Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7
17 september 2017
Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.
Het belangrijkste doel van dit protocol is om dual-modale nanosensoren te ontwerpen en te synthetiseren die in staat zijn om bacteriële contaminanten zoals E.coli O157:H7 te detecteren. Magneto-fluorescente nanosensoren worden gesynthetiseerd door ijzeroxide nanodeeltjes te functionaliseren via een twee-staps procedure. Eerst worden targeting antilichamen geconjugeerd aan het oppervlak van het nanodeeltje.
Vervolgens wordt fluorescerende kleurstof geladen in zijn codering. De paring van deze modaliteiten maakt een snelle en gevoelige detectie van bacteriële contaminanten in zowel lage als hoog geconcentreerde oplossingen mogelijk. In de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid bacteriën, zullen de nanosensoren rond de bacteriën zwermen vanwege het targeting van de geconjugeerde antilichamen.
Deze zwerm verandert de interacties van de magnetische kern van de nanosensoren met de omringende waterprotonen, waardoor gevoelige detectie van veranderingen in magnetische relaxatiewaarden mogelijk wordt. Naarmate de concentratie van bacteriële contaminanten in oplossingen toeneemt, neemt het zwermen af en wordt de mogelijkheid van de magnetische modaliteit om besmetting te kwantificeren verminderd. Echter, naarmate de bacteriële concentratie toeneemt, doet de fluorescente inzending van de bio-nanosensoren dat ook.
Om deze reden is de paring van magnetische en fluorescente modaliteiten belangrijk. De combinatie heeft de detectie van slechts één kolonievormingseenheid van E.coli O157:H7 binnen enkele minuten mogelijk gemaakt. De eerste stap in de synthese van magneto-fluorescente nanosensoren is de bereiding van een ijzerzout oplossing bestaande uit zowel fero- als ferriechloride.
Het ijzer zal de nanosensoren een magnetische kern bieden die hun aanpassingsvermogen aan magnetische relaxatieplatforms mogelijk maakt. Aanvullende oplossingen die nodig zijn, zijn polyacrylzuur en ammoniumhydroxide. Zoutzuur wordt geïntroduceerd in de ijzerzout oplossing, die vervolgens wordt toegevoegd aan de ammoniumhydroxide oplossing tijdens het vortexen.
Ten slotte wordt de polyacrylzuuroplossing toegevoegd, en het resulterende mengsel wordt een uur lang verder gevormd terwijl de reactie doorgaat. De resulterende oplossing wordt gecentrifugeerd om de grotere moleculen te laten bezinken en nanodeeltjes kleiner dan 100 nanometer te isoleren. De oplossing wordt vervolgens gedurende een nacht gedialyseerd voor zuivering.
De volgende stap is de conjugatie van targeting antilichamen aan de polyacrylzuur codering van de nieuw gesynthetiseerde ijzerzuur nanodeeltjes. Benodigde materialen omvatten MES-buffer, EDC, NHS en de geselecteerde antilichamen. EDC wordt eerst toegevoegd aan de nanodeeltjesoplossing, gevolgd door NHS en ten slotte het antilichaam.
Het mengsel wordt vervolgens gedurende drie uur op een tafelmixer geplaatst terwijl de reactie doorgaat. De oplossing wordt gezuiverd met behulp van een magnetische kolom. De gemagnetiseerde kolom vangt de nanodeeltjes op, waardoor alleen vrij zwevende antilichamen kunnen uitgaan.
Daarna wordt de kolom gewassen met PBS-buffer, en worden de geconjugeerde nanosensoren verzameld. De nanodeeltjes zijn vervolgens klaar voor de toevoeging van fluorescerende kleurstof, die de tweede belangrijkste modaliteit is die voor detectie wordt gebruikt. Een van de belangrijkste kenmerken van onze nanosensor is de combinatie van de magnetische en fluorescente modaliteiten, wat om een aantal redenen belangrijk is.
