Name: Methoden voor de extractie van endosymbionten uit de Whitefly Bemisia tabaci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer endosymbionten te isoleren uit Bemisia tabaci voor entomologisch onderzoek. Deze methode omvat dissectie, filtratie en DNA-amplificatie om bacteriële symbiose te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiële steun voor deze studie is verstrekt door het Nationale Key Research and Development Program (2016YFC1200601) en de National Natural Science Foundation of China (31390421).

1. Witte vliegende en cryptische soorten identificatie <ol><li> Onderhoud van de wittevliegsoorten op katoen Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) in kooien onder standaard omstandigheden van 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% vochtigheid en 14 uur licht: 10 uur donker regime. </li><li> Verzamel een individuele witte witte vlinder en homogeniseer in 30 μl lysisbuffer (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [gew./vol.] Gelatine, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / ml Proteïnase K). </li><li> Incubeer het homogenaat bij 65 ° C gedurende 1 uur en dan 100 ° C gedurende 10 minuten. OPMERKING: De incubatietijd bij 65 ° C kan eventueel worden verhoogd. De incubatietijd bij 100 ° C moet kritisch gecontroleerd worden om Proteïnase K voldoende te inactiveren en DNA-schade te vermijden. </li><li> Voer polymerase kettingreactie (PCR) uit met behulp van whitefly DNA (verkregen in sectie 1.3) gebaseerd op mitochondriale cytochroom oxidase I primers. COI-F: 5&#39;-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 &#39; COI-R: 5&#39;-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 &#39; <ol><li> Voer de PCR reacties uit in een eindvolume van 25 μl die 1 U Taq DNA polymerase, 2,5 μL 10x buffer, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM van elke primer en 2 μL whitefly DNA bevat. </li><li> Gebruik de volgende PCR-procedure: initiële denaturatie 95 ° C gedurende 3 minuten gevolgd door 35 cycli van 95 ° C gedurende 45 s (denaturatie), 50 ° C gedurende 45 s (gloeien) en 72 ° C gedurende 1 min (verlenging) en Nog eens 10 minuten bij 72 ° C voor verdere verlenging. </li></ol></li><li> Reinig het PCR-geamplificeerd product met behulp van een DNA-extractie kit met het aanbevolen protocol. </li><li> Volg de gesuiverde DNA-monsters met een DNA-monster sequencing systeem volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Analyseer de sequenties met behulp van het Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) om de cryptische soorten whitefly te identificeren en voorkomt besmetting van andere species. </li></ol> 2. Endosymbiont-identificatie en lokalisatie <ol><li> Voer PCR uit op het whitefly-DNA (verworven in stap 1.3) om de specifieke genen van elke endosymbiont binnen de witte vlinder te amplificeren (het PCR-recept wordt beschreven in sectie 1.4 en PCR-procedures en primers staan ​​vermeld in tabel 1 ). </li><li> Onderwerp het geamplificeerde monster om agarose gelelektroforese volgens agarose gel-elektroforese volgens het eerder gepubliceerde protocol 20 (1% agarosegel, Tris-acetaat-EDTA als lopende buffer, spanning 5 V / cm) te identificeren om het specifieke gen van elke bacterie te identificeren. </li><li> Herstel en sequentieer elke band om de bacteriële species binnen witvlieg te bepalen (zie secties 1.5-1.7). </li><li> Voer fluorescentie in situ hybridisaties (FISH) op whiteflies uit om de locatie van endosymbionten te identificeren volgens het eerder gepubliceerde protocol 19 . OPMERKING: Verhoog de concentratie van de fluorescerende probes indien nodig. </li></ol&gt; 3. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) <ol><li> Dompel en fix whiteflies in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) die 2,5% [vol / vol] glutaraldehyde bevat gedurende 4 uur. </li><li> Was de monsters drie keer, 15 minuten per keer in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0). </li><li> Dompel en monteer de monsters opnieuw in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0), die 1% [wt / vol] OsO 4 gedurende 2 uur bevatten. </li><li> De monsters worden gedehydrateerd door een gegradeerde reeks ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% en 100%), 15 minuten per keer. </li><li> Vervolgens de monsters gedurende 20 minuten in 100% aceton dompelen. </li><li> Plaats de monsters in een mengsel van 100% aceton en 100% Spurrhars (1: 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Breng de monsters in een mengsel van 100% aceton en 100% Spurrhars (1: 3) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Vervoer en dompel de monsters in 100% Spurrhars (geïncubeerd bij 70 ° C) gedurende meer dan 9 uur. </li><li> Sectie de whitefly monsters door een micro te gebruikennaar mij. </li><li> Vlek de ultra dunne films (verworven in sectie 3.9) door onderdompeling in absolute uranylacetaat gedurende 5-10 minuten, gevolgd door onderdompeling in 50% alkalisch lood citraat gedurende nog eens 5-10 minuten. OPMERKING: De hoeveelheden reagentia gebruikt in sectie 3.1-3.10 zijn afhankelijk van de monsters. Zorg ervoor dat de monsters in de reagentia worden