Name: Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer een real-time cAMP-assay voor het meten van odorant-receptoractivering in levende cellen. Deze methode maakt efficiënt high-throughput screenen van receptor-ligand-interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gesteund door het Chinese National Science Foundation (31070972), de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai gemeente (16ZR1418300), het programma voor innovatieve onderzoek Team van Shanghai gemeentelijk onderwijs Commissie, de oostelijke Shanghai Geleerde programma (J50201), en het programma van de nationale fundamenteel onderzoek van China (2012CB910401).

1. Culturing en onderhoud van de cellen van de Hana3A <ol><li>behouden cellen in 10 mL van minimale essentiële medium (MEM) met 10% foetale runderserum (FBS), 100 µg/mL penicilline-streptomycine en 1,25 µg/mL amfotericine B in een 100-mm cel cultuur schotel in een 37 ° C cel cultuur incubator met 5% CO 2. Met elke andere passage, voeg 1 µg/mL puromycin te handhaven van stabiele transfectie van plasmiden (Zie Inleiding). 
	Opmerking: Voer alle stappen uit met betrekking tot de cultuur van de cel in een klasse II biologische veiligheidskast om steriele omgeving.</li>
	<li>Subcultuur in een verhouding van 10-20% in gerechten elke 2-3 dagen van de 100 mm.</li>
</ol> 2. Plating cellen voor Transfectie <ol><li>observeren de Hana3A cellen onder een Microscoop fase contrast om de levensvatbaarheid van de cellen en te schatten samenvloeiing.</li>
	<li>Alle medium uit de cel cultuur schotel gecombineerd.</li>
	<li>Wassen van cellen door het toevoegen van 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op het bord, zwenken van de schotel en de PBS aspirating.</li>
	<li>Voeg 3 mL 0,05% trypsine-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (NA2EDTA) op het bord. Mix voor 1 min of totdat alle cellen drijven zijn. 
	Opmerking: Observeren de voortgang van cellen loskoppelen van de onderkant van de plaat onder de Microscoop desgewenst.</li>
	<li>Inactivate trypsine door toevoeging van 5 mL van MEM met 10% FBS en Pipetteer omhoog en omlaag te breken van de brokken van cel mass. 
	Opmerking: Voor plating vóór transfectie, het medium gebruikt mogen geen antibiotica. Toevoeging van antibiotica kan afnemen transfectie efficiëntie.</li>
	<li>Overbrengen een passend bedrag van cellen in een buis 15-mLl afhankelijk van het aantal platen om te zijn transfected. Voor elke 96-wells-plaat, plaat 2 x 10 6 cellen of ongeveer 1/5 van een 100% confluente 100 mm schotel, geeft een telling van de cel van 2 x 10 4 cellen per well of een dichtheid van ongeveer 15-30% samenvloeiing per putje. Centrifugeer buizen bij 200 x g gedurende 5 min en gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet. 
	Opmerking: Berekening van de juiste hoeveelheid cellen worden verguld op 96-wells-platen om te voorkomen dat de woekerende of undergrowing cellen voorafgaand aan stimulatie.</li>
	<li>Toevoegen een passend bedrag van MEM met 10% FBS in de 15-mL tube en Pipetteer omhoog en omlaag te breken brokken van de cel massa. Resuspendeer de cellen met 6 mL MEM met 10% voor elke 96-wells-plaat, FBS. 
	Opmerking: Wees voorzichtig niet te genereren van luchtbellen in de buis.</li>
	<li>De zwevende cellen toevoegen in een reservoir. Met behulp van een meerkanaalspipet, Pipetteer 50 µL van cellen op elk putje van een 96-wells-plaat. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C met 5% CO 2.</li>
</ol> 3. De transfectie van plasmiden, <ol><li>vóór transfectie, observeren de vergulde cellen zorgen voor een juiste samenloop van ongeveer 30-50% per putje onder een Microscoop fase contrast en terugkeren naar de incubator.</li>
	<li>Voorbereiden op voorhand de Rho-gelabeld OR construct 11 , 21 , 22 , 28, de bijkomende factor construeert (RTP1S 22 , 36 en M3R 23), en de biosensor variant 29 , 30 door miniprep te bouwen. Kwantificeren van de DNA-concentratie door een spectrofotometer en plasmide DNA concentraties (bv naar 100 ng/µL) met gedestilleerd water zonodig aanpassen.</li>
	<li>Voorbereiding van de transfectie mengsels <ol><li>een plasmide transfectie mengsel in 500 µL van MEM voorbereiden op elke 96-wells-plaat volgens tabel 1. 
		Opmerking: Wanneer verschillende ORs worden getest op de dezelfde 96-wells-plaat, het volume van het mengsel van de transfectie en het bedrag van de plasmide DNA toegevoegd moet aangepast worden in functie van het aantal transfected putjes met een bepaalde OR.</li>
