet. Na het voorbereiden van vijf liter containers en het snijden van 25 bij 25 centimeter vierkante nylon gaas, plaats het gaas over de container en druk met het deksel naar beneden.

Zorg ervoor dat het gaas strak zit en dat het deksel niet schuin staat. De kooi is nu klaar om te worden gevuld met vliegen. Na de voorbereiding van een liter plastic potten en 18 bij 18 centimeter nylon gaas vierkantjes, plaats het gaas over de bovenrand van de pot en schroef het deksel vast om het strak te maken.

Zorg ervoor dat het gaas strak zit en dat het deksel niet schuin staat. Versterk de transgene vlieglijnen die het getypeerde eiwit van belang dragen. En zet de flessen om de twee dagen over tot er 25 tot 30 flessen voor elke vlieglijn zijn verzameld.

Versterk een controlestam op een vergelijkbare manier. Verwarm vervolgens appelsapplaten tot kamertemperatuur. Verspreid vervolgens met een behandschoende vinger wat natte gistpasta in het midden van de platen.

Maak een ongeveer zes centimeter cirkel voor een 15 centimeter plaat. En een vier centimeter cirkel voor een 10 centimeter plaat. Na het verdoven van de vliegen en het overbrengen naar de voorbereide kooien met het gaas naar beneden, bedek de kooien met appelsappenplaten.

Laat de vliegen wakker worden. Draai vervolgens de kooien om en incubeer de vliegen gedurende twee tot drie dagen bij kamertemperatuur. Verwissel de platen twee keer per dag, door de kooi ondersteboven te draaien, en terwijl u de plaat tegen de kooi houdt, verwijder het plakband van de plaat.

Tik voorzichtig op de hele kooi op de werkbank en verwissel snel de oude plaat voor een nieuwe, probeer niet de vliegen te laten ontsnappen. Laat vliegen embryo's leggen op verse appelsappenplaten gedurende de nacht, of voor elke andere gewenste tijdsduur. De volgende ochtend markeert en weegt u de gaasmateriaal voor embryoverzameling.

Een voor elke gebruikte vlieglijn. Bereid 1x Lysis Buffer in een 50 milliliter buis met behulp van eerder gemaakte reagentia, door 40 milliliter water toe te voegen aan 10 milliliter van 5x geconcentreerd Lysis Buffer in een 50 milliliter buis. Voeg 50 microliter van een molair DTT toe met een eindconcentratie van één mili molair.

Meng goed en verdeel de oplossing tussen twee 50 milliliter buizen. Voeg in een van de buizen een protease-remmer tablet toe. Plaats de buis op een rotator bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten.

Terwijl de tablet zich oplost, begin met het verzamelen van de embryo's door de appelsappenplaten op de kooien te markeren met de genotypen van de gebruikte vlieglijnen. En verwissel de platen voor verse exemplaren. Voeg voldoende water toe om elke appelsapplaat te bedekken.

Vervolgens los je de embryo's voorzichtig los van de plaat met een zachte kwastje. Giet de embryo's in de eerder gewogen en gemarkeerde gaasmateriaal en laat het overtollige water weglopen. Dek het gaas vervolgens kort af met keukenpapier om het overtollige water te verwijderen.

Om de embryo's te dechorioneren, vul je een zes centimeter petrischaal half met 50% bleekmiddel. Bereid vervolgens twee grotere petrischalen voor met water. Dompel het gaasmateriaal met embryo's in 50% bleekmiddel gedurende 90 seconden.

Tik tijdens de incubatie een paar keer voorzichtig op het gaas om de embryo's in de bleekvloeistof te suspenderen. Aan het einde van de incubatie, gebruik water om het gaasmateriaal in elk van de twee schalen gedurende ongeveer 10 seconden te wassen. Gebruik vervolgens 18,2 megaohm centimeter water in een spuitfles om het gaasmateriaal grondig te spoelen, inclusief de zijden en de buitenkant.

Er mag geen geur van bleekmiddel worden gedetecteerd na een grondige wasbeurt. Dek het gaasmateriaal af met keukenpapier. Weeg vervolgens het gaasmateriaal, met de embryo's en trek het gewicht van het lege materiaal af.

Noteer het resulterende gewicht van de embryo's. Om embryo-extract te bereiden, voeg je één milliliter Lysis Buffer met proteaseremmers toe aan een Dounce-glashomogenisator en houd het op ijs. Breng vervolgens de embryo's van het gaasmateriaal over in de homogenisator.

Gebruik één milliliter Lysis Buffer om de resterende embryo's op het gaas af te wassen. En voeg de embryo's en buffer toe aan het materiaal in de homogenisator. Laat de embryo's vervolgens naar de bodem van de homogenisator zakken en aspireer voorzichtig het supernatant.

Voeg vervolgens Lysis Buffer met proteaseremmers toe aan de homogenisator, met als doel vijf tot zes milliliter Lysis Buffer per gram embryo's. Plaats vervolgens een los gemonteerde stamper om de embryo's te homogeniseren met vier tot zes bewegingen. Tijdens de eerste bewegingen zal er meer weerstand zijn.

Probeer de stamper in een continue beweging te houden om te voorkomen dat de oplossing spat. Schakel vervolgens over naar een goed passende stamper. En homogeniseer de embryo's met acht tot 10 bewegingen.

Incubeer de homogenisator op ijs gedurende 20 minuten. Breng vervolgens de