Een geoptimaliseerde Hemagglutination inhibitie (HI) Assay te kwantificeren van Influenza-specifieke antilichamen Titers
1 december 2017
De gepresenteerde protocollen beschrijven het uitvoeren van een hemagglutination inhibitie-test om te kwantificeren van influenza-specifieke antilichamen titers van serummonsters van influenza vaccinontvangers. De eerste bepaling bepaalt optimale virusantigeen concentraties door hemagglutination. De tweede test kwantificeert influenza-specifieke antilichamen titers door inhibitie van de hemagglutination.
Het algemene doel van deze hemagglutinatie-inhibitietest is het meten van de antilichaamtiters tegen specifieke virussen van belang. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de vaccinologie over vaccin-gemedieerde immuniteit en bescherming binnen verschillende populaties en over diverse leeftijds- en patiëntgroepen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze nauwkeurig is en dat het een snelle bepaling van de titer maakt voor de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in menselijke antilichaamtiters, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals antilichaamtiters voor muisserum en kweeksupernatanten. Begin met het labelen van 96-well microtiterplaten met de juiste experimentele informatie. Zet de plaat vervolgens in een verticale positie en gebruik een multikanalenpipet om 25 µL PBS aan elke well toe te voegen, behalve aan de eerste well van de onderste achterste titratierij.
Voeg 50 µL van de vers bereide antigeenoplossing van belang toe aan de eerste put van de rij voor de terugtitratie, gevolgd door de toevoeging van 25 µL RDE-behandelde serummonsters aan de eerste putten van de bovenste tien rijen. Voeg 25 µL van het juiste antiserum toe aan de eerste put van de 11e rij als positieve controle. Verplaats vervolgens 25 µL van de eerste put van elke rij naar de opeenvolgende putten om seriële tweevoudige verdunningen uit te voeren.
Pipette 10 tot 15 keer op en neer voor elke verdunningsstap en gooi de laatste 25 microliter uit de laatste putjes weg. Voeg vervolgens 25 microliter van de antigeenoplossing toe aan elk putje in de rijen één tot en met 11 en 25 microliter PBS aan elk putje van de rij voor de terugtitratie. Tik de plaat voorzichtig 10 keer op alle vier de zijkanten om te mengen.
Dek de plaat vervolgens 30 minuten af bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 50 µL rode bloedceloplossing toe aan elke well en meng de plaat door opnieuw te tikken. Dek de plaat daarna opnieuw af en incubeer de rode bloedcellen volgens de gebruikte soort, zoals beschreven in de tabel.
Nadat de rode bloedcellen aan de plaat zijn toegevoegd, dient de juiste incubatietijd voor het type bloed dat in de assay wordt gebruikt, strikt te worden aangehouden. Een te korte of te lange incubatie zal leiden tot een onjuiste interpretatie van de resultaten. Beoordeel aan het einde van de incubatie de hemagglutinatie door de plaat gedurende 25 seconden 90 graden te kantelen en noteer de resultaten voor elke put, terwijl de plaat nog gekanteld is, op een geprint schema van de 96-wells plaat.
In dit experiment werd de door het vaccin geïnduceerde antilichaamrespons beoordeeld bij 26 gezonde vrijwilligers die voorafgaand aan het griepseizoen van 2015 een geïnactiveerd, trivalent influenzavaccin ontvingen dat influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 en B/Massachusetts/O2/2012 bevatte. Er werd een kruisreactieve immuunrespons waargenomen voor de virusstammen A/H3N2/Switzerland/2013 en A/H3N2/Texas/2012, waarbij significant lagere geometrische gemiddelde hemagglutinatie-inhibitietiters en een lagere geïnduceerde seroprotectie tegen influenza A/H3N2/Switzerland/2013 werden vastgesteld in vergelijking met influenza A/H3N2/Texas/2012. Na vaccinatie stegen de antilichaamtiters tegen beide stammen, ondanks dat de A/H3N2/Switzerland/2013-stam niet in het vaccin aanwezig was.
Viraal hemagglutinine vertoont een soortafhankelijk potentieel voor erytrocytenhemagglutinatie. Opvallend is dat cavia-bloed niet correct hemagglutineert met influenza B en dat kalkoenenbloed het potentieel heeft voor hemagglutinatie met hoge titers en een lage kruisreactiviteit. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het serum met RDE moet worden behandeld om alle aspecifieke remmers en aspecifieke binding tijdens de hemagglutinatie van het virus te inactiveren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals ELISA, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de rol van individuele pathogeen-specifieke immunoglobulinen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van virale immunologie om ons begrip van vaccin-gerelateerde immuniteit bij gezonde en immuungecompromitteerde patiënten binnen verschillende leeftijdsgroepen verder te verdiepen.
Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van een hemagglutinatie-inhibitie-assay om influenza-stam specifieke antilichaamtiters op grote schaal te kwantificeren. Vergeet niet dat het werken met virale antigenen, dierlijk bloed en menselijke serummonsters uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken in een BSL2-laboratorium, tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het uitvoeren van een hemagglutinatie-inhibitietest om influenza-specifieke antilichaamtiters in serummonsters te kwantificeren. De methode is essentieel voor het begrijpen van vaccin-gemedieerde immuniteit in verschillende populaties.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Vaccinologie
- Immunologie
- Serologie
Achtergrond
- De hemagglutinatie-inhibitietest meet antilichaamresponsen op influenza.
- Het biedt inzicht in de effectiviteit van vaccins en de immuniteit van de populatie.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende soorten monsters, waaronder menselijk serum en serum van muizen.
- Het begrijpen van antilichaamtiters is essentieel voor het evalueren van de prestaties van vaccins.
Doel van de studie
- Om influenza-specifieke antilichaamtiters bij gevaccineerden te kwantificeren.