		<li>Voorbereiden een transfectie mengsel in een buis met 18 µL van lipide-gemedieerde transfectiereagens in 500 µL van MEM.</li>
	</ol></li> <li>Meng het plasmide mengsel met het mengsel van de transfectie door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten</li>
	<li>Zet de reactie stop door toevoeging van 5 mL van MEM met 10% FBS.</li>
	<li>Uit een dikke laag van steriele papieren handdoeken in de kap van de cel cultuur verspreid. Neem een 96-wells-plaat met cellen uit de incubator. Zachtjes en herhaaldelijk onttrekt de plaat ondersteboven op de stapel papieren handdoek zodat het medium wordt volledig geabsorbeerd door de keukenrol. 
	Opmerking: Doen niet krachtig of abrupt Tik op de plaat als een cellen kon verliezen.</li>
	<li>Breng 50 µL van het mengsel van gecombineerde Transfectie aan elk putje van de 96-wells-plaat en na een nacht bebroeden voor 18-24 uur bij 37 ° C met 5% CO 2. 
	Opmerking: Een tijd gestuurde transfectie en stimulatie schema moet voorafgaan aan de meting wanneer meer dan één 96-wells-plaat worden getest in één experiment om alle platen gemeten na de transfectie tegelijkertijd en stimulans belichtingstijd.</li>
</ol> 4. Stimulatie en meten of activiteit met behulp van de Real-Time kamp Assay <ol><li>observeren transfected cellen onder een Microscoop fase contrast zorgen voor een juiste samenloop van 50-80% per putje en terugkeren naar de incubator.</li>
	<li>Bereiden van het medium stimulatie door toevoeging van 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) en 5 mM glucose te Hank &#39; s evenwichtig zout oplossing (HBSS).</li>
	<li>Ontdooi de real-time cAMP assay substraat reagens aliquots op ijs. Bewaar substraat reagens bij-80 ° C bij 55 µL per buis in PCR buizen. Gebruik 1 tube per plaat.</li>
	<li>2% oplossing voor te bereiden door het mengen van 55 µL van het substraat reagens en 2750 µL HBSS/HEPES/glucose oplossing.</li>
	<li>Verspreid met een dikke laag keukenpapier op de Bank. Zachtjes en herhaaldelijk onttrekt de plaat ondersteboven op de papieren handdoek zodat het medium van de transfectie is volledig geabsorbeerd door de keukenrol.</li>
	<li>Wassen van de cellen door pipetting HBSS/HEPES/glucose oplossing aan elk putje 50 µL.</li>
	<li>Voorzichtig en herhaaldelijk onttrekt uit de HBSS/HEPES/glucose-oplossing van de 96-wells-plaat.</li>
	<li>Pipetteer 25 µL van 2% oplossing aan elk goed en Incubeer bij kamertemperatuur in donker voor 2 h.</li>
	<li>Bereiden op voorhand 1 M odorant voorraadoplossingen in DMSO en opslag bij-20 ° C tot gebruikt.</li>
	<li>Voorafgaand aan het eind van de incubatietijd, Verdun de voorraadoplossingen van odorant aan werkende concentraties in HBSS/HEPES/glucose stimulatie middellange. 
	Opmerking: De concentraties van de odorant verdunningen bereid in deze stap moeten worden verdubbeld om de opbrengst van de juiste eindconcentraties in elk putje.</li>
	<li>Met behulp van een chemiluminescentie plaat lezer en vóór toevoeging van odorant, meten van het niveau van de basale luminescentie van de plaat voor 2 opeenvolgende keer met een snelheid van 1000 ms per goed 34.</li>
	<li>Snel de plaat uit de afleesapparaat verwijderen en toevoegen van 25 µL odorant verdunningen aan elk putje en onmiddellijk beginnen met het continu luminescentie meting van alle putjes voor 20 cycli binnen 30 min. 
	Opmerking: Pipetteer zorgvuldig om te voorkomen dat besmetting van naburige wells bij het gebruik van verschillende reukstoffen en/of verschillende concentraties van de dezelfde odorant in de dezelfde plaat.</li>
</ol> 5. Data-analyse <ol><li>de gegevens exporteren vanuit de software van de lezer van de plaat van Chemoluminescentie.</li>
	<li>Berekenen genormaliseerd OR antwoord voor elk punt van de tijd met behulp van de formule 
	(luminescentie N &#8211; luminescentie basale) / (luminescentie hoogste &#8211; luminescentie basale) waar N = luminescentie waarde van een bepaalde goed; basale = gemiddelde luminescentie waarde van de twee basale luminescentie waarden; hoogste = de hoogste waarde van de luminescentie van een plaat of een reeks platen. 
	Opmerking: Afhankelijk van het doel van het experiment, alternatieve grafische voorstellingen kunnen worden aangenomen. Bijvoorbeeld voor screening tests (Zie Figuur 1) en voor het genereren van de concentratieresponskrommen, de waarde van de luminescentie van een bepaalde bron op een gewenste tijdstip tijdens de kinetische meting, zoals de maximale waarde of de verkoopcommissie, inzetbaar.</li>
</ol>

