Name: Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer een fractioneringsprotocol om wasmiddel-onoplosbare eiwitaggregaten uit postmortem menselijk hersenweefsel te verrijken. Deze methode versnelt onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten en misfolded eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Drs. Jim Lah en Allan Levey, Emory afdeling Neurologie, voor nuttige opmerkingen en suggesties. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de versnelde geneeskunde partnerschap grant (U01AG046161-02), the Emory Alzheimer's Disease Research Center (P50AG025688) en een National Institute on Aging toekennen (R01AG053960-01) N.T.S. Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk gesteund door de Neuropathologie kern van de Emory Neuroscience NINDS Core faciliteiten subsidie, P30NS055077.

ethische verklaring: alle weefsels van de hersenen zijn verkregen van de Emory Alzheimer &#39; s Disease Research Center (ADRC) hersenen Bank. Postmortem menselijkeweefsels werden verworven onder juiste institutionele Review Board (IRB) protocollen.
 1. homogenisering en fractionering <ol><li>weefsel selectie Opmerking: bevroren postmortem frontale cortex weefsel van gezonde controle (Ctl) en pathologisch bevestigde AD gevallen werden geselecteerd uit de Emory ADRC hersenen bank (n = 2). Post mortem neuropathologische evaluatie van amyloïde plaque verdeling werd uitgevoerd volgens het Consortium om een register voor Alzheimer &#39; s ziekte semi-kwantitatieve criteria 24, scoren, hoewel neurofibrillary wirwar pathologie was beoordeeld overeenkomstig de Braak tijdelijke systeem. 16 <ol><li>verkrijgen bevroren postmortem hersenweefsel van gezonde controle (Ctl) en pathologisch bevestigde gevallen van het AD. Gebruik makend van containers van droogijs, pincet en een scheermesje, accijnzen ~ 250 mg gedeelten van grijze stof uit elk weefsel monster op getarreerde wegwerp wegen boten, verzorgen om te voorkomen dat het weefsel ontdooien. Het gewicht van elk stuk te worden gehomogeniseerd.</li>
		<li>Accijnzen ~ 250 mg van grijze stof via pincet en messcherp visueel inspecteren om te zoeken van de intermediair tussen de buitenste grijze stof en innerlijke witte stof. Vermijd witte stof en nog belangrijker, een grote bloedvaten of bloedige regio's, hersenvliezen of arachnoideavilli mater. Houden van het weefsel door te snel werken en regelmatig wegen boot met hersenweefsel in polystyreen containers met droge ice. tijdens het snijproces bevroren</li>
		<li>Record het exacte gewicht van grijze stof weggesneden uit elke bevroren stuk met behulp van een analytische balans. Berekenen van het volume voor zoutarm (LS) buffer (zie tabel 1) nodig voor de homogenisering van de dounce (5 mL/g of 20% w/v).</li>
		<li>Bereiden 10 mL LS-buffer met 1 x protease en phosphatase remmer cocktail en chill op ice.</li>
		<li>Verwijder gewogen weefsel en wegende boot van droogijs en dobbelstenen in ongeveer 2 x 2 mm stukken als het ontdooit. Overbrenging naar een vooraf gekoeld dounce homogenizer tube van 2 mL op ice.</li>
		<li>Voeg toe 5 mL/g (20% w/v) van de ijskoude zoutarm (LS) buffer met 1 X protease en phosphatase remmer cocktail.</li>
		<li>Homogenize het hersenweefsel op ijs met behulp van ongeveer 10 slagen van hoge klaring stamper A en 15 lijnen van lage klaring stamper B.</li>
		<li>Alle homogenaat overbrengen in een polypropyleen tube van 2 mL, met behulp van een glazen pipet van Pasteur. Label van de buis met &#8220; TH &#8221; (totale homogenaat), het weefsel kast nummer, en homogenaat volume. Aliquot 0.8 mL in een gelabelde 1,5 mL-buis. Eventuele overtollige homogenaat kunnen ook aliquoted en opgeslagen bij -80 ° C.</li>
		<li>Aan elke 0.8 mL aliquoot, toevoegen 100 µL van 5 M NaCl en 10% (m/v) sarkosyl aan concentraties van 0,5 M en 1% w/v, respectievelijk. Meng buizen goed door inversie en incubeer op ijs voor 15 min. Label buizen met &#34; TH-S &#34; (totale homogenaat-Sarkosyl) om aan te geven dat de homogenates in sarkosyl-buffer (tabel 1).</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten elke buis voor drie 5 s pulsen bij 30% amplitude op ijs (maximale intensiteit = 40%) met behulp van een microtip-sonde.</li> <li>bepalen de eiwit-concentratie van de homogenates met behulp van het bicinchoninic zuur (BCA) assay 25 methode. 
		Opmerking: De gemiddelde eiwitconcentratie van TH-S homogenates voorbereid op een 5 mL LS per gram weefsel is 15-20 mg/mL. De homogenates kan worden gefractioneerde onmiddellijk of opgeslagen bij-80 ° C tot gebruik.</li>
		<li>Verdund TH-S homogenates tot 10 mg/mL ijskoud sark buffer (tabel 1) met 1 x protease en phosphatase inhibitors.</li>
		<li>Transfer 5 mg proteïne (0,5 mL) van elke TH-S homogenaat in 500 µL polycarbonaat ultracentrifuge buizen en paar-evenwicht met sark-buffer. Buizen in een vooraf gekoeld rotor en de ultracentrifuge bij 180.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. overdracht de sarkosyl oplosbare supernatant (S1) 1,5 mL buizen laden en opslaan bij -80 ° C. 
		Opmerking: (Optionele wash) toevoegen 200 µL van sark-buffer naar de ultracentrifuge buizen waarin het wasmiddel onoplosbare breuken (P1) en het verjagen van de pellets (P1) vanaf de onderkant van de ultracentrifuge buizen met behulp van een pipet tip van 200 µL.</li>
		<li>Kort pulse-spin de omgekeerde buizen voor 2-3-s (&#8804; 2500 x g) op een microcentrifuge de pellets (P1) en de buffer overbrengen naar de 1,5 mL tubes hieronder. Resuspendeer de onoplosbare pellets (P1) in de sark-buffer door pipetteren omhoog en omlaag om ervoor te zorgen de pellet is verstoord.</li>
		<li>Paar-evenwicht en centrifuge op 180.000 x g voor een extra 30 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder de optionele wassen supernatant (S2) en Incubeer de sarkosyl onoplosbare pellets (P2) in 50-75 µL van ureum buffer (tabel 1) met 1 x plaatje (protease en phosphatase remmer cocktail) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur laten solubilize de pellet. 