gedompeld. </li><li> Let op de monsters onder transmissie-elektronmicroscopie (15.000X) om de lokalisatie, vorm en grootte van bacteriën te bepalen voor verder gebruik (zie rubriek 4.6). </li></ol> 4. Whitefly Bacteriome Dissection and Purification <ol><li> Voeg 100 μl 1x PBS oplossing op een microscoopschuif. Kies 3 of 4 instar nimfen uit katoenbladeren en dompel ze in de PBS-oplossing. </li><li> Gebruik fijne entomologische naalden onder een stereomicroscoop en trek de bacteriomen uit het witvlieglichaam. <ol><li> Zet een gat voorzichtig aan de ene kant van de nimf en druk de ander iets opKant om de bacteriomen uit te laten. </li></ol></li><li> Monteer een 20 μL microloader (met de voorste eindvergroting om de grootte van bacteriome te ontmoeten) op een 0,5-10 μL pipet. Extract de individuele bacteriome uit de PBS oplossing in de microloader. </li><li> Was de bacteriome om de vervuiling van andere wittevliesweefsels te elimineren door de bacteriome in de PBS-oplossing te pipetteren en de bacteriome te extraheren. Herhaal drie keer. </li><li> Pipet de gewassen bacteriome onmiddellijk in een centrifugebuis die 60 μl 1x PBS-oplossing bevat. </li><li> Spuit de geassembleerde bacteriomen door een 5 μm filtermembraan (bepaald door bacteriën en nucleus van bacteriocyten in whitefly). Herhaal meerdere keren om de gemengde vloeistof door het filtermembraan grondig te bewegen. OPMERKING: Om een ​​beter resultaat van amplificatie en sequencing te bereiken, assembleer meer dan 100 bacteriomen. Vet het filtermembraan eerst door gebruik te maken van 1x PBS-oplossing om het verlies van bacteriën te verminderenBindend aan het membraan. </li></ol> 5. Versterking van Endosymbiont Genomes <ol><li> Versterk het filtraat (voornamelijk met endosymbionten van de whitefly) met behulp van een DNA-amplificatie kit door het aanbevolen protocol met enige wijziging. <ol><li> Kies het aanbevolen protocol van amplificatie van genomisch DNA uit bloed of cellen en berei buffer D2 op voor het volgende experiment. </li><li> Voeg 1,5 μl filtraat direct toe (zie rubriek 4.6) aan de centrifugebuis, gevolgd door 1,5 μl van de buffer D2 en meng goed. </li><li> Incubeer op ijs gedurende 10 minuten en voeg 1,5 μL van de stopoplossing toe. </li><li> Voeg 15 μl van de reactiebuffer en 1 μl van het DNA-polymerase toe en meng zachtjes. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 16 uur bij 30 ° C, gevolgd door 3 minuten bij 65 ° C. </li></ol></li><li> Voer PCR direct uit op het geamplificeerde filtraat (verdun de geamplificeerde monsters indien nodig) door gebruik te maken van specifieke primers ontworpen voor bacTeria om de bacterie soorten te bevestigen (zie paragraaf 2.1). </li><li> Voer PCR uit om te bevestigen of er sprake is van besmetting van gastheergenoom door gebruik te maken van whitefly gen beta-Actin en EF1 primers volgens de eerder gepubliceerde methode 21 (het PCR recept is beschreven in sectie 1.4). </li></ol> 6. Endosymbiont Metagenome Sequencing <ol><li> Onderwerp het geamplificeerde filtraat op een spectrofotometer en een fluorometer (volgens de instructies van de fabrikant) alvorens de kwaliteit van de monsters te bepalen en of de monsters voldoen aan de criteria voor sequencing. </li><li> Onderwerp de versterkte naar een genoom sequencer volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Buchner, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jobm.19670070219/abstract">Endosymbiosis of animals with plant microorganisms.</a> J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).</li>
<li>Sloan, D. B., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosymbiotic+bacteria+as+a+source+of+carotenoids+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Letters%22%5BJournal%5D)">Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies.</a> Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).</li>
<li>Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+pipientis%3A+microbial+manipulator+of+arthropod+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction.</a> Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).</li>
<li>Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1744-7917.2010.01396.x/abstract">Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype.</a> Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).</li>
<li>Hansen, A. K., Degnan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+expression+of+conserved+small+RNAs+in+small+symbiont+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes.</a> ISME J. 8, 2490-2502 (2014).</li>
<li>Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+evolution+of+heritable+bacterial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).</li>
<li>Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+endocellular+bacterial+symbiont+of+aphids+Buchnera+sp.+APS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS.</a> Nature. 407, 81-86 (2000).</li>
<li>Nikoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origin+of+insect-Wolbachia+nutritional+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).</li>