<ol><li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+scent+of+avian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li>
<li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037663578290033X">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li>
<li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors%3A+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+holy+grail%3A+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li>
<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li>
<li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors%3A+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640(2014).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9(2009).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li>
<li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MouSensor%3A+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+retention%2C+degradation%2C+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1(2011).</li>
<li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li>
<li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li>
<li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li>
<li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/~/media/files/resources/reprints/glosensor_gen_2009_gr001.ashx?la=en">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li>
<li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li>
<li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OR2M3%3A+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li>
<li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2%2C4-nonanedione%2C+a+key+food+odorant+in+aged+wines%2C+tea%2C+and+other+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smelling+Sulfur%3A+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li>
<li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-transporting+protein+1+short+%28RTP1S%29+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li>
<li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li>
<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Nauwkeurig meten van een OR activering bij blootstelling aan een bepaalde odorant is de eerste stap in het ontcijferen van de codering van de olfactorische informatie. De experimenten aangetoond in deze studie vertegenwoordigen die een voorbeeld van hoe men identificeren kan, met behulp van een in vitro OR expressie systeem, responsieve ORs onder de menselijke OR repertoire voor de geurige chemische stof van belang en vervolgens het karakteriseren van de receptor farmacologie met behulp van verschillende concent...

De betekenis van geur speelt een belangrijke rol in dieren overleven als ze op hun olfactorische capaciteiten vertrouwen te verkrijgen van voedsel, vermijden van roofdieren en gevaar onderscheiden soorten en selecteer partner1,2. De realisatie van deze functies is afhankelijk van de odorant receptoren (ORs), die individueel worden uitgedrukt aan de Ciliaire oppervlakte van olfactorische sensorische neuronen (OSNs) gelegen in de olfactorische epitheel (OE). ORs vormen de grootste familie van de superfamilie G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) met ongeveer 400 en 1200 verschillende OR genen in mens en muis, respectievelijk3,4,5. ORs geactiveerd door odorant leiden tot verhoogde intracellulaire cAMP niveaus via de sequentiële activering van olfactorische G-eiwit (Golf) en type III adenylyl cyclase (ACIII). Het resulterende verhoogde niveau van intracellulaire cAMP kon functioneren als een tweede boodschapper, die de nucleotide-gated kanaal op het celoppervlak opent, triggering toestroom van kationen met inbegrip van Ca2 + en actie potentieel, en uiteindelijk initiëren Neuro-potentieel transmissie en de olfactorische waarneming. Het proces voor het opsporen en discrimineren van een groot aantal reukstoffen door ORs wordt beschouwd als de eerste stap van olfactorische waarneming6,7.