		Opmerking: Warme ureum buffer tot kamertemperatuur alvorens gebruik te vermijden van SDS neerslag. Voor wasmiddel-gevoelige toepassingen, SDS uit ureum buffer weglaten en overwegen de onoplosbare pellet (P2) wassen in laag zout buffer vóór de resuspending in ureum buffer.</li>
		<li>Overboeken van de geresuspendeerde pellets (P2) 0,5 mL buizen en met korte (1 s) microtip ultrasoonapparaat bij 20% amplitude (maximale intensiteit = 40%) tot volledig solubilize van de pellets.</li>
		<li>Bepalen de concentraties van de eiwitten van de sarkosyl oplosbare (S1) en onoplosbare (P2) fracties met behulp van de BCA assay methode. Deze fracties onmiddellijk gebruik of Bewaar bij-80 ° C tot gebruik of.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>westelijke bevlekken Opmerking: westelijke bevlekken werd uitgevoerd volgens de procedures van de eerder gemelde met lichte wijzigingen. 5 , 10 <ol><li>bereiden 40 µg monsters van totale homogenates (TH-S), sark-oplosbare (S1) en sark onoplosbare (P2) breuken in 1 X Laemmli SDS-pagina monster buffer met pH 7 van de TCEP van de 5 mM. Incubeer monsters bij 95 ° C gedurende 5 min.</li>
		<li>Load monsters op een geprefabriceerd 10-well 4-12% Bis-Tris SDS-pagina gel. Electrophorese op 80 V voor de eerste centimeter (10 min) en 120 V voor de rest (60 min) of tot de tracking-kleurstof de onderkant van de gel bereikt.</li>
		<li>Kunt een verse scheermesje en gel mes split-open de voorgegoten gel-cassette. Zachtjes weg knippen de kammen en de onderkant van de gel met een frisse scheermesje.</li>
		<li>Resuspendeer de onoplosbare pellets (P1) in 200 µl sark-buffer met 1 x PIC door pipetteren op en neer.</li>
		<li>Overdracht naar een membraan van 0,2 µm nitrocellulose een Bevlekkende machine met behulp van een van de droge overdrachtmethode (Zie de tabel van de materialen).</li>
		<li>Blokkeren het membraan in de blokkeerbuffer (BB) zonder Tween 20 voor 30 min, volgde met BB met 0,05% Tween-20 (BB/T) voor 30 min. Spoel na het blokkeren, het membraan in TBS/T (0,1% Tween 20) voor 5 min voor het verwijderen van overtollige blokkeerbuffer.</li>
		<li>Voorbereiden 1:1,000 verdunningen van het pT231 van de primaire antilichamen, Tau-2 (pan tau), AT8 en EEA1 in BB/T (0,05% Tween 20).</li>
		<li>Broeden de membranen in primair antilichaam oplossing 's nachts bij 4 ° C met circulaire agitatie. Spoel het membraan in TBS/T voor 3 x 15 min.</li>
		<li>Sonde het membraan met een verdunning van de 1:20,000 van de fluorescently-label in de buurt van-IR secundair antilichaam in BB/T gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in duisternis op shaker. Spoel het membraan voor 3 x 10 min in TBS/T en 2 x 5 min in eetlepels</li>
		<li>Scannen het membraan met behulp van een infrarood imaging systeem bij de juiste excitatie golflengte (b.v. 700 nm (rode kanaal) voor infrarood kleurstof 680 geit anti-muis IgG (H + L) secundaire en 800 nm (groene kanaal) voor infrarood kleurstof 790 ezel anti-konijn IgG (H + L ) secundaire).</li>
		<li>De imaging software gebruiken om te kwantificeren signaal intensiteit en het uitvoeren van densitometrie metingen volgens de fabrikant &#39; s instructies, zorgen voor auto-achtergrond instellen is ingesteld op het gemiddelde van de gehele achtergrond.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991(1991).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyloid+Beta+Peptide%3A+A+Chemist%27s+Perspective.+Role+in+Alzheimer%27s+and+Fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li>
<li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li>
<li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer%27s+Disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li>
<li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJulien%2C+C+%22Amyloid+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22">Amyloid Proteins: Methods and Protocols</a>. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).</li>
<li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).</li>
<li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li>
<li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility%2C+including+A%CE%B2+but+not+tau%2C+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li>
<li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+%CE%B1-Synuclein+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+%CE%B1-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+%CE%B1-Synucleinopathy+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130(2006).</li>
<li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/29/1_Supplement/712.3">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1759558">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived%2C+Toxic%2C+High+Mass+Amyloid+%CE%B2-Protein+%28A%CE%B2%29+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li>
<li>Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+%28snRNPs%29+aggregate+in+Alzheimer%27s+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).</li>
<li>Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+change%2C+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li>
<li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer%27s+Disease+%28CERAD%29.+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer%27s+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li>
<li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subfraction+of+A%CE%B2+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin we introduceren en bespreken van een verkorte-voor-stapmodus wasmiddel-fractionering protocol dat is van toepassing op een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van proteomics massa spectrometrie gebaseerde analyse tot functionele eiwit misfolding testen en westelijke bevlekken. 5 , 6 , 7 , 10 deze methodologie is misschien wel de meeste effectieve wanneer gebruikt bij het...

Neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de nauw verwante prionziekten worden gekenmerkt door de geleidelijke accumulatie van proteinopathies wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten in de hersenen met bijbehorende cognitieve achteruitgang. 1 , 2 deze gedeelde pathologische functie wordt beschouwd als een centrale rol in de etiologie en pathofysiologie van deze neurodegeneratieve ziekten. 2 deze aggregaten bestaan meestal uit polymere amyloïde vezels, die zijn samengesteld uit herhalende eenheden van het misfolded eiwit tentoonstellen Kruis β-structuur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemically, amyloïde aggregaten zijn zeer resistent tegen chemische of thermische denaturatie- en solubilisatie,3 , waarin een unieke uitdagingen voor hun zuivering, analyse en studie via traditionele biochemische technieken. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 is niet verwonderlijk dat het wasmiddel onoplosbare eiwitoplossing is de focus van veel onderzoek naar de pathofysiologie van neurodegeneratieve ziekten waarbij de accumulatie van misfolded eiwitten. 6 , 12 , 13 , 14
Biochemische fractionering technieken hebben vaak gebruikt om te verrijken het wasmiddel onoplosbare breuk van postmortem hersenen homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 een van de meest voorkomende methoden omvat de sequentiële winning van weefsel homogenates met buffers en detergentia starheid, gevolgd door ultracentrifugatie te partitioneren van de oplosbare en onoplosbare breuken te verhogen. Een veelgebruikte sequentiële fractionering protocol6,14 houdt de homogenisering van de bevroren weefselmonsters in een wasmiddel-vrije zoutarm (LS)-buffer en de resulterende onoplosbare pellets zijn dan sequentieel geëxtraheerd met buffers met hoog zout, niet-ionogene detergenten, hoge sacharose, zoals Ionische detergentia en tenslotte chaotropes ureum. 6 , 14 een voor de hand liggende nadeel van dergelijke een sequentiële fractionering protocollen is het flink wat tijd en arbeid inzet nodig om ze te voltooien. Waaronder de homogenisering en ultracentrifugatie, een typische vijf stappen fractionering protocol kan duren uren of zelfs dagen in beslag. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 bovendien zoveel pathologische eiwit-aggregaten blijven onoplosbaar in alle, maar de zwaarste omstandigheden19,20 allermeest naar de gegenereerde breuken zijn van beperkte waarde. De minder strenge fractionering stappen met behulp van hoge concentraties van zout en niet-ionogene wasmiddelen zijn dus grotendeels overbodig.
Eerdere studies hebben aangetoond dat de Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) een uitstekende kandidaat is voor een vereenvoudigde-voor-stapmodus wasmiddel fractionering protocol is. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als een denatureren wasmiddel, sarkosyl is streng genoeg zijn om de overgrote meerderheid van native gevouwen eiwitten in de hersenen solubilize zonder solubilizing misfolded eiwit-aggregaten samengesteld uit bèta-amyloid (Aβ),6,11 gefosforyleerd tau (pTau),6 TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43),14 alpha-synuclein,12,13 scrapie,23 of U1 kleine nucleaire ribonucleoproteins (snRNP's U1) zoals U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Zoals sarkosyl is minder streng zijn dan de alomtegenwoordige anionogene detergentia natrium dodecyl sulfaat (SDS), behoudt het minder robuust oligomere vormen van misfolded eiwit-aggregaten die SDS behandeling niet kunnen weerstaan. 9
We beschreven eerder, een verkorte wasmiddel-fractionering protocol dat vergelijkbaar met de meer bewerkelijke sequentiële fractionering methodologieën resultaten. 5 door het weglaten van de minder strenge fractionering stappen, we konden een facile-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van postmortem menselijke hersenen ontwikkelen. 5 dit gedetailleerde protocol hierin beschreven is geschikt voor een brede waaier van experimentele toepassingen variërend van het westelijke bevlekken en massa spectrometrie gebaseerde proteomics functioneel eiwit misfolding en aggregatie zaaien testen. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>protease &amp; phosphatase inhibitor cocktail</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>microtip ultrasonicator</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>gekoelde ultracentrifuge</td></tr><tr><td>TLA120.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362224</td><td>ultracentrifuge rotor</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>ultracentrifuge buizen voor TLA120.1 rotor</td></tr><tr><td>4X SDS sample buffer</td><td>Zelfgemaakt</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP solution, neutral pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>reducerend middel</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>blocking buffer</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>blocking buffer en antilichaamverdunningsmiddel</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>gegoten SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE running buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>detergens</td></tr><tr><td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>antilichamen</td></tr><tr><td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>antilichamen</td></tr><tr><td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>antilichamen</td></tr><tr><td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>antilichamen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>antilichamen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>antilichamen</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Gel transfer</td></tr></tbody></table>

verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In deze studie beschrijven we een afgekorte-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen. De Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) lost effectief native gevouwen eiwitten in hersenweefsel waardoor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten uit een breed scala van neurodegeneratieve proteinopathies, zoals De ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson en Amyotrofische laterale sclerose en prionziekten. Menselijke controle en AD postmortem hersenen weefsels waren gehomogeniseerde en gesedimenteerd door ultracentrifugatie in aanwezigheid van sarkosyl te verrijken wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten met inbegrip van pathologische gefosforyleerd tau, de belangrijkste component van neurofibrillary klitten in AD. Westelijke bevlekken aangetoond de differentiële oplosbaarheid van geaggregeerde phosphorylated-tau en het wasmiddel-oplosbaar eiwit, vroege Endosome antigeen 1 (EEA1) in controle en AD hersenen. Proteoom analyse bleek ook verrijking van β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K), en apolipoproteïne E (beleidsverklaring) in de sarkosyl onoplosbare breuken van AD hersenen vergeleken met die van de controle, consistent met de vorige weefsel fractionering strategieën . Dit eenvoudige verrijking protocol is dus ideaal voor een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van westelijke bevlekken en functionele eiwit co aggregatie testen tot massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

De verkorte-voor-stapmodus sarkosyl-fractionering-protocol is gebruikt voor het verrijken van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van controle en AD postmortem hersenen (Figuur 1). Eiwitten uit TH-S, S1, S2 en P2 breuken werden opgelost door SDS-PAGE, vaste gedurende 15 min. in Coomassie blue kleefpoeders buffer gevolgd door zachte vlekken met Coomassie briljant blauw G-250 kleuring buffer. De resuspensie stap is optioneel, omdat er niet detecteerbaar nive...