Ten eerste, de combinatie van de modaliteiten maakt het mogelijk om elkaar te controleren, wat het risico op valse positieven en valse negatieven aanzienlijk vermindert, wat een van de grootste obstakels is voor verschillende diagnostische platformen die tegenwoordig worden gebruikt. En ten tweede, de combinatie van de modaliteiten vergroot de reikwijdte waarbinnen we niet alleen bacteriële besmetting kunnen detecteren, maar ook kunnen kwantificeren. De laatste stap in de bereiding van de nanosensoren is de incapsulatie van fluorescerende kleurstof in de codering van het nanodeeltje.
Dit wordt eenvoudigweg bereikt door kleurstof toe te voegen aan de oplossing tijdens het vortexen, en vervolgens extra tijd te geven voor de diffusie van de kleurstof in de codering van de nanosensor. De volledig functionele nanosensoren worden vervolgens nog een laatste keer gedialyseerd voor zuivering. Om de nanosensoren te karakteriseren, worden de grootte en fluorescente inzending geregistreerd met behulp van een zetasizer en een fluorescentie plate reader.
Een kleine monster van de nanosensor wordt toegevoegd aan een cuvet met wateroplossing en in de zetasizer geplaatst voor het opnemen van de grootte. Voor de fluorescentieanalyse wordt een monster van de nanosensor op een 96-wells plate geplaatst en in de fluorescentie plate reader geplaatst. Idealiter zullen de nanosensoren ongeveer 70 nanometer in diameter zijn en een fluorescente inzending van 575 nanometer hebben.
Naast de synthese van de nanosensoren is het kweken van bacteriën noodzakelijk om de bacteriële doelen in het laboratorium te bieden. Een glycerolvoorraad van bacteriën wordt gebruikt om een cultuur in voedingsbouillon te bereiden. Deze oplossing wordt vervolgens geïncubeerd.
Na de initiële incubatieperiode worden seriële verdunningen uitgevoerd om een breed scala aan bacteriële concentraties te bereiken. Honderd microliter van elke concentratie wordt geplaatst op een voedingsbodemplaat en vervolgens gedurende 24 uur geïncubeerd. Na deze incubatie worden de kolonies op elke plaat geteld om de kolonievormingseenheid, of CFU-telling per mil van elke verdunde voorraad te bepalen.
Nu de bacteriële voorraadoplossingen zijn bereid, kunnen ze worden gebruikt in combinatie met de bereide nanosensoren. En een belangrijk aspect van deze specifieke serotype van de bacterie die het onderscheidt van andere serotypen is dat als je besmet raakt met de andere serotypen, je veel kolonievormingseenheden nodig hebt om een infectie te krijgen. Maar bij deze specifieke E.coli zijn 10 tot 100 CFU's of kolonievormingseenheden goed genoeg om je een infectie te geven.
Onze technologie is zodanig ontwikkeld dat je geen enkele koloniebacteriële besmetting zult missen. Om oplossingen voor het lezen in de magnetische relaxometer voor
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het ontwerp en de synthese van duale modale nanosensoren voor de snelle detectie van pathogene bacteriën, specifiek E.coli O157:H7. Door magnetische relaxatie en fluorescentie-emissie te combineren, bieden deze nanosensoren een draagbare en kosteneffectieve oplossing voor bacteriële detectie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Nanotechnologie
- Microbiologie
- Biomedische technologie
Achtergrond
- Pathogene bacteriën vormen aanzienlijke gezondheidsrisico's.
- Huidige detectiemethoden kunnen traag en kostbaar zijn.
- Nanosensoren bieden een veelbelovend alternatief voor snelle detectie.
- Magneto-fluorescerende eigenschappen verbeteren de gevoeligheid en specificiteit.
Doel van de studie
- Om nanosensoren te ontwikkelen die bacteriële verontreinigingen snel kunnen identificeren.
- Om een duale modale aanpak te gebruiken voor verbeterde detectiecapaciteiten.
- Om de efficiëntie van bacteriële detectie in verschillende omgevingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Synthese van ijzeroxide-nanodeeltjes.
- Conjugatie van targetingsantilichamen aan nanodeeltjes.