Aangezien Buck en Axel8 eerst succesvol gekloond odorant receptoren en het mechanisme van de olfactorische waarneming geïnitieerd door ORs opgehelderd, werd deorphanization van de OR-familie één van de hotspots op dit gebied. Verschillende in vivo, ex vivo en in vitro methoden voor het meten van de activering van de OR zijn gerapporteerde9,10,11,12. Een traditionele methode die gebruikt Ca2 + imaging gevolgd door eencellige RT-PCR op OSNs ingeschakeld de identificatie van verschillende ORs tot en met alifatische odorant13,14,15. Meer recentelijk, de komst van grootschalige transcriptome analyses bevorderd de ontwikkeling van meer high-throughput in vivo methoden. De Kentucky assay geïdentificeerd eugenol - en Muskon-responsieve muis ORs met het gebruik van de S100a5-tauGFP verslaggever muis stam en microarray analyse9. Op basis van de afname van de OR mRNA niveaus na odorant blootstelling, de droom-technologie gebruikt een transcriptomic aanpak om OR activering profielen in beide soorten gewervelde en niet-gewervelde16. Ook, gezien de fosforylatie van S6 in neuronale activeringen, de Matsunami groep gesequenceerd mRNAs van gefosforyleerd ribosoom immunoprecipitations te identificeren responsieve ORs12. Tot slot de Feinstein groep gerapporteerd super sniffer muizen die als een platform om te studeren geur codering in vivo dienen kunnen, bekend als de MouSensor technologie17.
In de in vitro rijk maakt de uitdaging van het kweken van OSNs een heteroloog expressie systeem dat OR functionele expressie in vivo bootst een ideale oplossing voor het uitvoeren van grootschalig onderzoek van geurige chemicaliën voor ultraperifere regio's. Niettemin, aangezien gekweekte cellijnen van niet-olfactorische oorsprong van inheemse OSNs verschillen, of eiwitten in het endoplasmatisch reticulum en kunnen verkeer naar het plasmamembraan zijn behouden, resulterend in OR afbraak en verlies van receptor functie18 , 19. om dit probleem oplossen, uitgebreide werken zijn aangebracht om te repliceren de functionele expressie OR op de celmembraan in heterologe cellijnen. Krautwurst et al. eerst de eerste 20 aminozuren van rodopsine (Rho-tag) gekoppeld aan de N-terminal OR eiwit en dit bevorderd de celoppervlak expressie van sommige ultraperifere regio's in menselijke embryonale nier (HEK) cellen20. Door het uitvoeren van een seriële analyse van gen expressie (SALIE) bibliotheek analyse van één OSNs, Saito et al. eerst gekloond receptor-transport eiwit (RTP) familieleden, RTP1 en RTP2 en de receptor expressie enhancer eiwit 1 (REEP1), dat vergemakkelijkt OR mensenhandel aan de celmembraan en verbeterde odorant-gemedieerde reacties van ultraperifere regio's in de cellen van de HEK293T 21. op basis van deze bevindingen, de Matsunami-Fractie gebracht de cellijn van Hana3A, stabiel transfected met RTP1, RTP2, REEP1 en Gαolf in HEK293T en Transient transfected met Rho-gelabeld ORs, voor efficiënte of functionele expressie. Latere studies bleek 1) een korter vorm van RTP1, RTP1S, die meer krachtig kunnen bevorderen of functioneren dan de oorspronkelijke RTP1 eiwitten en 2) het type 3 muscarinerge acetylcholine receptor (M3R) die, OR activiteiten via remming van β-arrestin-2 verhogen kan werving, die beide met het heterologe expressie systeem kennisgemaakt voor het optimaliseren van experimentele output22,23.
Verschillende detectiemethoden zijn gebruikt om het kwantificeren van receptor activering in heterologe systemen. De assay secreted placenta alkalisch fosfatase (SEAP) werkt met een verslaggever enzym transcriptionally geregeld cAMP response-elementen (CREs), waardoor het een aantrekkelijke optie zijn voor de beoordeling van de activering van de OR. De fluorescentie wordt het gemakkelijk ontdekt in een monster van het kweekmedium na de incubatie met SEAP detectie reagens24. Met behulp van deze methode, de functies van de ultraperifere regio's, alsmede een tweede klasse aanwezig receptoren uitgedrukt in de OE-de trace amine-geassocieerde receptoren (TAARs) zijn gekenmerkt25,26,27. Een andere gemeenschappelijke methode, de luciferase assay, gebruikt een firefly luciferase verslaggever gen onder de controle van de cAMP respons-element (CRE). Meten van luminescentie gegenereerd door luciferase productie biedt een efficiënte en robuuste middel OR activering10,11,28te kwantificeren.