<li>Sloan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+histories+of+horizontal+gene+transfer+facilitated+extreme+reduction+of+endosymbiont+genomes+in+sap-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects.</a> Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+rice+pest+brown+planthopper+and+its+endosymbionts+reveal+complex+complementary+contributions+for+host+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation.</a> Genome Biol. 15 (12), 521(2014).</li>
<li>Campbell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+expansion+via+lineage+splitting+and+genomereduction+in+the+cicada+endosymbiont+Hodgkinia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).</li>
<li>Wilson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+insight+into+the+amino+acid+relations+of+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%2C+with+its+symbiotic+bacterium+Buchnera+aphidicola%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola.</a> Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).</li>
<li>Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+conservation+and+functional+constraint+on+intergenic+spacers+in+reduced+genomes+of+the+obligate+symbiont+Buchnera%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera.</a> PLoS Genet. 7 (9), e1002252(2011).</li>
<li>Nakabachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+160-kilobase+genome+of+the+bacterial+endosymbiont+Carsonella%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella.</a> Science. 314 (5797), 267(2006).</li>
<li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci%3A+a+statement+of+species+status%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).</li>
<li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li>
<li>Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+secondary+endosymbionts+among+different+putative+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).</li>
<li>Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+discovered+symbiont+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).</li>
<li>Kliot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridizations+%28FISH%29+for+the+localization+of+viruses+and+endosymbiotic+bacteria+in+plant+and+insect+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues.</a> J. Vis. Exp. (84), e51030(2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Rao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+reduction+and+potential+metabolic+complementation+of+the+dual+endosymbionts+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci.</a> BMC Genomics. 16 (1), 226(2015).</li>
<li>Thao, L. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li>
<li>Zhu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+and+comparison+of+the+Rickettsia+genomes+from+the+whitefly+Bemisia+tabaci+Middle+East+Asia+Minor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I.</a> Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).</li>
<li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+%28HomopteraAleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).</li>
<li>Zhang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+temporal+changes+of+primary+and+secondary+bacterial+symbionts+and+whitefly+host+fitness+following+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments.</a> Sci. Rep. 5, 15898(2015).</li>
<li>Shan, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+of+symbiont+density+and+host+fitness+after+rifampicin+treatment+in+a+whitefly+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex.</a> Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).</li>
<li>Zchori-Fein, E., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.bioone.org/doi/abs/10.1603/0013-8746(2002)095%5B0711:DOPAWB%5D2.0.CO%3B2">Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).</li>
<li>Thao, M. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li>
<li>Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+the+bacterial+symbiont+Cardinium+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods.</a> Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).</li>
<li>O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((116S+rRNA+phylogenetic+analysis+of+the+bacterial+endosymbionts+associated+with+cytoplasmic+incompatibility+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).</li>
<li>Nirgianaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).</li>
<li>Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chlamydiae+in+whiteflies+and+scale+insects%3A+endosymbionts+%27Candidatus+Fritschea+bemisiae%27+strain+Falk+and+%27Candidatus+Fritschea+eriococci%27+strain+Elm%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Micr%22%5BJournal%5D)">Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm.</a> Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Aangezien de endosymbionten in witte vliegen niet kunnen worden gekweekt in vitro, is dissectie en het samenstellen van bacteriocyten een effectieve manier om voldoende genetisch materiaal van endosymbionten te verkrijgen. Voorafgaand aan de dissectie moeten de soort van witte vlieg en de betrokken endosymbionten expliciet worden bevestigd. De witte vlieg B. tabaci is een soortencomplex met meer dan 35 morfologisch onderscheidbare soorten en verschillende cryptische soorten kunnen verschillende endosymb...