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Het algemene doel van dit fractioneringsprotocol is het verrijken van detergent-onoplosbare proteïneaggregaten uit postmortem menselijk hersenweefsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van neurodegeneratie, zoals de identificatie en karakterisering van misvouwen proteïneaggregaten bij ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de snelle verrijking en isolatie van detergent-onoplosbare proteïneaggregaten uit hersenweefsel binnen een kort tijdsbestek.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Tram Nguyen, een technicus uit mijn laboratorium. Verkrijg bevroren postmortaal hersenweefsel van gezonde controles en pathologisch bevestigde AD. Gebruik een pincet en een scheermesje om porties van ongeveer 250 milligram grijze stof uit elk weefselmonster uit te snijden. Laat het hersensegment één minuut ontdooien.Snijd nu, terwijl het weefsel ontdooit, een stuk weefsel in blokjes van ongeveer twee millimeter kubiek. Breng dit over naar een vooraf gekoelde Dounce-homogeniseerbuis van twee milliliter op ijs. Denk eraan om witte stof en grote bloedvaten te vermijden.Werk snel en plaats het weefsel in wegwerpplaatsjes voor weging (TARE). Voorkom dat het weefsel ontdooit door het weegbakje met hersenweefsel regelmatig in polystyreencontainers met droogijs te plaatsen. Verwijder, nadat alle benodigde stukjes weefsel zijn gedisseceerd en gewogen, een weegbakje met een stukje weefsel uit het droogijs.Voeg vervolgens vijf milliliter ijskoude buffer met een laag zoutgehalte, voorzien van een protease- en fosfataseremmercocktail, toe per gram weefsel, en homogeniseer op ijs met ongeveer 10 slagen van stamper A met grote speling en 15 slagen van stamper B met kleine speling. Gebruik daarna een glazen Pasteurpipet van negen inch om elk homogenaat over te brengen naar een gelabelde polypropylene buis van twee milliliter. Verdeel het resterende homogenaat op een vergelijkbare wijze in extra gelabelde buisjes van 1,5 milliliter voor bewaring bij minus 80 graden Celsius. Om verder te gaan met fractionering, voegt u 100 microliter vijf molar natriumchloride en 100 microliter 10 procent sarkosyl toe aan elk aliquoot van 0,8 milliliter.Meng goed door te inverteren. Incubeer het mengsel vervolgens 15 minuten op ijs. Gebruik na de incubatie een sonicator die is uitgerust met een microtip-sondeprobe om drie pulsen van vijf seconden toe te dienen bij een amplitude van 30%.Nadat de eiwitconcentraties van de homogenaten zijn bepaald met de bicinchonininezuurmethode, wordt ijskoud Sark-buffer met protease- en fosfataseremmers aan elk monster toegevoegd tot een eindconcentratie van 10 mg/mL. Draag vervolgens 500 µL van elk monster over naar polycarbonaat ultracentrifugebuisjes van 500 µL. Plaats de buisjes in een vooraf gekoelde rotor en ultracentrifugeer gedurende 30 minuten bij 180.000 ×g bij 4 °C.Breng na de centrifugatie de S1 sarkosyl-oplosbare supernatanten over naar 1,5-milliliter buisjes en bewaar deze bij minus 80 graden Celsius. Voeg 200 microliters sark-buffer toe aan de ultracentrifugebuizen die de detergent-onoplosbare P1-fracties bevatten en gebruik de pipetpunt om de pellets van de bodem van de ultracentrifugebuizen los te maken. Breng vervolgens de resuspenderde P1-pellets over naar nieuwe 500-microliter ultracentrifugebuizen, balanceer deze in paren en centrifugeer gedurende nog eens 30 minuten bij 180.000 times g bij vier graden Celsius.Verwijder het S2-supernatant. Voeg vervolgens 50 tot 75 µL ureabuffer met protease- en fosfataseremmercocktail toe aan de sarkosyl-onoplosbare pellets en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de P2-pellet op te lossen. Breng na de incubatie de geresuspendeerde P2-pellets over naar