Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in Drosophila

Het algemene doel van dit experiment is om de projectiepatronen van motorische neuronen te analyseren in embryo's in een late ontwikkelingsfase van Drosophila melanogaster. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van neurale ontwikkeling te beantwoorden, zoals geleiding van motorische axonen en vorming van neurale subcu. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeurige visualisatie biedt van motorische axonen in zich ontwikkelende embryo's, wat een betrouwbare analyse mogelijk maakt van het pad van de axonen en de doelconditie-defect.

Eén dag na het opzetten van de eierverzamelplaten, vervang de platen door nieuwe met een druppel vers gemaakte gistpasta. Na drie uur op de verse platen, verplaats de vliegen naar nieuwe voedselflesjes. En incubeer de eierplaten een nacht bij 25 graden Celsius.

In de ochtend, voeg 1,8 milliliter PBT-oplossing toe aan de platen. En gebruik een wattenstaafje om de embryo's los te maken. Vervolgens, gebruik een 1 milliliter pipette om de embryo's en oplossing over te brengen naar een microcentrifugebuis.

Zodra de embryo's zich op de bodem hebben gesetteld, zuig zoveel oplossing mogelijk op. Spoel vervolgens de embryo's twee keer met een milliliter PBT per spoeling. Om de embryo's te decoreoneren, vervang de laatste spoeling door een milliliter van 50%bleach en schudden de buis gedurende drie minuten op kamertemperatuur.

Om de bleekvloeistof te verwijderen, spoel de embryo's drie keer met PBT. Vervolgens, vervang de laatste spoeling door een halve milliliter van 100%heptaan en een halve milliliter van 4%paraformaldehyde. Nu, incubeer de embryo's gedurende 15 minuten met zacht schudden.

Na de incubatie, verwijder de onderliggende oplossingslaag en voeg 500 microliter van 100%methanol terug. Nu, schud de buis gedurende 30 seconden krachtig om de embryo's te devitelliniseren. Vervolgens, verwijder de bovenliggende oplossing, voeg 500 microliter van 100%methanol terug en schud de buis nog eens 10 seconden.

Na het schudden van de buis, tik erop om de embryo's te helpen zich te settelen en zoveel mogelijk oplossing te verwijderen. Spoel vervolgens de embryo's kort met 100%methanol. Spoel vervolgens de embryo's onmiddellijk drie keer met PBT.

Hersuspenseer nu de embryo's in een milliliter verse PBT. En incubeer de embryo's gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius om ze voor te bereiden op LacZ-kleuring. Terwijl de embryo's incuberen, bereid een milliliter aliquot van X-gal kleuringsoplossing voor.

Verwarm het aliquot in een waterbad van 65 graden Celsius tot het troebel wordt. Breng het vervolgens over naar een hitteblok van 37 graden Celsius. Nadat de embryo's gedurende 15 minuten zijn opgewarmd, verwijder de PBT-oplossing en vervang deze door het milliliter aliquot van de kleuringsoplossing.

Voeg vervolgens 20 microliter X-gal substraat toe. Incubeer de buis gedurende ongeveer twee tot vier uur bij 37 graden Celsius met zacht schudden tot er een blauwe neerslag ontstaat. Vervolgens, verwijder de kleuringsoplossing en spoel de embryo's drie keer met PBT op kamertemperatuur.

Na de spoelingen, gebruik een naald of tang om de embryo's handmatig te sorteren onder een dissectiemicroscoop. Verzamel de gewenste gekleurde embryo's in een halve millimeter microcentrifugebuis met behulp van een milliliter pipette. Was vervolgens de geselecteerde embryo's met 0,4 milliliter PBT.

Vervolgens, vervang de PBT door 0,3 milliliter blokkeringsoplossing en laat de embryo's gedurende 15 minuten met zachte agitatie incuberen. Voeg na 15 minuten 75 microliter van de primaire antilichaam toe en continueer de incubatie overnacht. De volgende ochtend, was de embryo's met PBT gedurende ongeveer twee uur, waarbij de wasoplossing ongeveer elke 30 minuten wordt ververst.

Na het wassen, voeg 0,3 milliliter blokkeringsoplossing met het secundaire antilichaam toe en incubeer de buis gedurende de nacht met zacht schudden op kamertemperatuur. Was de volgende ochtend de embryo's gedurende ongeveer drie uur met PBT. Ververs de PBT ten minste vijf keer tijdens de wasperiode.

Na het wassen, hersuspenseer de embryo's in 0,3 milliliter dab-oplossing en voeg twee microliter 3%waterstofperoxide toe. Incubeer ze vervolgens in het donker met zacht schudden op kamertemperatuur tot er voldoende neerslag is gevormd. Dit duurt meestal 30 tot 60 minuten.

Spoel vervolgens de embryo's vier keer met PBT en hersuspenseer ze in 0,2 milliliter montageoplossing. Laat de embryo's nu in het donker gelijkmatig verdelen bij 4 graden Celsius. Om de embryo's te fileren, plaats ze op een glazen plaat.

Verplaats ze eerst in een druppel glycerol met de ventrale kant naar boven. Snijd vervolgens onder een dissectiemicroscoop het voorste deel en 1/4 van de lichaamslengte af en verwijder het meest achterste gebied, dat geen motorische axonen bevat. Verplaats nu met behulp van een naald de voorbereiding uit het glycerol, met de dorsale kant naar boven, en plaats het horizontaal in het gezichtsveld.

De volgende stap vereist een fijne wolfraamnaald die is ingebracht in de holle regio van een naald en vervolgens aan het uiteinde gebogen is. Gebruik de wolfraamnaald om een kleine snede te maken aan het achterste uiteinde van het embryo en snijd vervolgens langs de dorsale middenlijn. Zorg ervoor dat de punt van de wolfraamnaald de oppervlakte van de glazen plaat niet raakt tijdens de dissectie, omdat de naald gemakkelijk tegen het glas kan buigen.

Vervolgens, breng met de naald de voorbereiding terug naar de druppel glycerol en plaats hem met de dorsale kant naar boven. Daar, los het darmkanaal los van de lichaamswand door elke lichaamswand in ventrale-laterale richting uit te vouwen. De twee lichaamswanden zouden uit elkaar moeten komen.

Ge