Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

Het algemene doel van deze real-time high-throughput cyclic AMP-assay is het screenen van geurstoffen tegen geurreceptoren en vice versa. Aangezien muizen nuttig zijn voor het onderzoeken van de werking van geurreceptoren, maken zij grootschalige screenings van zowel geurreceptoren als liganden mogelijk, evenals farmacologische karakteriseringen van receptor-ligandparen van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de activering van receptor door geurstoffen efficiënt en betrouwbaar kunnen beoordelen.

Heteroloog odorant-receptor expressiesysteem met levende cellen. Begin met het observeren van Hana3A-cellen onder een fasecontrastmicroscoop om de levensvatbaarheid van de cellen te controleren en de confluentie te schatten. Aspireer vervolgens al het medium uit de kweekschaal.

Was vervolgens de cellen door 10 milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing op de plaat toe te voegen, de schaal te ronddraaien en de PBS af te zuigen. Voeg daarna drie milliliters 0,5%trypsine-EDTA toe aan de plaat. Laat de trypsine één minuut op de cellen inwerken of totdat alle cellen los zijn komen te liggen.

Inactiveer de trypsine door 5 milliliter MEM met 10% FBS toe te voegen en door op en neer te pipetteren om klonten celmassa op te breken. Na het uitvoeren van een celtelling wordt 2x10⁶ cellen per te transfecteren 96-wellplaat overgebracht naar een buis van 15 milliliter. Het is belangrijk dat u het juiste aantal cellen berekent dat op de 96-wellplaat moet worden voorbereid om overgroei of ondergroei van cellen vóór stimulatie te voorkomen.

Centrifugeer de buisjes bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer vervolgens het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Voeg zes milliliter medium zonder antibiotica toe voor elke 96-well plaat en pipetteer dit op en neer zonder luchtbellen te vormen om klonters van de celmassa op te lossen.

Breng de gesuspendeerde cellen over naar een reservoir. Pipetteer met een multichannelpipet 50 µL cellen in elke put van de 96-wells platen. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C met 5% CO2.

Observeer vóór de transfectie de geplaatste cellen onder een fasecontrastmicroscoop om te controleren of er een geschikte confluentie van ongeveer 30 tot 50% per put is bereikt, en plaats ze vervolgens terug in de incubator. Volg de rij gemarkeerd met odorant-to-receptor construct, de accessory factor constructs en de cyclic AMP biosensor variant construct. Bereid vervolgens een plasmatransfectiemengsel voor in 500 µL MEM voor elke 96-wells plaat.

Bereid vervolgens een transfectiemengsel voor bestaande uit 18 µL lipid-gemedieerd transfectiereagens in 500 µL MEM. Meng het transfectiemengsel met het plasmamengsel door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Incubeer dit vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Stop na de incubatie de reactie door 5 milliliters MEM met 10%FBS aan het transfectiemengsel toe te voegen. Spreid vervolgens een dikke laag steriele papieren handdoeken uit in de celkweekkap. Haal een 96-well plaat met cellen uit de incubator.

Tik de plaat voorzichtig en herhaaldelijk ondersteboven op de stapel papieren handdoeken, zodat het medium volledig door de papieren handdoek wordt geabsorbeerd. Breng 50 µL van het gecombineerde transfectiemengsel over naar elke well van de 96-well plaat en incubeer dit gedurende 18 tot 24 uur overnacht bij 37 °C met 5% CO2. U kunt de transfectie en het stimulatieschema zo beheren dat, indien er meer dan één 96-well plaat in één experiment wordt getest, alle platen hetzelfde transfectie- en blootstellingsinterval volgen.

Observeer vóór stimulatie de getransfecteerde cellen onder een fasecontrastmicroscoop om een juiste confluentie van 50 tot 80% per putje te waarborgen voordat ze worden teruggeplaatst in de incubator. Bereid vervolgens stimuleringsmedium voor door 10 millimolar heaps en vijf millimolar glucose toe te voegen aan Hanks' balanced salt solution. Ontdooi aliquoten van 55 microliters van het real-time cyclic AMP assay substrate reagent op ijs.

Bereid een 2% equal abration-oplossing door 55 microliters van het substraatreagens te mengen met 2.750 microliters stimulatiemedium. Nadat er een dikke laag papieren handdoeken op de werkbank is uitgespreid, wordt de plaat voorzichtig en herhaaldelijk ondersteboven op de papieren handdoeken getikt, zodat het transfectiemedium door de papieren handdoeken wordt geabsorbeerd. Was de cellen door 50 microliters stimulatiemedium in elke well te pipetteren.

Tik het stimulatiemedium voorzichtig en herhaaldelijk uit de 96-wells plaat. Pipetteer 25 µL van de 2% equilibratieroplossing in elke well en incubeer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker. Verdun vóór het einde van de incubatietijd de ontdooide voorraadoplossingen van de geurstof tot de werkkoncentratie met stimulatiemedium.

Meet vóór de toevoeging van de geurstoffen het basale luminescentieniveau van de plaat met een chemiluminescentie-plaatlezer. Verwijder de plaat snel uit de plaatlezer en voeg 25 µL van de geurstofverdunningen toe aan elke well. Start vervolgens onmiddellijk een continue luminescentiemeting van alle wells gedurende 20 cycli binnen 30 minuten.

379 unieke menselijke geureceptoren werden gescreend tegen 30 micromolair muskon met behulp van de real-time cyclic AMP-assay. Gekleurde blokken langs de X-as geven verschillende families van menselijke geureceptoren aan. De Y-as representeert de genormaliseerde luminescentie 30 minuten na toevoeging van de geurstof, wanneer de respons voor de positieve controle het maximum bereikte.

De respons van OR5AN1 wordt weergegeven. Deze figuur toont real-time metingen van de activatie van OR5AN1 door verschillende concentraties muscone en het resultaat van een negatieve controle zonder geur. De pijl geeft het tijdstip van toevoeging van de geurstof aan.

Hier wordt een concentratie-responscurve van OR5AN1 tegen muscone getoond, 30 minuten na toevoeging van de odorant. De hier beschreven techniek neemt in totaal drie dagen in beslag, beginnend met een voorraadplaat van cultuurlagen op de eerste dag. Eenmaal beheerst, kan het proces op de laatste dag in drie uur per 96-wells plaat worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de activering van geurreceptoren kunt beheren met behulp van een cyclisch AMP-assay om de resultaten te benutten.