Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7
September 17th, 2017
Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.
Het belangrijkste doel van dit protocol is om dual-modale nanosensoren te ontwerpen en te synthetiseren die in staat zijn om bacteriële contaminanten zoals E.coli O157:H7 te detecteren. Magneto-fluorescente nanosensoren worden gesynthetiseerd door ijzeroxide nanodeeltjes te functionaliseren via een twee-staps procedure. Eerst worden targeting antilichamen geconjugeerd aan het oppervlak van het nanodeeltje.
Vervolgens wordt fluorescerende kleurstof geladen in zijn codering. De paring van deze modaliteiten maakt een snelle en gevoelige detectie van bacteriële contaminanten in zowel lage als hoog geconcentreerde oplossingen mogelijk. In de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid bacteriën, zullen de nanosensoren rond de bacteriën zwermen vanwege het targeting van de geconjugeerde antilichamen.
Deze zwerm verandert de interacties van de magnetische kern van de nanosensoren met de omringende waterprotonen, waardoor gevoelige detectie van veranderingen in magnetische relaxatiewaarden mogelijk wordt. Naarmate de concentratie van bacteriële contaminanten in oplossingen toeneemt, neemt het zwermen af en wordt de mogelijkheid van de magnetische modaliteit om besmetting te kwantificeren verminderd. Echter, naarmate de bacteriële concentratie toeneemt, doet de fluorescente inzending van de bio-nanosensoren dat ook.
Om deze reden is de paring van magnetische en fluorescente modaliteiten belangrijk. De combinatie heeft de detectie van slechts één kolonievormingseenheid van E.coli O157:H7 binnen enkele minuten mogelijk gemaakt. De eerste stap in de synthese van magneto-fluorescente nanosensoren is de bereiding van een ijzerzout oplossing bestaande uit zowel fero- als ferriechloride.
Het ijzer zal de nanosensoren een magnetische kern bieden die hun aanpassingsvermogen aan magnetische relaxatieplatforms mogelijk maakt. Aanvullende oplossingen die nodig zijn, zijn polyacrylzuur en ammoniumhydroxide. Zoutzuur wordt geïntroduceerd in de ijzerzout oplossing, die vervolgens wordt toegevoegd aan de ammoniumhydroxide oplossing tijdens het vortexen.
Ten slotte wordt de polyacrylzuuroplossing toegevoegd, en het resulterende mengsel wordt een uur lang verder gevormd terwijl de reactie doorgaat. De resulterende oplossing wordt gecentrifugeerd om de grotere moleculen te laten bezinken en nanodeeltjes kleiner dan 100 nanometer te isoleren. De oplossing wordt vervolgens gedurende een nacht gedialyseerd voor zuivering.
De volgende stap is de conjugatie van targeting antilichamen aan de polyacrylzuur codering van de nieuw gesynthetiseerde ijzerzuur nanodeeltjes. Benodigde materialen omvatten MES-buffer, EDC, NHS en de geselecteerde antilichamen. EDC wordt eerst toegevoegd aan de nanodeeltjesoplossing, gevolgd door NHS en ten slotte het antilichaam.
Het mengsel wordt vervolgens gedurende drie uur op een tafelmixer geplaatst terwijl de reactie doorgaat. De oplossing wordt gezuiverd met behulp van een magnetische kolom. De gemagnetiseerde kolom vangt de nanodeeltjes op, waardoor alleen vrij zwevende antilichamen kunnen uitgaan.
Daarna wordt de kolom gewassen met PBS-buffer, en worden de geconjugeerde nanosensoren verzameld. De nanodeeltjes zijn vervolgens klaar voor de toevoeging van fluorescerende kleurstof, die de tweede belangrijkste modaliteit is die voor detectie wordt gebruikt. Een van de belangrijkste kenmerken van onze nanosensor is de combinatie van de magnetische en fluorescente modaliteiten, wat om een aantal redenen belangrijk is.
Ten eerste, de combinatie van de modaliteiten maakt het mogelijk om elkaar te controleren, wat het risico op valse positieven en valse negatieven aanzienlijk vermindert, wat een van de grootste obstakels is voor verschillende diagnostische platformen die tegenwoordig worden gebruikt. En ten tweede, de combinatie van de modaliteiten vergroot de reikwijdte waarbinnen we niet alleen bacteriële besmetting kunnen detecteren, maar ook kunnen kwantificeren. De laatste stap in de bereiding van de nanosensoren is de incapsulatie van fluorescerende kleurstof in de codering van het nanodeeltje.
Dit wordt eenvoudigweg bereikt door kleurstof toe te voegen aan de oplossing tijdens het vortexen, en vervolgens extra tijd te geven voor de diffusie van de kleurstof in de codering van de nanosensor. De volledig functionele nanosensoren worden vervolgens nog een laatste keer gedialyseerd voor zuivering. Om de nanosensoren te karakteriseren, worden de grootte en fluorescente inzending geregistreerd met behulp van een zetasizer en een fluorescentie plate reader.
Een kleine monster van de nanosensor wordt toegevoegd aan een cuvet met wateroplossing en in de zetasizer geplaatst voor het opnemen van de grootte. Voor de fluorescentieanalyse wordt een monster van de nanosensor op een 96-wells plate geplaatst en in de fluorescentie plate reader geplaatst. Idealiter zullen de nanosensoren ongeveer 70 nanometer in diameter zijn en een fluorescente inzending van 575 nanometer hebben.
