Clock Scan Protocol voor Image Analysis: ImageJ Plugins

Het algemene doel van deze clock scan-protocollen is om een snelle karakterisering mogelijk te maken van de gemiddelde pixelintensiteit binnen, langs de rand van en/of buiten geselecteerde regio's van belang. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen en beeldanalisten onderwijzen over de gemiddelde pixelintensiteit binnen specifieke regio's van belang. De belangrijkste voordelen van de hier beschreven clock scan-techniek zijn dat deze kan worden gebruikt om vanuit een baan om de aarde snel de gemiddelde pixelintensiteit van één of meerdere regio's van belang te karakteriseren.

Voor een standaard clock scan-analyse selecteert u onder het menu File, in het betreffende ImageJ-programma, Open om een gewenst afbeeldingsbestand te openen. In dit voorbeeld wordt een weefselcoupe geanalyseerd waarin neuronen zijn gelabeld voor een specifiek eiwit. Selecteer een geschikt tekengereedschap en omkader het gebied van interesse.

Selecteer Plugins en Clock Scan uit het Bestand-menu om het standaard protocol voor clock scanning te openen in een pop-up optievenster. Het venster van de region of interest manager wordt ook geopend, waarbij de omtrek automatisch is toegevoegd. Gebruik in het optievenster van de Plugin de schuifregelaars om de x- en y-coördinaten in het centrum van de region of interest naar behoefte aan te passen.

Afhankelijk van hoeveel van het achtergrondgebied buiten het object door de scan moet worden gedekt, gebruikt u de schuifregelaar voor de scanlimiet om de scanlimieten aan te passen. Selecteer de selectievakjes voor de werkelijke straal, het aftrekken van de achtergrond, de polaire transformatie en/of het plotten met standaarddeviatie, afhankelijk van wat experimenteel gepast is. Klik vervolgens op OK om de plug-in uit te voeren.

Zodra de analyse is voltooid, gebruikt u het list-commando om de numerieke gegevens te openen voor verdere analyse. Voor de clock scan-analyse van meerdere regio's opent u een afbeeldingsbestand dat meerdere regio's van belang bevat. In dit voorbeeld wordt een paneel van frames geanalyseerd die, zoals zojuist gedemonstreerd, binnen dezelfde weefselcoupe zijn vastgelegd.

Klik op Analyze, vervolgens op Tools en daarna op Region of Interest Manager, en gebruik het juiste tekengereedschap om elk interessegebied af te bakenen. Het gereedschap voor gesegmenteerde lijnen is nuttig voor het selecteren van asymmetrische interessegebieden en voor het uitsluiten van achtergrondlabeling. Klik in het venster van de Region of Interest Manager op Add om elk geselecteerd interessegebied aan de manager toe te voegen.

selecteer in het menu Plugins de optie Multi Clock Scan om het pop-upvenster met protocolopties te openen en pas indien nodig de scanlimiet aan. Vink de vakjes plot with standard deviation en/of subtract background aan, afhankelijk van wat experimenteel passend is. Klik vervolgens op OK om het protocol uit te voeren, waarna er twee vensters met outputplots worden gegenereerd.

Open voor clock scan-analyse van een beeldstapel de gewenste beeldstapel. In dit voorbeeld wordt een beeldstapel van een geïsoleerd dorsaal wortelganglion geanalyseerd, gelabeld met een calciumgevoelige fluorescente stof en gefotografeerd vóór en na stimulatie met een intracellulaire elektrode. Omcirkel het interessegebied binnen de beeldstapel.

Voeg de geselecteerde beeldstapel toe aan de region of interest-manager, zoals zojuist gedemonstreerd, en selecteer Multi Clock Scan om het pop-upvenster met protocolopties te openen. Stel de scanlimiet indien nodig opnieuw in en vink de vakjes voor de plot met standaarddeviatie en/of het aftrekken van de achtergrond aan, afhankelijk van wat experimenteel passend is. Klik vervolgens op OK om het protocol uit te voeren, waardoor er twee vensters met outputplots worden gegenereerd.

In deze representatieve analyse van een weefselcoupe met fluorescentieel gelabelde neuronen werd een region of interest getrokken door het heldere signaal van het eiwit van belang, waarna een standaard clock scan-analyse werd uitgevoerd om radiale pixelintensiteitsscans te verzamelen van het centrum van de region of interest tot aan de aangegeven scanlimiet. De radiale scans werden genormaliseerd naar de straal van de region of interest in de richting van de scan. Er werd een gemiddelde berekend om een integraal radiaal pixelintensiteitsprofiel te genereren, waaruit bleek dat het grootste deel van het eiwit van belang werd gemeten bij het plasmamembraan van de cel.

Omdat voor deze analyse werd gekozen voor een plot met standaarddeviatie, gaven de verticale lijnen van de standaarddeviatie de variatie in pixelintensiteiten aan tussen de individuele radiale scanprofielen op een bepaalde afstand van de scan-oorsprong. In deze analyse werden, zoals zojuist gedemonstreerd, meerdere regio's van interesse binnen het neuronale weefselmonster gescand, waardoor een integraal pixelintensiteitsprofiel werd gegenereerd voor elk gescand object in de volgorde waarin ze aan de region of interest manager werden toegevoegd. Daarnaast werd een gemiddeld pixelintensiteitsprofiel opgesteld voor elke geselecteerde regio van interesse.

Deze standaarddeviatiebalken vertegenwoordigen daarom de variabiliteit tussen integrale scans van individuele objecten, in plaats van individuele radiale scans. Hier werd een image stack-analyse uitgevoerd van een geïsoleerd neuron van het dorsale wortelganglion, dat op verschillende tijdstippen is vastgelegd, vóór en na stimulatie via een intracellulaire elektrode. Aan het einde van de analyse werden een integraal pixelintensiteitsprofiel van de individuele instanties van het object van belang op verschillende beelden binnen de stack, en een gemiddeld pixelintensiteitsprofiel voor alle instanties van het object weergegeven.

Verder laat de standaarddeviatie-analyse van een clock scan-beeldstack de datavariabiliteit zien tussen de integrale scans gedurende de gehele stack van beelden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe pixelintensiteiten gemeten kunnen worden met behulp van clock scan-plug-ins. Ons doel bij de ontwikkeling van deze plug-ins was om dit type beeldanalyse vrij beschikbaar te maken voor elke onderzoeker.

Wij geloven dat het clock scan-protocol zal worden gebruikt in vele onderzoeksgebieden, waaronder, maar niet beperkt tot, biologische, chemische en fysische beeldingstoepassingen. Naarmate we deze clock scan-plugins verder ontwikkelen en beheren, stellen we feedback en suggesties van geïnteresseerde partijen over het verbeteren van deze tools zeer op prijs.