Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay
2 oktober 2017
Karakterisering van de functie van odorant receptoren serveert een onmisbaar onderdeel in het proces van deorphanization. Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van odorant receptoren in real time via een kamp assay.
Het algemene doel van deze real-time high-throughput cyclic AMP-test is om geuren te screenen tegen geurreceptoren en vice versa. Omdat muizen nuttig zijn voor het onderzoeken van geurreceptorfunctioneren omdat het grotere schaalscreenings mogelijk maakt van zowel geurreceptoren als de liganden, evenals farmacologische cartelisaties van een receptor-ligandparen van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de activering van geur-naar-receptor efficiënt en betrouwbaar kunnen beoordelen.
Heteroloog geur-naar-receptor expressiesysteem met behulp van levende cellen. Begin door Hana3A-cellen te observeren onder een fasecontrastmicroscoop om de levensvatbaarheid van de cellen te controleren en de confluëntie te schatten. Aspteer vervolgens al het medium uit de celcultuurschaal.
En was de cellen door 10 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing op de plaat toe te voegen, de schaal te laten draaien en de PBS af te zuigen. Voeg vervolgens de drie milliliter van 0,5% trypsin-EDTA toe aan de plaat. Laat het trypsine een minuut op de cellen of tot alle cellen drijvend zijn.
Deactiveer het trypsine door 5 milliliter MEM met 10% FBS toe te voegen en op en neer te pipetteren om brokken celmassa te breken. Na het uitvoeren van een celtelling, zet 2x10 tot de 6de cellen per 96-well plaat over naar een buis van 15 milliliter om te worden getransfecteerd. Het is belangrijk dat u het juiste aantal cellen berekent dat moet worden voorbereid op een 96-well plaat om overgroei of onderontwikkeling van cellen vóór stimulatie te voorkomen.
Centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten bij 200 keer G. En zuig vervolgens het supernatant af zonder de celpallet te verstoren. Voeg voor elke 96-well plaat zes milliliter medium zonder antibiotica toe en pipetteer op en neer zonder luchtbellen te maken om brokken celmassa te breken.
Breng de gesuspendeerde cellen over in een reservoir. Pipetteer met behulp van een multikanaals pipetteerder 50 microliter cellen in elk putje van de 96-well platen. Incubereer een nacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.
Observeer vóór transfectie de aangebrachte cellen onder een fasecontrastmicroscoop om een goede confluëntie van ongeveer 30 tot 50% per putje te garanderen en keer dan terug naar de incubator. Volg de rij met het geur-naar-receptorconstruct gemarkeerd, de accessoire factorconstructen en de variantconstruct van de cyclic AMP biosensor. Bereid vervolgens een plasmatransfectiemengsel voor in 500 microliter MEM voor elke 96-well plaat.
Bereid vervolgens een transfectiemengsel voor dat 18 microliter lipide-gemedieerde transfectiereagent bevat in 500 microliter MEM. Mix het transfectiemengsel met het plasmamengsel door op en neer te pipetteren. Incubeer vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur.
Na de incubatie, stop de reactie door 5 milliliter MEM met 10% FBS toe te voegen aan het transfectiemengsel. Verspreid vervolgens een dikke laag steriele papieren handdoeken in de cellencultuurhood. Neem een 96-well plaat met cellen uit de incubator.
Tik voorzichtig en herhaaldelijk met de plaat ondersteboven op de stapel papieren handdoeken zodat het medium volledig wordt opgenomen door de papieren handdoek. Breng 50 microliter van het gecombineerde transfectiemengsel over in elk putje van de 96-well plaat en incubeer een nacht gedurende 18 tot 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. U kunt de transfectie en het stimulatieschema beheren, zolang het instrument langer dan één 96-well plaat test in één experiment, zodat alle platen worden gespiegeld na hetzelfde transfectie- en distillersblootstellingsinterval.
Voor de stimulatie, observeer de getransfecteerde cellen onder een fasecontrastmicroscoop om een goede confluëntie van 50 tot 80% per putje te garanderen voordat u terugkeert naar de incubator. Bereid vervolgens stimulatiemedium voor door 10 millimolaren heuvels en vijf millimolaren glucose toe te voegen aan Hanks' gebalanceerde zout oplossing. Ontdooi 55 microliter allokvaten van real-time cyclic AMP-test substraatreagens allokvaten op ijs.
Bereid een 2% gelijke abratie oplossing voor door 55 microliter van het substraatreagens en 2, 750 microliters van het stimulatiemedium te mengen. Nadat u een dikke laag papieren handdoeken op de werkbank hebt verspreid, tik voorzichtig en herhaaldelijk met de plaat ondersteboven op de papieren handdoeken zodat het transfectiemedium wordt opgenomen door de papieren handdoeken. Was de cellen door 50 microliter stimulatiemedium in elk putje te pipetteren.
Tik voorzichtig en herhaaldelijk het stimulatiemedium uit de 96-well plaat. Pipetteer 25 microliter van 2% equilibratieoplossing in elk putje en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker. Voorafgaand aan het einde van de incubatietijd, verdun ontdooide geur stockoplossingen tot werkconcentratie en stimulatiemedium.