Real-time cAMP testen hebben ook wijd gebruikt in dynamisch toezicht op de functie van heterologe of endogene GPCRs. Een voorbeeld van deze geavanceerde gehaltebepalingen maakt gebruik van een genetisch gecodeerde biosensor variant, die beschikt over een cAMP-bindend domein gesmolten tot een gemuteerde vorm van luciferase. Wanneer kamp bindt, leidt de conformationele verandering tot het activeren van luciferase, luminescentie waaruit vervolgens kan worden gemeten met een chemiluminescentie lezer29,30. De real-time cAMP technologie is geschikt voor de-orphaning van menselijke odorant receptoren in de cellen van de HEK293 en NxG 108CC15 gemeldAss = "xref" > 31,32,33, zoals alsook in de Hana3A HEK293T-afgeleide cellen34,35. De Krautwurst-groep ook beschreven in detail de cAMP technologie in real time te geschikt voor grootschalige of screening benaderingen van de bi-directionele32,33.
Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de activering van de OR met behulp van een real-time cAMP assay in Hana3A cellen. In dit protocol wordt de luminescentie van levende cellen vooraf zijn geëquilibreerd kinetisch gemeten gedurende 30 minuten na de behandeling met specifieke vluchtige stoffen, die een meer efficiënte en nauwkeurige analyse van de activering van de OR die zijn minder gevoelig voor artefacten die zich in de cellulaire omgeving met langdurig en geur-geïnduceerde cel toxicities voordoen. Deze real-time meting voorziet in een grootschalig onderzoek van zowel de ultraperifere regio's en de liganden, evenals karakterisering van bepaalde OR-ligand paren van belang. Met behulp van deze methode, wij met succes genoemd OR5AN1 de receptor voor de muskus samengestelde Muskon door het uitvoeren van een screening tegen 379 menselijke ORs en vervolgens bevestigt het resultaat positieve screening.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP reagent</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP plasmid</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A-cellen</td><td></td><td></td><td>beschikbaar van auteurs op verzoek</td></tr><tr><td>HBSS, zonder calcium of magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>M3R plasmid</td><td></td><td></td><td>gekloond in een zoogdier expressievector zoals pCI</td></tr><tr><td>MEM, met EBSS en L-glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Musk tibetene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>OR plasmiden</td><td></td><td></td><td>gekloond met een Rho-tag in een zoogdier expressievector zoals pCI</td></tr><tr><td>PBS, zonder calcium of magnesium</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid miniprep kit</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S plasmid</td><td></td><td></td><td>gekloond in een zoogdier expressievector zoals pCI</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>0,2-mL PCR buis</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1,5-mL Eppendorf buis</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL 17 mm x 120 mm conische buis</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>8-wells en/of 12-wells multichannel pipetman</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-wells platte bodem witte celkweekplaat</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm celkweekschaal</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast klasse II met laminaire stroming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celkweekincubator, met 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, met zwevende emmer rotor voor 15-ml conische buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infinite F200 plate reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase-contrast microscoop met x10 en x20 objectieven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele reagent reservoirs voor multichannel distributie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele papieren handdoek</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-cel meting van odorant receptor activering met behulp van een real-time camp assay