Bacteriën die een intieme symbiotische relatie met relatieve gastheren vormen zijn wijdverspreid bij geleedpotigen 1 . De endosymbionten zijn aangetoond dat ze aspecten van gastheren beïnvloeden, zoals voedingsmetabolisme, reproductie, reacties op milieu-stress 2 , 3 , 4 enz. , In bijna elke ontwikkelingsfase 5 . Het mechanisme dat de verenigingen ondersteunt, blijft echter grotendeels onbekend. Genomics heeft voorrang en belang bij het bestuderen van de potentiële functies en rollen van bacteriën. Enkele fundamentele informatie, dat wil zeggen de taxonomische status, functionele genen, metabolisme pathways, secretiesystemen, kan worden afgeleid uit genoomsequenties, die lichten op de potentiële rollen van symbionten in symbiose. Met de ontwikkeling van high-throughput sequencing is een groot aantal bacteriële genen sequenced wVerschillende functies onthulden 6 . Endosymbionten zijn van vitaal belang in hemipteranen, zoals bladluizen 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , bruine planthoppers 10 en cicaden 11 . Bijvoorbeeld , Buchnera in bladluizen , als de verplichte symbiont, is aangetoond dat zij betrokken zijn bij essentiële aminozuren biosynthese, samen met de genen van aphid-genoom 12 . Verder wordt ook transcriptie-regulering van Buchnera geopenbaard 13 . In psylliden wordt Carsonella sequenced en wordt het kleinste bacteriegenoom ooit gevonden 14 . Al deze kenmerken van endosymbionten zijn gebaseerd en afgeleid van de genoomsequenties. Omdat deze endosymbionen niet in vitro kunnen worden gekweekt, zijn verschillende benaderingen toegepast om adequate bacteriën te isoleren voor zeefuencing. In bladluizen worden endosymbionten geëxtraheerd door middel van centrifugeren en filtratie, en onderworpen aan verdere genomische en transcriptomische analyse 5 . In bruine planthoppers worden endosymbionten samen met het hele insectengenoom 10 getraceerd. Whitefly B. tabaci is een soort complex met meer dan 35 morfologisch onderscheiden soorten (cryptische soorten), waaronder twee invasieve soorten over de hele wereld binnengevallen en de landbouwproductie enorme schade hebben veroorzaakt 15 . Van de nota hebben endosymbionten binnen de B. tabaci- soorten belang in de ontwikkeling van de plagen 16 . Tot op heden zijn acht endosymbionten geïdentificeerd in de whitefly, waaronder de verplichte symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum, en zeven secundaire symbionten Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , &lt;Em&gt; Wolbachia, Fritschea en Hemipteriphilus gedefinieerd 17 , 18 . In tegenstelling tot de eerder beschreven hemipteranen, is de whitefly B. tabaci een extreem klein insect dat slechts 1 mm lang is. De meeste endosymbionten zijn beperkt tot bacteriocyten 19 (gespecialiseerde cellen die symbionten bevatten, die bovendien bacteriën vormen in B. tabaci ). Bovendien kunnen deze endosymbionen niet in vitro worden gekweekt. De enige manier om endosymbionten van B. tabaci te verkrijgen is om de bacteriome te ontleden. Er is echter moeilijkheid in de dissectie. Ten eerste, de breekbare bacteriome verbindt altijd met andere weefsels van de whitefly, die moeilijk te scheiden is. Ten tweede beperkt de kleine grootte van de whitefly de isolatie van genoeg bacteriomen. Ten derde, endosymbionts cluster in de bacteriome, waardoor het extreem ingewikkeld om een ​​enkele soort bacterie te verwerven. <p clAss = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier rapporteren we een eenvoudig en goedkoop protocol om whitefly endosymbionts te isoleren voor latere metagenome sequencing. Door dissectie, zuivering en amplificatie kan adequaat endosymbiont-DNA worden verkregen en kan de soort bacteriën worden bevestigd. Het beschreven protocol kan op soortgelijke wijze in andere geleedpotigen gebruikt worden.