Voor het toevoegen van geuren, gebruik een chemiluminescentie platelezer om het basale luminescentieniveau van de plaat te meten. Verwijder snel de plaat uit de platelezer en voeg 25 microliter van de geurverdunningen toe aan elk putje. Begin vervolgens onmiddellijk met continue luminescentiemeting van alle putjes gedurende 20 cycli binnen 30 minuten.
379 unieke menselijke geurreceptoren werden gescreend tegen 30 micromolar muscone met behulp van de real-time cyclic AMP-test. Gekleurde blokken langs de X-as geven verschillende menselijke geur-receptorfamilies aan. De Y-as vertegenwoordigt genormaliseerde luminescentie 30 minuten na geurtoevoeging wanneer de respons het maximum bereikte voor de positieve controle.
De respons van OR5AN1 is aangegeven. Deze figuur toont real-time metingen van OR5AN1 activering door verschillende concentraties muscone en het resultaat van een negatieve controle zonder geur. De pijl geeft het tijdstip van geurtoevoeging aan.
Hier wordt een concentratieresponscurve van OR5AN1 tegen muscone 30 minuten na geurtoevoeging getoond. De hier beschreven techniek duurt in tota
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor real-time meting van odorant receptor activering met behulp van een cyclic AMP assay. De techniek maakt efficiënte screening van odoranten tegen receptoren mogelijk, waarbij de voordelen van een heteroloog expressiesysteem worden benut.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Reukbiologie
- Farmacologie
Achtergrond
- Odorant receptoren spelen een cruciale rol in het reukvermogen.
- Begrip van receptoractivering is essentieel voor deorphanisatie.
- Muizen worden veel gebruikt voor het bestuderen van odorant receptorfuncties.
- Real-time assays verhogen de efficiëntie van screeningprocessen.
Doel van het onderzoek
- Om een high-throughput methode voor het screenen van odoranten te ontwikkelen.
- Om de activering van odorant receptoren in real time te beoordelen.
- Om farmacologische karakterisering van receptor-ligand paren te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Real-time high-throughput cyclic AMP assay.
- Heteroloog expressiesysteem met behulp van levende cellen.
- Observatie van Hana3A cellen voor levensvatbaarheid en confluentie.
- Screening van odoranten tegen odorant receptoren.
Belangrijkste resultaten
- De assay maakt betrouwbare beoordeling van odorant-tot-receptor activering mogelijk.
- Efficiënte screening van zowel receptoren als liganden werd bereikt.
- De methode ondersteunt grootschaligere onderzoeken.
- Cellevensvatbaarheid werd bevestigd vóór experimenten.
Conclusies
- Deze methode verhoogt het begrip van odorant receptorfuncties.
- Het biedt een betrouwbaar platform voor farmacologische studies.
- De aanpak kan worden toegepast op verschillende receptor-ligand interacties.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This real-time cAMP assay enables high-throughput screening of odorant receptors, addressing a key bottleneck in olfactory target deorphanization. By providing quantitative, real-time readouts of receptor activation, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and sensory biology discovery programs. The method enhances predictive confidence in receptor-ligand interactions, informing portfolio decisions for olfactory target programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking odorant exposure to receptor-specific cAMP responses.
- Operational Value: Supports functional validation of orphan receptors through dose-dependent activation profiling.
- Translational Value: Generates concentration-response data that inform target confidence and lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces normalized luminescence outputs that allow direct comparison of odorant potency across receptor families.
- Operational Value: Enables reproducible, plate-based screening of chemical libraries against receptor panels in a 96-well format.
- Scalability Value: Compatible with multi-plate runs, supporting medium-throughput campaigns for ligand discovery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links receptor activation to downstream signaling, providing mechanistic insight into olfactory transduction pathways.
- Translational Value: Generates pharmacologically relevant data (EC50, efficacy) that can inform biomarker strategy in sensory disorders.
- Preclinical Alignment: Uses a human receptor library in a mammalian cell line, enhancing relevance to human biology.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation after receptor cloning and prior to lead optimization, by delivering functional confirmation of receptor-ligand engagement.
- Discovery Biology: Tests biological hypotheses about receptor specificity and ligand activation in a live-cell context.
- Screening: Delivers quantitative, real-time cAMP measurements that enable hit identification and ranking.
- Analytics: Provides normalized luminescence and kinetic profiles that support inter-well and inter-plate comparison.
- Translational Research: Uses human odorant receptors in Hana3A cells, improving relevance to human olfactory function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening diverse chemosensory targets beyond olfaction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in receptor activation by measuring real-time second messenger production.
- Operational Value: Standardizes assay conditions across plates, improving reproducibility and reducing variability in screening campaigns.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions on target validity by confirming functional responses early in discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by filtering non-responders and focusing resources on validated receptor-ligand pairs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and live-cell assay handling.
- Depends on luminescence plate readers capable of kinetic measurements over 30-minute intervals.
- Necessitates standardization of transfection efficiency and cell confluence across wells for reliable signals.
- Requires optimization of odorant solubility and dilution in stimulation medium to avoid artifacts.
- Limited to Gs-coupled receptors that modulate cAMP; not applicable to Gi- or Gq-coupled pathways without biosensor adaptation.
