Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Het algemene doel van deze methodologie is om macroporeuze hydrogels te creëren met verschillende poriegroottes voor celkweektoepassingen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van 3D-celkweek te beantwoorden, zoals de principiële haalbaarheid van een nieuw hydrogelmateriaal voor 3D-celkweektoepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze methodologie is dat het een reeks technieken biedt om een nieuw materiaal te optimaliseren en aan te passen aan de vereisten van verschillende soorten cellen.

Begin door één milligram van het RGD-peptide of een gelijkwaardig celadhesief peptide te verdunnen in 100 microliter steriele water om de oplossing van 10 milligram per milliliter te verkrijgen. Vervolgens verwijdert u de bodem van een 96-wellplaat en vervangt deze door verwijderbaar plasticfolie. Meng 100 microliter BSA-stakoplossing en 100 microliter THPC-stakoplossing in de 96-wellplaat om 200 microliter van het hydrogel te verkrijgen.

Meng de componenten door minstens vijf keer op en neer te pipetten om een uniform hydrogel na polymerisatie te garanderen. Plaats de 96-wellplaat ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur tot alle hydrogels goed zijn gepolymeriseerd. Na polymerisatie verwijdert u voorzichtig en langzaam de plasticfolie van de bodem van de plaat.

Pers de hydrogels uit de 96-wellplaat met een kleine prikker en breng ze over naar 1,5 milliliterbuisjes met steriele PBS pH 7,4. Bewaar de hydrogels in fosfaatgebufferd zoutwater bij vier graden Celsius gedurende maximaal enkele maanden. Om de hydrogels te vriesdrogen, vult u eerst 1,5 milliliterbuisjes met 500 microliter steriele gedeïoniseerd water en verwijdert u de doppen.

Breng de hydrogels over naar de 1,5 milliliter reactiebuisjes met behulp van een pincet. Wikkel de 1,5 milliliterbuisjes stevig in met paraffinefolie met minstens drie lagen voor elke buis. Gebruik een naald om kleine gaatjes in de folie te prikken om gasuitwisseling uit de buisjes mogelijk te maken.

Om te garanderen dat het water en het hydrogel volledig bevriezen, brengt u de buis naar de vloeibare stikstofoplossing gedurende vijf minuten. Direct na verwijdering uit de vloeibare stikstof, brengt u de buisjes over naar de vriesdroger om te voorkomen dat het materiaal ontdooit. Als alternatieve bevriezingsstap, bewaart u de buisjes een nacht bij min 20 graden Celsius om de hydrogels langzaam te bevriezen.

Direct na verwijdering uit min 20 graden Celsius, brengt u de buisjes over naar de vriesdroger om te voorkomen dat het materiaal ontdooit. Na 24 uur en de volledige verdamping van het water in en rond het hydrogel, ontdooit u het materiaal door het uit de vriesdroger te halen. Voor het uitlekken van deeltjes, mengt u de componenten van het hydrogel zoals eerder beschreven.

Na het mengen, voegt u onmiddellijk natriumchloride toe tot verzadiging optreedt. Voeg zout toe totdat zoutkristallen als witte neerslag in de oplossing zichtbaar zijn. De poriegroottes kunnen worden gewijzigd door de zoutkristallen voor gebruik te malen.

Breng de 96-wellplaat over naar een shaker en schud tot polymerisatie plaatsvindt. Na ongeveer 10 minuten, verwijdert u de hydrogels van de plaat zoals eerder beschreven. Incubeer de hydrogels gedurende ten minste 24 uur bij kamertemperatuur in steriele water op een rotator om al het zout uit de hydrogeltemplaat te elueren.

Bewaar de hydrogels bij vier graden Celsius in PBS gedurende maximaal enkele maanden. Voor zachte vorming, bereid hydrogels voor zoals beschreven. Verwijder vervolgens een hydrogel uit de oplossing met behulp van een pincet.

Verwijder het overtollige water met zeer absorberend papier en plaats het op een blok droog ijs. Vries het hydrogel gedurende 30 seconden en verwijder het voorzichtig van het blok. Beschadig het hydrogel niet.

Gebruik voorzichtig een spatel om het van het blok te schrappen. Breng het hydrogel over naar een 1,5 milliliterbuisje en droog het een nacht bij 37 graden Celsius. Bereid een Rhodamine B stakoplossing evenals seriële verdunningen voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Verwijder het hydrogel van de opgeslagen oplossing en breng het over naar een 1,5 milliliterbuisje met één milliliter van 0,01 milligram per milliliter Rhodamine B-oplossing. Laat het hydrogel overnacht in Rhodamine B-oplossing bij kamertemperatuur inkuilen. Breng de volgende dag het hydrogel dat gevisualiseerd moet worden over naar 10 milliliter PBS en spoel gedurende minimaal drie uur.

Snijd kleine plakjes uit het hydrogel met behulp van een mes. Breng vervolgens het hydrogel over naar een acht-well microscoopglaasje en bedek het met PBS. Gebruik een confocale laserscanningmicroscoop om het hydrogel te visualiseren bij een golflengte van 514 nanometer.

Filter alle stakoplossingen sterieel met een 0,45 micrometerfilter. Begin met de voorbereiding van het hydrogel en voeg het celadhesieve peptide toe vóór de hydrogelpolymerisatie. Na het mengen van de componenten, pipet de mengsel onmiddellijk in een acht-well microscoopglaasje totdat de bodem volledig bedekt is.

Breng de cellen over naar voorverwarmd sterieel DMEM celkweekmedium dat is aangevuld met foetaal bovien serum, penicilline streptomycine en niet-essentiële aminozuuroplossing. Na het tellen van de cellen met een Neubauer telkamer, pipet voorzichtig 200 microliter van het gewenste aantal cellen op het hydrogeloppervlak. Bedek het acht-well microscoopglaasje met een deksel en breng het over naar een incubator.

Na minimaal vier uur cellulaire hechting, was de cellen twee keer met 200 microliter sterieel celkweek PBS. Fixeer vervolgens de cellen met 200 microliter 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en was twee keer met PBS. Permeabiliseer de cellen met 200 microliter 0,1% Triton X gedurende vijf minuten voordat u nogmaals twee keer met PBS wast.

Kleur de cellen met Toluidine Rhodamine door vijf microliter methanolische stakoplossing te mengen met 195 microliter PBS en deze toe te voegen aan de cellen bij kamertemperatuur. Kleur de cellen gedurende 2