gelabelde 0,5-ml buisjes en lossen de pellets volledig op middels een korte sonicatie van één seconde met een microtip bij 20 procent amplitude.Bepaal de eiwitconcentraties van de sarkosyl-oplosbare en sarkosyl-onoplosbare fracties met de BCA-assaymethode. Bereid monsters van 40 µg van het totale homogenaat, de sark-oplosbare S1- en de sark-onoplosbare P2-fracties in één-x Laemmli SDS-PAGE monsterbuffer met 5 mM TCEP bij pH 7. Incubeer de monsters 5 minuten bij 95 °C.Laad de monsters op precast 10-well 4 tot 12 procent Bis-Tris SDS-PAGE gels. Voer de elektroforese uit bij 80 volt voor de eerste centimeter en 120 volt gedurende ongeveer een uur of totdat de tracking-kleurstof de onderkant van de gel bereikt. Dompel de precast gelcassettes onder in gedestilleerd water en gebruik vervolgens een nieuw scheermesje en gelmes om ze open te snijden.Snijd voorzichtig de kammen en de onderzijde van elke gel weg met een nieuw scheermesje. Breng deze over op 0,2 micron nitrocellulosemembranen met behulp van een droge transfermethode op een blotting-apparaat. Blok na de transfer de membranen gedurende 30 minuten in blokkeringsbuffer zonder Tween-20, gevolgd door 30 minuten in blokkeringsbuffer met 0,5 procent Tween-20.Spoel de membranen na het blokkeren vijf minuten lang met TBS met 0,1 procent Tween-20 om overtollige blokkeringsbuffer te verwijderen. Bereid 1:1.000 verdunningen van de primaire antilichamen voor in blokkeringsbuffer met 0,5 procent Tween-20. Hier worden Phospho-Tau pT231 en EEA1 gebruikt.Incubeer de membranen overnacht bij vier graden Celsius in de primaire antilichaamoplossing onder cirkelvormige agitatie. Spoel de membranen de volgende dag drie keer gedurende 15 minuten in TBS met 0,1 percent Tween-20. Incubeer de membranen vervolgens gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker op een shaker met een 1:20 000 verdunning van het fluorescent gelabelde nabij-infrarode secundaire antilichaam en blokkeringsbuffer met 0,5 percent Tween-20.Spoel het membraan na de incubatie drie keer gedurende 10 minuten met TBS met 0,1 procent Tween-20 en tweemaal gedurende vijf minuten met TBS. Scan het membraan met een infrarood beeldvormingssysteem bij de juiste excitatiegolflengte voor het gebruikte secundaire antilichaam. Deze met Coomassie gekleurde gel toont 20 mcg eiwit uit de TH-S-, S1-, S2- en P2-fracties.Western blot-analyse laat duidelijk zien dat in het AD-brein de pathologische gefosforyleerde Tau met een hoog molecuulgewicht aggregeert met sarkosyl-onoplosbare fracties, terwijl er zeer weinig fosfo-Tau overbleef in de sarkosyl-oplosbare fracties. EEA1 werd gebruikt als algemene marker voor de meeste native niet-pathologische eiwitten die inherent sarkosyl-oplosbaar zijn en in zowel het controlebrein als het AD-brein in de S1-fractie terechtkwamen. Opvallend is dat er iets minder signaal voor EEA1 was in de oplosbare fractie vergeleken met de TH-S fractie, wat erop wijst dat een kleine pool van EEA1 waarschijnlijk sarkosyl-onoplosbaar is, maar onder de detectielimiet van de western blot met dit specifieke antilichaam ligt.Deze figuur toont de proteomische analyse van pathologische AD-eiwitten met behulp van een protocol voor fractionering in één of meerdere stappen. De fractioneringstechniek in één stap kan voordelig zijn voor eiwitten met een lage abundantie, aangezien de totale monsterverliezen aanzienlijk worden verminderd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zoveel mogelijk witte stof uit het hersenweefsel te verwijderen.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals proteomics op basis van massaspectrometrie, worden uitgevoerd om de belangrijkste eiwitcomponenten van pathologische aggregaten bij degeneratieve ziekten te identificeren en te karakteriseren.