<table><tbody><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R001A</td><td>inclusief rTaq, 10&times;Buffer en dNTP</td></tr><tr><td>Gel DNA extractie kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DNA monster sequencing systeem</td><td>ABI</td><td>ABI-3730XL</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie elektronenmicroscopie</td><td>Hitachi</td><td>H-7650 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L microloader</td><td>Eppendorf</td><td>F2771951</td><td></td></tr><tr><td>Filter houder</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr><tr><td>Filter membraan filter</td><td>Millipore</td><td>SMWP001300</td><td>5.0 &mu;m SMWP</td></tr><tr><td>REPLI-g UltraFast Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>150033</td><td>DNA amplificatie kit</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Genoom Sequencer</td><td>Illumina</td><td>Hiseq 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden voor de extractie van endosymbionten uit de whitefly<em&gt; bemisia tabaci</em

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacteriële symbionten vormen een intieme relatie met hun gastheren en geven in de meeste gevallen voordelen aan de gastheren. Genomische informatie is cruciaal om de functies en evolutie van bacteriële symbionten in hun gastheer te bestuderen. Aangezien de meeste symbionten niet in vitro kunnen worden gekweekt, zijn methoden om een ​​adequate hoeveelheid bacteriën te isoleren voor genoom sequencing zeer belangrijk. In de Whitefly Bemisia tabaci zijn een aantal endosymbionten geïdentificeerd en wordt voorspeld dat ze belangrijk zijn bij de ontwikkeling en voortplanting van de plaag door meerdere benaderingen. Het mechanisme van de verenigingen blijft echter grotendeels onbekend. Het obstakel komt ten dele uit het feit dat de endosymbionten in wittevlieg, die meestal in bacteriocyten worden vastgehouden, moeilijk zijn om van de gastheercellen te scheiden. Hier rapporteren we een stap-voor-stap protocol voor de identificatie, extractie en zuivering van endosymbionten uit de witte vlinder B. tabaci voornamelijk door dissectiAan en filtratie. Endosymbiont-monsters bereid volgens deze werkwijze, hoewel nog steeds een mengsel van verschillende endosymbiont-soorten, zijn geschikt voor latere genoomsequencing en analyse van de mogelijke rollen van endosymbionten in B. tabaci . Deze methode kan ook gebruikt worden om endosymbionten van andere insecten te isoleren.

De soort van het B. tabaci- complex van het Midden-Oosten-Azië Minor 1 (MEAM1) werd hier als voorbeeld genomen voor de beschrijving. Katoen voor het opgroeien van witvliegen en verschillende ontwikkelingsfasen van witvliegjes worden getoond in Figuur 1, waaronder een katoenplant, witte wittevlinder en de 1e, 2e en 4e instarnimf van witvlieg (de 3e instarnimf ziet er op als de 4e instarnimf ). Het was duidelijk dat de...

Hier presenteren wij een protocol om endosymbionten van de whitefly Bemisia tabaci te isoleren door dissectie en filtratie. Na amplificatie zijn de DNA monsters geschikt voor latere sequencing en studie van de mutualiteit tussen endosymbionten en whitefly.

Methoden voor de extractie van endosymbionten uit de Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Het algemene doel van dit experiment is het extraheren van endosymbionten uit kleine insecten voor verdere experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen vanuit het perspectief van de entomologie en de macrobiologie, aangezien de meeste endosymbionten niet in vitro gekweekt kunnen worden. Methoden die aantonen hoe adequate hoeveelheden bacteriën kunnen worden geïsoleerd voor verdere experimenten zijn zeer belangrijk.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we op eenvoudige wijze bacteriële endosymbionten van witte vliegen kunnen isoleren. Dit kan ook worden toegepast op de isolatie van endosymbionten uit andere insecten, zoals bladluizen, springhanen en tripsen. Begin met het verzamelen van een individuele volwassen witte vlieg en homogeniseer deze in 30 µL lysisbuffer.Incubeer het homogenaat één uur bij 65 °C. Daarna 10 minuten bij 100 °C. Bereid 25 µL PCR-reacties voor met witvlieg-DNA en mitochondriale cytochroomoxidase 1-primers met gebruik van de volgende reagentia.Voer vervolgens de PCR-reacties uit met het hier getoonde programma. Gebruik daarna een DNA-gel-extractiekit volgens het aanbevolen protocol om het PCR-product te zuiver

methods-for-extraction-endosymbionts-from-whitefly-bemisia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Sluipwesp (parasitaire) wespen vormen een belangrijke klasse van natuurlijke vijanden van veel insecten...