- Om de immuunrespons over verschillende demografische groepen te beoordelen.
- Om een snelle en nauwkeurige methode voor titerbepaling te bieden.
Gebruikte methoden
- Het labelen van 96-wells microtiterplaten met experimentele informatie.
- Het gebruik van een meerkanaalpipet om PBS aan de wells toe te voegen.
- Het uitvoeren van hemagglutinatie om de optimale concentraties van het virale antigeen te bepalen.
- Het uitvoeren van hemagglutinatie-inhibitie om antilichaamtiters te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- De assay kwantificeert nauwkeurig de antilichaamtiters tegen influenza.
- Het demonstreert de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen in serummonsters.
- De resultaten kunnen worden gebruikt ter ondersteuning van vaccinontwikkeling en strategieën voor de volksgezondheid.
- De methode is aanpasbaar voor diverse monstertypes en populaties.
Conclusies
- De hemagglutinatieremmingsassay is een betrouwbare methode voor het meten van immuunresponsen.
- Deze techniek vergroot het inzicht in vaccinatie-geïnduceerde immuniteit.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere virale infecties en populaties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Een nauwkeurige kwantificering van influenza-specifieke antilichaamtiters is essentieel voor het evalueren van vaccin-geïnduceerde immuniteit en het sturen van immunogeniciteitsbeoordelingen in preklinische en klinische ontwikkeling. De hemagglutinatie-inhibitietest (HI-assay) biedt een gestandaardiseerde, snelle methode om neutraliserende antilichaamresponsen in diverse populaties te meten, wat datagestuurde go/no-go-beslissingen ondersteunt bij de voortgang van de vaccine-pipeline. Door cross-strain reactiviteitsanalyse en soortspecifieke optimalisatie van erytrocyten mogelijk te maken, verhoogt deze assay het voorspellend vertrouwen in translationele immunologiestudies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt vaccin-gemedieerde immuunresponsen door strain-specifieke antilichaamtiters te kwantificeren, wat bijdraagt aan mechanische risicobeperking van antigenetische targets.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van hemagglutinine als een belangrijk influenzantigeen mogelijk via inhibitie van virale agglutinatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Standaardiseert antigeenconcentraties via hemagglutinatietitratie (HA), waardoor reproduceerbare inputs voor downstream HI-screening worden gegarandeerd.
- Operationele waarde: Ondersteunt high-throughput serumscreening met behulp van seriële tweevoudige verdunningen in een 96-wells formaat, wat de schaalbaarheid van de assay verbetert.
- Wetenschappelijke waarde: Minimaliseert kruisreactiviteit door empirische selectie van rode bloedcellen van dieren (bijv. cavia, kalkoen), waardoor de specificiteit van de assay voor influenza B en heterologe stammen wordt verhoogd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Meet door vaccins geïnduceerde seroprotectie en geometrische gemiddelde titers (GMT's) in gezonde cohorten, wat translationele biomarkers van immunogeniciteit oplevert.
- Operationele waarde: Maakt cross-functionele vergelijking van immuunresponsen tussen leeftijdsgroepen en patiëntenpopulaties mogelijk middels gestandaardiseerde titer-afkapwaarden.
- Wetenschappelijke waarde: Detecteert kruisreactieve immuunresponsen op niet-vaccinstammen (bijv. A/H3N2/Switzerland/2013), wat bijdraagt aan het ontwerp van breedspectrumvaccins.
Integratie van Pipeline & Workflow
De HI-assay past binnen de workflow voor immunogeniciteit, van vroege ontdekking tot preklinische validatie, en levert kwantitatieve antilichaamgegevens die worden gebruikt voor antigeenselectie, adjuvantoptimalisatie en dosisbereikstudies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van vaccinefficiëntie door de functionele antilichaeminhibitie van hemagglutinatie te meten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve titerresultaten uit seriële verdunningen, waardoor een betrouwbare evaluatie van verbindingen of vaccinekandidaten mogelijk is.
- Analytics: Genereert eindtiters en geometrische gemiddelden die een statistische vergelijking van immuunresponsen tussen experimentele groepen mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door de immunogeniciteit in diermodellen (bijv. muisserum) te beoordelen voorafgaand aan humane klinische studies.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd serologieplatform dat toepasbaar is op meerdere influenzastammen en vaccineformaten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid over vaccin-geïnduceerde immuniteit door neutraliserende antilichaamtiters te meten als correlaat van bescherming.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid van de assay door gestandaardiseerde antigeenpreparatie, RDE-behandeld serum en soortspecifieke incubatietijden voor erytrocyten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door onvoldoende immunogeniciteit vroegtijdig te identificeren, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van vaccinekandidaten mogelijk op basis van de breedte van de titers over verschillende stammen en de seroprotectiepercentages.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in virologie en serologie voor het hanteren van virale antigenen, het prepareren van RDE-behandeld serum en het interpreteren van hemagglutinatie-eindpunten.
- Afhankelijk van toegang tot BSL2-conforme faciliteiten voor de veilige omgang met influenzavirussen en menselijke/dierlijke bloedproducten.
- Maakt standaardisatie van erytrocytenbronnen noodzakelijk (bijv. cavia, kalkoen, mens bloedgroep O) om kruisreactiviteit te minimaliseren en soortspecifieke agglutinatie te waarborgen.
- Vereist nauwkeurige tijdcontrole tijdens de incubatie van erytrocyten om fout-negatieve of fout-positieve hemagglutinatiemetingen te voorkomen.
- Beperkt tot het meten van functionele antilichaamactiviteit; kwantificeert geen niet-neutraliserende of niet-functionele immunoglobulineklassen zonder aanvullende assays (bijv. ELISA).