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking voor de studie van de epigenetische markeringen in chromatine, omdat de meeste assays gebrek aan enkele cel resolutie. Neuronen meestal vermengd met glia en andere niet-neuronale cellen. Wij bieden een protocol te halen en neuronale kernen verzamelen van menselijke hersenen.

Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, eiwit scheiding door SDS-PAGE, antigen retrieval en immunoblotting met een antilichaam tegen het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, wij consequent te sporen monomere en multimere Aß in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

Een nieuwe soort cellulaire prion eiwit...

Isolatie van oplosbare en onoplosbare oligomeren in het PrP Normal Human Brain

This video demonstrates the protocol for isolating  amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

This video explains the process of isolating and enriching detergent-insoluble protein aggregates from frozen postmortem human brain tissue. It demonstrates key steps, including homogenization, detergent treatment, sonication, and ultracentrifugation to separate and purify the insoluble aggregates. The final step involves solubilizing the aggregates in urea buffer for further analysis.

Isolation of Detergent-Insoluble Protein Aggregates From Human Postmortem Brain Tissue

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van steeds onoplosbaarder/geaggregeerd alfa-synucleïne (α-syn) uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Door het gebruik van buffers met toenemende detergentsterkte en hoogsnelheids ultracentrifugeringstechnieken, kunnen de variabele eigenschappen van α-syn-aggregatie in zieke en niet-zieke weefsel worden onderzocht.

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Deze biochemische zuiveringsmethode met op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse vergemakkelijkt de robuuste karakterisering van amyloïde fibrilkernen, wat de identificatie van doelen voor het voorkomen van de ziekte van Alzheimer kan versnellen.

Biochemische zuivering en proteomische karakterisering van amyloïde fibrilkernen uit de hersenen

Deze studie beschrijft experimentele methoden om GFAP en de ziekteverwekkende mutaties biochemisch te karakteriseren, met de nadruk op filamentassemblage, aggregatie en posttranslationele modificatie. Hoogzuivere GFAP-eiwitten werden geanalyseerd, wat inzicht gaf in de mechanismen van de ziekte van Alexander die een kader kunnen bieden voor het bestuderen van potentiële therapeutische doelwitten en het begrijpen van GFAP-mutaties en gerelateerde aandoeningen.

Experimentele benaderingen voor biochemische analyse van gliale fibrillaire zure eiwitten en de ziekte-geassocieerde varianten

Leer een fractioneringsprotocol om wasmiddel-onoplosbare eiwitaggregaten uit postmortem menselijk hersenweefsel te verrijken. Deze methode versnelt onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten en misfolded eiwitten.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Meer video's verkennen