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

De enorme grootte van de zoogdieren odorant receptor (OR) families moeilijkheden te vinden hun cognaat liganden onder talrijke vluchtige stoffen opleveren. Om efficiënt en accuraat deorphanize ORs, combineren we het gebruik van een heteroloog cellijn uitspreken zoogdieren ORs en een plasmide genetisch gemodificeerde biosensor voor het meten van cAMP productie stroomafwaarts van de activering van de OR in real-time. Deze test kan worden gebruikt om scherm odorant tegen ORs en vice versa. Positieve odorant-receptor interacties van de schermen kunnen vervolgens worden bevestigd door testen tegen verschillende concentraties van de geur, het genereren van concentratieresponskrommen. Hier wordt deze methode gebruikt voor het uitvoeren van een high-throughput screening van een geurige samengestelde tegen een menselijke OR bibliotheek uitgedrukt in Hana3A cellen en bevestigd dat de receptor positief reageert de cognaat receptor voor de verbinding van belang. Wij vonden dit high-throughput detectiemethode efficiënt en betrouwbaar bij de beoordeling van de activering van de OR en onze gegevens geven een voorbeeld van het mogelijke gebruik ervan in OR functionele studies.

Muskon is het hoofdbestanddeel van de aromatische van natuurlijke musk. De nieuwste studies geïdentificeerde OR5AN1 als een menselijke receptor voor Muskon en andere macrocyclische muskus-verbindingen op basis van homologie naar de muis of, MOR215-1, gekloond uit Muskon-responsieve glomeruli in muizen37,38gedragen. Door screening van de menselijke OR repertoire, onze fractie en de Fractie van de Touhara ook genoemd OR5AN1 een bela...

Karakterisering van de functie van odorant receptoren serveert een onmisbaar onderdeel in het proces van deorphanization. Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van odorant receptoren in real time via een kamp assay.

Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Het algemene doel van deze real-time high-throughput cyclic AMP-assay is het screenen van geurstoffen tegen geurreceptoren en vice versa. Aangezien muizen nuttig zijn voor het onderzoeken van de werking van geurreceptoren, maken zij grootschalige screenings van zowel geurreceptoren als liganden mogelijk, evenals farmacologische karakteriseringen van receptor-ligandparen van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de activering van receptor door geurstoffen efficiënt en betrouwbaar kunnen beoordelen.Heteroloog odorant-receptor expressiesysteem met levende cellen. Begin met het observeren van Hana3A-cellen onder een fasecontrastmicroscoop om de levensvatbaarheid van de cellen te controleren en de confluentie te schatten. Aspireer vervolgens al het medium uit de kweekschaal.Was vervolgens de cellen door 10 milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing op de plaat toe te voegen, de schaal te ronddraaien en de PBS af te zuigen. Voeg daarna drie milliliters 0,5%trypsine-EDTA toe aan de plaat. Laat de trypsine één minuut op de cellen inwerken of totdat alle cellen los zijn komen te liggen.Inactiveer de trypsine door 5 milliliter MEM met 10% FBS toe te voegen en door op en neer te pipetteren om klonten celmassa op te breken. Na het uitvoeren van een celtelling wordt 2x10⁶ cellen per te transfecteren 96-wellplaat overgebracht naar een buis van 15 milliliter. Het is belangrijk dat u het juiste aantal cellen berekent dat op de 96-wellplaat moet worden voorbereid om overgroei of ondergroei van cellen vóór stimulatie te voorkomen.Centrifugeer de buisjes bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer vervolgens het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Voeg zes milliliter medium zonder antibiotica toe voor elke 96-well plaat en pipetteer dit op en neer zonder luchtbellen te vormen om klonters van de celmassa op te lossen.Breng de gesuspendeerde cellen over naar een reservoir. Pipetteer met een multichannelpipet 50 µL cellen in elke put van de 96-wells platen. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C met 5% CO2.Observeer vóór de transfectie de geplaatste cellen onder een fasecontrastmicroscoop om te controleren of er een geschikte confluentie van ongeveer 30 tot 50% per put is bereikt, en plaats ze vervolgens terug in de incubator. Volg de rij gemarkeerd met odorant-to-receptor construct, de accessory factor constructs en de cyclic AMP biosensor variant construct. Bereid vervolgens een plasmatransfectiemengsel voor in 500 µL MEM voor elke 96-wells plaat.Bereid vervolgens een transfectiemengsel voor bestaande uit 18 µL lipid-gemedieerd transfectiereagens in 500 µL MEM. Meng het transfectiemengsel met het plasmamengsel door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Incubeer dit vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Stop na de incubatie de reactie door 5 milliliters MEM met 10%FBS aan het transfectiemengsel toe te voegen. Spreid vervolgens een dikke laag steriele papieren handdoeken uit in de celkweekkap. Haal een 96-well plaat met cellen uit de incubator.Tik de plaat voorzichtig en herhaaldelijk ondersteboven op de stapel papieren handdoeken, zodat het medium volledig door de papieren handdoek wordt geabsorbeerd. Breng 50 µL van het gecombineerde transfectiemengsel over naar elke well van de 96-well plaat en incubeer dit gedurende 18 tot 24 uur overnacht bij 37 °C met 5% CO2. U kunt de transfectie en het stimulatieschema zo beheren dat, indien er meer dan één 96-well plaat in één experiment wordt getest, alle platen hetzelfde transfectie- en blootstellingsinterval volgen.Observeer vóór stimulatie de getransfecteerde cellen onder een fasecontrastmicroscoop om een juiste confluentie van 50 tot 80% per putje te waarborgen voordat ze worden teruggeplaatst in de incubator. Bereid vervolgens stimuleringsmedium voor door 10 millimolar heaps en vijf millimolar glucose toe te voegen aan Hanks' balanced salt solution. Ontdooi aliquoten van 55 microliters van het real-time cyclic AMP assay substrate reagent op ijs.Bereid een 2% equal abration-oplossing door 55 microliters van het substraatreagens te mengen met 2.750 microliters stimulatiemedium. Nadat er een dikke laag papieren handdoeken op de werkbank is uitgespreid, wordt de plaat voorzichtig en herhaaldelijk ondersteboven op de papieren handdoeken getikt, zodat het transfectiemedium door de papieren handdoeken wordt geabsorbeerd. Was de cellen door 50 microliters stimulatiemedium in elke well te pipetteren.Tik het stimulatiemedium voorzichtig en herhaaldelijk uit de 96-wells plaat. Pipetteer 25 µL van de 2% equilibratieroplossing in elke well en incubeer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker. Verdun vóór het einde van de incubatietijd de ontdooide voorraadoplossingen van de geurstof tot de werkkoncentratie met stimulatiemedium.Meet vóór de toevoeging van de geurstoffen het basale luminescentieniveau van de plaat met een chemiluminescentie-plaatlezer. Verwijder de plaat snel uit de plaatlezer en voeg 25 µL van de geurstofverdunningen toe aan elke well. Start vervolgens onmiddellijk een continue luminescentiemeting van alle wells gedurende 20 cycli binnen 30 minuten.379 unieke menselijke geureceptoren werden gescreend tegen 30 micromolair muskon met behulp van de real-time cyclic AMP-assay. Gekleurde blokken langs de X-as geven verschillende families van menselijke geureceptoren aan. De Y-as representeert de genormaliseerde luminescentie 30 minuten na toevoeging van de geurstof, wanneer de respons voor de positieve controle het maximum bereikte.De respons van OR5AN1 wordt weergegeven. Deze figuur toont real-time metingen van de activatie van OR5AN1 door verschillende concentraties muscone en het resultaat van een negatieve controle zonder geur. De pijl geeft het tijdstip van toevoeging van de geurstof aan.Hier wordt een concentratie-responscurve van OR5AN1 tegen muscone getoond, 30 minuten na toevoeging van de odorant. De hier beschreven techniek neemt in totaal drie dagen in beslag, beginnend met een voorraadplaat van cultuurlagen op de eerste dag. Eenmaal beheerst, kan het proces op de laatste dag in drie uur per 96-wells plaat worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de activering van geurreceptoren kunt beheren met behulp van een cyclisch AMP-assay om de resultaten te benutten.