Een inleiding tot sluipwespen van<em&gt; Drosophila</em&gt; En de Antiparasite immuunrespons

Beter inzicht in en ons vermogen om veel van de insecten overgedragen plantenvirussen beheerder vereist het gebruik van de vector. Insect overdracht van plantenvirussen is een tritrofe interactie, en als zodanig vereist het manipuleren van insecten, virussen, en plant. Vectoren worden gekweekt in grote aantallen en gemanipuleerd op zodanige wijze dat een hoge mate van overdracht op testplanten verzekeren. De basisprincipes van het houden van en het manipuleren van de witte...

Zenden Plant Virussen gebruiken Wittevlieg

We beschrijven hier een eenvoudige fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze voor de lokalisatie van virussen en bacteriën in insecten en plantenweefsels. Dit protocol kan worden verlengd voor de visualisatie van mRNA in ganse berg en preparaten.

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

Leven tabellen toestaan van kwantificering van de bronnen en de tarieven van sterfte in de insectenbevolking en bijdragen aan het begrijpen, voorspellen en manipuleren van de populatiedynamiek in agro-ecosystemen. Methoden voor het uitvoeren en analyseren van de cohort gebaseerde leven tabellen in het veld voor een insect met sessiele onvolwassen levensstadia worden gepresenteerd.

Methodologie voor ontwikkeling van leven tabellen voor sessiele insecten in het veld met de wittevlieg, Bemisia tabaci, in katoen als een modelsysteem

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Deze paper meldt het protocol voor een snelle identificatie assay voor Bemisia tabaci gebaseerd op lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) technologie. Het protocol vereist minimale laboratorium opleiding en kan, daarom, ter plaatse op de punten van binnenkomst voor de plant invoer zoals zeehavens en luchthavens worden uitgevoerd.

Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

Wij presenteren een eenvoudige cytogenetische techniek met behulp van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om te bepalen van het tarief van de bevruchting en primaire sex-ratio van de haplodiploid invasieve plaag Bemisia tabaci.

Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek

We beschrijven een immunofluorescentie en kwantitatieve PCR-methode voor de lokalisatie en kwantificering van begomovirussen in insectenweefsels. Het immunofluorescentieprotocol kan worden gebruikt om virale en vectoreiwitten samen te lokaliseren. Het kwantitatieve PCR-protocol kan worden uitgebreid om virussen in hele wittevlieglichamen en met virussen geïnfecteerde planten te kwantificeren.

Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR

Hier beschrijven we twee protocollen: ten eerste om grote hoeveelheden niet-omhulde virusdeeltjes van honingbijen te vermeerderen, te extraheren, te zuiveren en te kwantificeren, inclusief een methode voor het verwijderen van honingbijpoppen en ten tweede om de effecten van virale infectie te testen met behulp van een zeer herhaalbare kooibioassay met hoge doorvoer.

Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder en een vervangende manier om hun entomopathogene activiteiten te evalueren met behulp van een Coleoptera-modelinsect. Deze methode is efficiënt en handig voor het verkennen van entomopathogene schimmelbronnen van houtborende insectenplagen in natuurlijke bossen.

Isolatie, gedragsidentificatie en pathogeniteitsbeoordeling van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder

Hier presenteren we een protocol voor het extraheren van gif uit Trichogramma dendrolimi met behulp van een kunstmatige gastheer gemaakt met polyethyleenfilm en aminozuuroplossing.

Gif extraheren uit de sluipwesp Trichogramma dendrolimi met behulp van een kunstmatige gastheer

Leer endosymbionten te isoleren uit Bemisia tabaci voor entomologisch onderzoek. Deze methode omvat dissectie, filtratie en DNA-amplificatie om bacteriële symbiose te bestuderen.

Methoden voor de extractie van endosymbionten uit de Whitefly

Meer video's verkennen