Methoden voor de extractie van endosymbionten uit de Whitefly Bemisia tabaci

Het algemene doel van dit experiment is het extraheren van endosymbionten uit kleine insecten voor verdere experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de entomologie en de macrobiologie, omdat de meeste endosymbionten niet in vitro kunnen worden gekweekt. De methode om voldoende hoeveelheden bacteriën te isoleren voor verdere experimenten is erg belangrijk.

Het grote voordeel van deze techniek is dat we gemakkelijk bacteriële endosymbionten van witte vliegen kunnen isoleren. Dit kan ook worden toegepast op de isolatie van endosymbionten uit andere insecten zoals bladluizen, planthoppers en tripsen. Om te beginnen, verzamel een volwassen witte vlieg en homogeniseer deze in 30 microliters lysisbuffer.

Incubeer het homogenaat gedurende één uur op 65 graden Celsius. Vervolgens 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Gebruik witte vlieg DNA en mitochondriale cytochroom oxidase 1 primers om 25 microliter PCR-reacties voor te bereiden met behulp van de volgende reagentia.

Voer vervolgens de PCR-reacties uit met behulp van het hier getoonde programma. Gebruik vervolgens een DNA gel extractiekit volgens het aanbevolen protocol om het PCR-product te reinigen. Voer vervolgens sequentie-analyse uit volgens het tekstprotocol.

Om specifieke genen van elke endosymbiont binnen de witte vlieg te versterken, voer PCR uit op witte vlieg DNA. Volgens een eerder gepubliceerd protocol, onderwerp het versterkte monster aan agarosegelelektroforese en sequencing om de bacteriesoorten binnen de witte vlieg te bepalen en het specifieke gen van elke bacterie te identificeren. Om het bacterioom van de witte vlieg te dissecteren en zuiveren, voeg 100 microliters 1x PBS-oplossing toe aan een microscoopglasplaat.

Vervolgens, pluk derde of vierde stadium nimfen van katoenbladeren. En dompel ze onder in de PBS. Gebruik onder een microscoop fijne entomologische naalden om de bacteriomen uit het lichaam van de witte vlieg te trekken.

Wees voorzichtig bij het isoleren van het bacterioom, omdat het klein en kwetsbaar is. Snijd voorzichtig een gat in één kant van de nimfe en druk lichtjes op de andere kant om de bacteriomen eruit te laten komen. Monteer vervolgens een 20 microliter microloader op een 0,5 tot 10 microliter pipet en extract het individuele bacterioom uit de PBS in de microloader.

Was het bacterioom om de besmetting van andere witte vliegweefsels te elimineren door het bacterioom in de PBS te pipetten en het te extraheren. Herhaal de wasbeurt drie keer. Het is sterk aanbevolen om de was te herhalen om zoveel mogelijk besmetting te elimineren.

Pipet onmiddellijk het gewassen bacterioom in een centrifugeerbuisje met 60 microliters PBS. Filter de geassembleerde bacterioom door een vijf micrometer filtermembraan. Herhaal de filtratie meerdere keren om de gemengde vloeistof grondig door het membraan te bewegen.

Om het filtraat te versterken, bereid buffer D2 voor om te gebruiken met het aanbevolen protocol voor amplificatie van genomisch DNA uit bloed of cellen met enkele wijzigingen. Voeg direct 1,5 microliters filtraat toe aan een centrifugeerbuisje gevolgd door 1,5 microliters buffer D2. Meng goed en incubeer het monster op ijs gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 1,5 microliters stopoplossing toe.

Voeg 15 microliters van de reactiebuffer en één microliter DNA-polymerase toe en meng voorzichtig. Incubeer het mengsel gedurende 16 uur bij 30 graden Celsius gevolgd door drie minuten bij 65 graden Celsius. Voer direct PCR uit op het versterkte filtraat met specifieke primers ontworpen voor bacteriën om de bacteriesoorten te bevestigen.

Voer ook PCR uit om te bevestigen of er besmetting is van het gastheergenoom door primers te gebruiken voor de witte vlieg genen beta-actine en EF1 volgens de eerder gepubliceerde methode. Voer ten slotte meta genoomsequencing uit volgens het tekstprotocol. In deze figuur zijn katoen voor het kweken van witte vliegen en verschillende ontwikkelingsstadia van witte vliegen getoond.

Inclusief een volwassen en eerste, tweede en vierde stadium nimfen. FISH-analyse van de endosymbionten Portiera en Hamiltonella binnen de vierde stadium nimfe van MEAM1 wordt hier getoond. Er wordt overlapping van de twee bacteriën waargenomen en beide zijn beperkt tot de bacteriocyten van de witte vlieg.

Hier zijn de transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van de Portiera endosymbiont van de witte vlieg te zien, wat aangeeft dat Portiera mogelijk zijn celwand verliest. Na het sequencen en opruimen van de besmettingsgegevens voor adapters en duplicaties, werd het volledige genoom van de obligate symbiont Portiera verkregen. Dit resulteerde in een circulair genoom van 358.232 basenparen.

Bovendien werd een conceptgenoom van Hamiltonella verkregen dat 138 contigs bevatte die werden geassembleerd tot 89 scaffolds op basis van paired end relaties. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 20 uur worden uitgevoerd als het goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de monsters te beschermen tegen besmetting door omgevingsbacteriën.

Na dit proces kunnen andere analyses zoals RA-sequentie en massabacterioom worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden zoals genexpressie en metabolisme van endosymbionten. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van entomologie en microbiologie om de functie van endosymbionten in insecten of geleedpotigen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u symbionten uit insectenbacteriomen kunt extraheren.

Vergeet niet dat het werken met sommige reagentia gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.