- Laden van fluorescerende kleurstof in de nanodeeltjes.
- Testen van de respons van nanosensoren bij verschillende bacteriële concentraties.
Belangrijkste resultaten
- Nanosensoren zwermden effectief rond de doelbacteriën.
- Snelle detectie werd aangetoond bij zowel lage als hoge concentraties.
- Toonde potentieel voor draagbare en kosteneffectieve toepassingen.
- Bevestigde de duale modale detectieaanpak.
Conclusies
- Duaal-modale nanosensoren zijn effectief voor de detectie van bacteriën.
- Magneto-fluorescente eigenschappen verbeteren de detectiesnelheid en gevoeligheid.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse pathogene bacteriën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Snelle, specifieke detectie van pathogenen met een lage abundantie, zoals E. coli O157:H7, is cruciaal voor vroegtijdige interventie in workflows voor voedsel- en waterveiligheid. Duaal-modale magneto-fluorescente nanosensoren maken kwantificering in verschillende contaminatiefasen mogelijk, wat risicobeoordelingen en go/no-go-beslissingen bij de screening van grondstoffen ondersteunt. Hun draagbaarheid en minimale infrastructuurbehoefte maken inzet in gedecentraliseerde testomgevingen mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van centrale laboratoria wordt verminderd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van antilichaamspecificiteit mogelijk door het detecteren van zwermgedrag van het doelpathogeen in complexe matrices.
- Operationele waarde: Vermindert fout-positieve resultaten door magnetisch-fluorescerende kruisverificatie, wat de betrouwbaarheid van de assay bij vroege screening verbetert.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve resultaten over brede concentratiebereiken via complementaire magnetische en fluorescente signalen.
- Operationele waarde: Ondersteunt aanpasbaarheid voor high-throughput vanwege het eenvoudige mix-and-read-formaat en stabiliteit in diverse media.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt longitudinale monitoring van de pathogeniteitslast in preklinische modellen mogelijk middels niet-invasieve bemonstering.
- Operationele waarde: Faciliteert consistentie over verschillende platforms door het genereren van vergelijkbare magnetische en fluorescentiedata tussen verschillende locaties.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen workflows voor microbiologische risicobeoordeling en ondersteunt screening op vroege contaminatie bij kwalificatie van grondstoffen en monitoring van de omgeving.
- Ontdekkingsbiologie: Bevestigt target-interactie en specificiteit via nanosensor-zwermen en signaalmodulatie in de aanwezigheid van het pathogeen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die drempelwaarde-gebaseerde beslissingen voor lot-vrijgave mogelijk maken.
- Analytica: Genereert duaal-modale gegevens (T2-relaxatieverschuivingen en fluorescentie-intensiteit) voor orthogonale bevestiging en uitbreiding van het dynamische bereik.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt continuïteit van milieumonstername naar preklinische challenge-modellen via een consistent detectieprincipe.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Het platform kan worden geconfigureerd voor andere pathogenen door antilichaam-vervanging, wat surveillanceprogramma's voor meerdere targets mogelijk maakt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid van de contaminatiestatus via ratiometrische magnetisch-fluorescente correlatie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde, kit-compatibele workflow met een doorlooptijd van <1 uur en minimale training.
- Strategische waarde: Maakt proactieve risicobeperking in toeleveringsketens mogelijk, waardoor batchverlies en de kans op recalls worden verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van grondstoffen en locaties voor milieumonitoring.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in bioconjugatie van nanodeeltjes en fluorescentiekwantificering.
- Vereist toegang tot een magnetische relaxometer en een fluorescentieplaatlezer voor duale-modale uitlezing.
- Vraagt om standaardisatie van de efficiëntie van antilichaamconjugatie en de consistentie van de kleurstofbelading tussen batches.
- Moet rekening houden met matrixeffecten in complexe vloeistoffen zoals melk of afvalwater tijdens de validatie van de assay.
- Beperkt door de stabiliteit van de nanosensor over tijd; vereist bewaring in de koudeketen en gebruik binnen de gedefinieerde houdbaarheid.
