Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en Xenopus Embryonale Ontwikkeling
15 juni 2017
Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.
Het algemene doel van dit experiment is om licht te gebruiken om de mitogen-geactiveerde proteïnekinase-signaleringsroute in intacte cellen en in Xenopus-embryo's te regelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de cellulaire en ontwikkelingsbiologie, zoals hoe temporele modulaties van kinase-activiteit de zelfbeschikking tijdens celdifferentiatie en embryonale ontwikkeling reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de mitogen-geactiveerde proteïnekinase-activiteit omkeerbaar kan worden geregeld in intacte cellen en in meercellige organismen, zoals zich ontwikkelende embryo's.
Deze methode kan inzicht bieden in de signaalkinetica tijdens de ontwikkeling van Xenopus-embryo's. Het kan ook worden toegepast op andere modelsystemen zoals socotra, zebravis of muis. Vandaag zal een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, Vishnu Krishnamurthy, de procedure demonstreren.
En Aurora Turgeon, een post-star in mijn laboratorium, zal alle procedures bij Xenopus-embryo's demonstreren. Eerst, monteer het celkweekapparaat door een gesteriliseerde PDMS-kamer op een steriele PLL-gecoate dekglas in een 60 mm petrischaal te plaatsen. Gebruik vervolgens 0,5 mL van 0,25% trypsine om pHK21-cellen los te maken van een putje van een 6-putjes kweekbord.
Na het tellen van de celdichtheid met de hemocytometer, zaai de kamer met 20.000 cellen in 200 microliter celkweekmedium. 24 uur na het zaaien van de cellen, transfecteer de cellen met 50 tot 100 nanogram van CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG van PCaA X plasmid volgens het protocol van de fabrikant. Drie uur na transfectie, ververs het medium naar 200 microliter vers kweekmedium en laat de cellen een nacht herstellen door de kweek in een incubatiekast van 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide te incuberen.
De volgende dag, begin met optogenetische inductie en beeldvorming door eerst het celkweekmedium te vervangen door 200 microliter koolstofdioxide-onafhankelijk medium. Stel vervolgens het data-acquisitieprotocol in. Selecteer de 488 nanometer excitatie FITC-kanaal voor optogenetische stimulatie, en het 561 nanometer excitatie CRITC-kanaal om de cellulaire lokalisatie van mCherry-gelabeld proteïne te volgen.
Meet het vermogen van het blauwe licht door een vermogensmeter dicht bij het objectievenraam te plaatsen. Een totaal vermogen van twee microwatt is voldoende om de CIBN CRY2-PHR associatie te induceren. Stel een tijdstempel-acquisitie in met een interval van vijf seconden.
En de totale acquisitietijd van twee minuten. Breng geschikt index-matching materiaal aan op het objectievenraam. Plaats de celkamer op de microscoopstandaard en gebruik de heldere veldmodus om op de cellen op het oppervlak van het dekglas te focussen met behulp van de oogstukken.
Beweeg vervolgens de microscoopstandaard om een getransfecteerde cel onder groen licht te lokaliseren. Neem een reeks tijdgestempelde beelden op in zowel het FITC- als CITC-kanaal. De basisvoorbeeldafbeelding toont CIBNGPCAAX gelokaliseerd op het plasmamembraan.
Dit is een momentopname van CRY2 mCherry raf1 vóór blauw licht simulatie, terwijl deze afbeelding een momentopname toont van CRY2 mCherry raf1 na tien pulsen van blauw licht stimulatie. Maak de LED-array door tonale blauwe LED's in twee broodplanken te plaatsen en te verbinden met stroombegrenzende weerstanden. Plaats de broodplanken in een aluminium doos.
Voeg twee metalen draden toe om de borden aan de voeding aan te sluiten. Zorg ervoor dat de lengte van de draad voldoende is wanneer de lichtbox in een koolstofdioxide-incubator wordt geplaatst. Plaats vervolgens een transparante lichtdiffuser om als deksel van de lichtbox te fungeren.
Kalibreer ten slotte het vermogen van elke LED bij een reeks spanningsinstellingen. Gebruik een vermogen van nul punt twee milliwatt per vierkante centimeter voor de 24-uurs PC12-celdifferentiatietest. Plaats de LED-array in een incubatiekast van 37 graden Celsius aangevuld met vijf procent koolstofdioxide.
Verbind het met de voeding met behulp van de metalen draden en stel het vermogen van de LED in op nul punt twee milliwatt per vierkante centimeter. Plaats de 12-putjesplaat met getransfecteerde PC12-cellen op het raam van de LED-array. Richt de plaat zo uit dat elke put volledig wordt verlicht.
Breng gedurende 24 uur continue lichtbelichting aan. Om de gedifferentieerde cellen af te beelden, stel de enkele momentopname data-acquisitie in. Gebruik 200 milliseconden voor zowel de GFP- als TexasRed-kanalen.
Vang beelden van de getransfecteerde cellen op in zowel het GFP- als TexasRed-kanaal en sla de bestanden op voor data-analyse. Begin deze procedure door naalden te fabriceren voor RNA-microinjectie door glashaarbuisjes te trekken met een capillairtrekker. Verwijder de geleïe laag van de embryo's door ze 15 minuten te behandelen met drie procent cysteïne verdund in 0,2 XMMR.
Breng de embryo's over naar een drie procent polysucrose en nul punt vijf XMMR-oplossing voor micro-injectie. Injecteer nauwkeurig 500 picogram tot één nanogram van CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA in elk embryo. Kweek vervolgens de gemicro-injecteerde embryo's in de micro-injectieoplossing bij kamertemperatuur.