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier laten we zien een protocol voor het uitvoeren van live cell vlekken die kunnen worden gebruikt om de geurstof receptoren gemakkelijk te detecteren op het oppervlak van HEK293T cellen. Daarnaast kan het ook worden gebruikt om de analyse voor oppervlakte-expressie van andere chemosensory receptoren of GPCR's.

Het testen van oppervlakte-expressie van receptoren Chemosensory in heterologe cellen

This video demonstrates the protocol for measuring odorant receptor activation in transfected cells using a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor and luminescence detection. The method is applied to study receptor-ligand interactions and signaling pathways in olfactory neurons.

Measuring Odorant Receptor Activation using a Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay

Source: de March, C. A. et. al., Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the method to monitor the real-time activation of odorant receptors in recombinant mammalian cells using luminescence measurement. Odorant binding triggers G-protein activation and cAMP production, activating glosensor proteins that emit luminescence upon substrate binding, providing a quantitative measure of receptor response.

Real-Time Monitoring of Odorant Receptor Activation in Recombinant Cells

Aanhoudende activering van remmende G-eiwit gekoppelde receptoren leidt tot een sensibilisering van adenylylcyclase signalering. Om de essentiële moleculaire pathways identificeren nonbiased stappen noodzakelijk zijn, maar deze strategie vereist de ontwikkeling van een schaalbare celgebaseerde cAMP overgevoeligheid assay. Hierin beschrijven we een overgevoeligheid test voor kleine moleculen en siRNA screening.

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

Olfactorische receptor activering patronen coderen geur identiteit, maar het gebrek aan gepubliceerde gegevens identificeren geurstof liganden voor zoogdieren reukreceptoren belemmert de ontwikkeling van een alomvattend model van geur codering. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor zeer snelle identificatie van olfactorische receptor liganden en kwantificering van receptoractivering vergemakkelijken.

High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.

Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen

Fysiologisch, worden odorant receptoren geactiveerd door odorant moleculen in de fase van de damp ingeademd. Echter, meest in vitro systemen gebruiken vloeibare fase odorant stimulatie. Hier presenteren we een methode waarmee in vitro bewaking in real-time van odorant receptor activering op odorant stimulatie in damp fase.

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ  bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

Olfactorische receptor neuronen (ORNs) om te zetten geur signalen eerst in een receptor stroom die op zijn beurt actiepotentialen die worden overgebracht naar de tweede orde neuronen in de bulbus olfactorius triggers. Hier beschrijven we de zuig-pipet techniek om tegelijkertijd op te nemen van de geurstof-geïnduceerde receptor huidige en actiepotentialen van muis ORNs.

Odorant-geïnduceerde responsen Opgenomen van olfactorische receptor neuronen met behulp van de zuignap Pipet Techniek

Leer een real-time cAMP-assay voor het meten van odorant-receptoractivering in levende cellen. Deze methode maakt efficiënt high-throughput screenen van receptor-ligand-interacties mogelijk.

Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

Meer video's verkennen