Naast de synthese van de nanosensoren is het kweken van bacteriën noodzakelijk om de bacteriële doelen in het laboratorium te bieden. Een glycerolvoorraad van bacteriën wordt gebruikt om een cultuur in voedingsbouillon te bereiden. Deze oplossing wordt vervolgens geïncubeerd.
Na de initiële incubatieperiode worden seriële verdunningen uitgevoerd om een breed scala aan bacteriële concentraties te bereiken. Honderd microliter van elke concentratie wordt geplaatst op een voedingsbodemplaat en vervolgens gedurende 24 uur geïncubeerd. Na deze incubatie worden de kolonies op elke plaat geteld om de kolonievormingseenheid, of CFU-telling per mil van elke verdunde voorraad te bepalen.
Nu de bacteriële voorraadoplossingen zijn bereid, kunnen ze worden gebruikt in combinatie met de bereide nanosensoren. En een belangrijk aspect van deze specifieke serotype van de bacterie die het onderscheidt van andere serotypen is dat als je besmet raakt met de andere serotypen, je veel kolonievormingseenheden nodig hebt om een infectie te krijgen. Maar bij deze specifieke E.coli zijn 10 tot 100 CFU's of kolonievormingseenheden goed genoeg om je een infectie te geven.
Onze technologie is zodanig ontwikkeld dat je geen enkele koloniebacteriële besmetting zult missen. Om oplossingen voor het lezen in de magnetische relaxometer voor
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft het ontwerp en de synthese van dubbel-modaal nanosensoren voor de snelle detectie van pathogene bacteriën, specifiek E.coli O157:H7. Door magnetische relaxatie en fluorescentie-emissie te combineren, bieden deze nanosensoren een draagbare en kosteneffectieve oplossing voor bacteriële detectie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Nanotechnologie
- Microbiologie
- Biomedische technologie
Achtergrond
- Pathogene bacteriën vormen aanzienlijke gezondheidsrisico's.
- Huidige detectiemethoden kunnen langzaam en duur zijn.
- Nanosensoren bieden een veelbelovend alternatief voor snelle detectie.
- Magneto-fluorescente eigenschappen verbeteren de gevoeligheid en specificiteit.
Doel van studie
- Nanosensoren ontwikkelen die bacteriële verontreinigingen snel kunnen identificeren.
- Een dubbel-modaal benadering gebruiken voor verbeterde detectiecapaciteiten.
- De efficiëntie van bacteriële detectie in verschillende omgevingen verbeteren.
Gebruikte methoden
- Synthese van ijzeroxide nanodeeltjes.
- Conjugatie van targeting antilichamen aan nanodeeltjes.
- Beladen van fluorescente kleurstof in de nanodeeltjes.
- Testen van de respons van nanosensoren in verschillende bacterieconcentraties.
Belangrijkste resultaten
- Nanosensoren zwermden effectief rond doelbacteriën.
- Demonstreerden snelle detectie in zowel lage als hoge concentraties.
- Toonden potentieel voor draagbare en kosteneffectieve toepassingen.
- Valideerden de dubbel-modaal detectiebenadering.
Conclusies
- Dubbel-modaal nanosensoren zijn effectief voor bacteriële detectie.
- Magneto-fluorescente eigenschappen verbeteren detectiesnelheid en gevoeligheid.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende pathogene bacteriën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid, specific detection of low-abundance pathogens like E. coli O157:H7 is critical for early intervention in food and water safety workflows. Dual-modal magneto-fluorescent nanosensors enable quantification across contamination stages, supporting risk assessment and go/no-go decisions in raw material screening. Their portability and minimal infrastructure needs allow deployment in decentralized testing environments, reducing reliance on centralized labs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of antibody specificity by detecting target pathogen swarming in complex matrices.
- Operational Value: Reduces false positives through magnetic-fluorescent cross-verification, improving assay reliability in early screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative readouts across wide concentration ranges via complementary magnetic and fluorescent signals.
- Operational Value: Supports high-throughput adaptability due to simple mix-and-read format and stability in diverse media.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal monitoring of pathogen load in preclinical models using non-invasive sampling.
- Operational Value: Facilitates cross-platform consistency by generating comparable magnetic and fluorescence data across sites.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within microbiological hazard assessment workflows, supporting early-stage contamination screening in raw material qualification and environmental monitoring.
- Discovery Biology: Confirms target engagement and specificity through nanosensor swarming and signal modulation in presence of pathogen.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs enabling threshold-based lot release decisions.
- Analytics: Generates dual-modal data (T2 relaxation shifts and fluorescence intensity) for orthogonal confirmation and dynamic range extension.
- Translational Research: Supports continuity from environmental sampling to preclinical challenge models via consistent detection principle.
- Enterprise Reuse: Platform can be reconfigured for other pathogens by antibody swap, enabling multi-target surveillance programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in contamination status through ratiometric magnetic-fluorescent correlation.
- Operational Value: Standardized, kit-compatible workflow with <1-hour time-to-result and minimal training.
- Strategic Value: Enables proactive risk mitigation in supply chains, reducing batch loss and recall exposure.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of raw materials and environmental monitoring sites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle bioconjugation and fluorescence quantification.
- Needs access to magnetic relaxometer and fluorescence plate reader for dual-modal readout.
- Demands standardization of antibody conjugation efficiency and dye loading consistency across batches.
- Must account for matrix effects in complex fluids like milk or wastewater during assay validation.
- Limited by nanosensor stability over time; requires cold-chain storage and use within defined shelf life.