Wanneer de embryo's de med gastrula-fase bereiken, breng ze over naar een 0,2x MMR-oplossing en blijf kweken tot de gewenste ontwikkelingsfase. Plaats vervolgens de 12-putjesplaat op de zelfgemaakte LED-array voor behandeling met blauw licht. Plaats een spiegel op de 12-putjesplaat om volledige blauw lichtbelichting van de embryo's te garanderen.
Oogst de embryo's voor histologische, western blot of genexpressieanalyse na blootstelling aan blauw licht gedurende de gewenste tijd. Deze afbeelding toont meerkanaals momentopnamen van PC12-cellen getransfecteerd met CRY2-2A-2CIBN na 24 uur blauw lichtstimul
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie om de activiteit van mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (MAPK) te moduleren tijdens celdifferentiatie en embryonale ontwikkeling van Xenopus. Deze methode maakt de reversibele activatie van de MAPK-signaleringsroute mogelijk in zoogdiercelculturen en in meercellige levende organismen, zoals Xenopus-embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Cellulaire biologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (MAPK) speelt een cruciale rol in de cel-signalering.
- Inzicht in de MAPK-activiteit is essentieel voor het begrijpen van celdifferentiatie.
- Optogenetica maakt precieze controle van biologische processen met behulp van licht mogelijk.
- Xenopus-embryo's dienen als model voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
Doel van de studie
- Om de MAPK-signaalroute te reguleren met licht in intacte cellen en embryo's.
- Om te onderzoeken hoe kinaseactiviteit de celdifferentiatie moduleert.
- Om de signaaldynamiek tijdens de embryonale ontwikkeling te verkennen.
Gebruikte methoden
- Optogenetische manipulatie van de MAPK-activiteit.
- Toepassing in zoogdiercelkweek.
- Gebruik van Xenopus-embryo's voor in vivo studies.
- Technieken met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
Belangrijkste resultaten
- De reversibele controle van de MAPK-activiteit is succesvol aangetoond.
- Er is inzicht verkregen in de rol van MAPK bij celdifferentiatie.
- De methode kan worden toegepast op verschillende modelorganismen.
- De signaleringskinetiek tijdens de embryonale ontwikkeling is opgehelderd.
Conclusies
- Deze optogenetische benadering biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van MAPK-signalering.
- Het vergroot ons begrip van de cellulaire en ontwikkelingsbiologie.
- De techniek heeft potentiële toepassingen in diverse biologische systemen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Omkeerbare controle van kinase-signalering pakt een kritiek knelpunt in targetvalidatie aan door nauwkeurige ondervraging van pad-dynamiek in fysiologisch relevante systemen mogelijk te maken. Deze optogenetische benadering verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door transiënte MAPK-modulatie te koppelen aan differentiatie-uitkomsten in zoogdiercellen en vertebratenembryo's. De methode ondersteunt mechanistische risicoreductie voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen door kwantitatieve, temporeel opgeloste read-outs van kinase-activiteit te verschaffen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de dynamiek van de MAPK-signaalroute te onderzoeken om therapeutische hypothesen in differentiatiecontexten te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt omkeerbare, lichtafhankelijke controle over de kinaseactiviteit voor herhaalde tests in levende cellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door kinasemodulatie te correleren met fenotypische uitkomsten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, tijdsonderzochte uitlezingen van pathway-activatie via fluorescente reporters.
- Operationele waarde: Standaardiseert assay-condities via optogenetische inductie met gedefinieerde lichtparameters.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well plate-formaten voor dosis-respons- en kinetische screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo validatie door Xenopus-embryo's te gebruiken als ziekterellevant systeem.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt de stadiumspecifieke rollen van kinasen bij de ontwikkeling om beslissingen over preklinische voortgang te onderbouwen.
- Predictieve betrouwbaarheid: Maakt beoordeling mogelijk van signaleringskinetiek die correleert met morfologische differentiatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een instelbare input te bieden voor pathway-onderzoek voordat men overgaat tot compound screening of lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van de kinasefunctie in differentiatie- en ontwikkelingspaden.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via reversibele, herhaalbare activering van signaalpaden met meetbare output.
- Analytics: Levert kwantitatieve fluorescentiegebaseerde uitlezingen om signaleringsdynamiek tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt cellulaire mechanismen met het embryonale fenotype voor risico-gecorrigeerde prioritering van targets.
- Enterprise Reuse: Het platform kan worden gegeneraliseerd naar andere kinases met vergelijkbare activeringsmechanismen over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in kinase-doelwitrelaties door nauwkeurige temporele controle.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde lichtinductie- en imagingprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door doelwitmodulatie te koppelen aan fenotypische risicoreductie.
- Impact op portfolio: Maakt vroege prioritering mogelijk van doelwitten met een gevalideerde relevantie tussen signaalroute en ziekte.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, transfectie en de opstelling van optogenetische hardware.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie en systemen voor gecontroleerde lichttoediening.
- Vereist standaardisatie van de lichtintensiteit en blootstellingsduur over de experimentele replicaten heen.
- Aanpassing aan alternatieve modelsystemen kan optimalisatie van de expressie en lichtpenetratie vereisen.
- Beperkt tot kinasen die vatbaar zijn voor activatie op basis van rekrutering via dimeriserende domeinen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
9:00
Conclusion
7:22
Results: Optogenetic Induction of PC12 Cell Differntiation and Kinase Activity in Live Xenopus Embryos
1:22
Optogenetic Induction of Protein Localization in BHK21 Mammalian Cell Culture
4:10
Construction of an LED Array for Long-term Light Stimulation in a CO2 Incubator
6:04
Optogenetic Control of Kinase Activity in Xenopus Embryos
5:05
Optogenetic Induction of PC12 Cell Differentiation
