Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae
3 juni 2017
We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.
Het algemene doel van deze procedure is om genoom-brede kaarten van eiwit-DNA-interacties in situ te genereren met hoge resolutie en lage achtergrond, zonder de noodzaak voor formaldehyde crosslinking, chromatine solubilisatie of antilichamen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het transcriptieveld, zoals waar verschillende regulerende factoren zich associëren met chromatine, relatief tot gen-regulerende regio's. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze hoog-resolutie genomische bindingskaarten biedt met verwaarloosbare achtergrond, en de beperkingen vermijdt die geassocieerd zijn met standaard ChEC-seq protocollen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Sebastian Grunberg, mijn collega van het Fred Hutchinson Cancer Research Center. Op de middag of avond van de dag vóór het experiment, start een pre-cultuur van de experimentele gebruiksstam. Inoculateer drie milliliter gebruikte peptonedextrose of een geschikt selectief medium met een enkele kolonie van de stam, dragende het MNase getaggede factor.
Incubeer deze cultuur een nacht in een schuddende incubator op 30 graden Celsius. Op de volgende ochtend, verdun de overnachtcultuur in 50 milliliter medium tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,2 tot 0,3. Incubeer de cultuur in de schuddende incubator totdat deze een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5 tot 0,7 bereikt.
Bereid de benodigde hoeveelheid Buffer A plus additieven voor, en houd deze op kamertemperatuur tijdens de procedure. Bereid microfugebuizen voor voor monsterverzameling. Voor elke nieuwe geanalyseerde factor, verzamel monsters zonder calciumtoevoeging, en voeg toe 30 seconden, een minuut, 2,5 minuten, 5 minuten en 10 minuten na calciumtoevoeging.
Voeg aan elke buis 90 microliter stopoplossing toe, en 10 microliter 10%SDS. Wanneer de cultuur een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5 tot 0,7 heeft bereikt, decanteer de cultuur in een 50 milliliter kegelbuis, en centrifugeer bij 1.500 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, suspendeer de cellen grondig in één milliliter Buffer A, en breng de gesuspendeerde cellen over naar een microfugebuis.
Pellet de gesuspendeerde cellen in een microfuge bij 1.500 keer g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant, en suspendeer de cellen grondig in één milliliter Buffer A door op en neer te pipetteren. Pellet de gesuspendeerde cellen bij 1.500 keer g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur.
Verwijder het supernatant, suspendeer de cellen in één milliliter Buffer A, en centrifugeer opnieuw. Na het verwijderen van het supernatant, suspendeer de cellen grondig in 570 microliter Buffer A.Voeg 30 microliter 2%digitonine toe om permeabilisatie van de cellen te vergemakkelijken, en draai om om te mengen. Permeabiliseer de cellen in een warmteblok op 30 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Pipetteer de reactie op en neer om een gelijkmatige verdeling van cellen te verzekeren. Als negatieve controle, breng 100 microliter aliquot van gepermeabiliseerde cellen over naar een microfugebuis met stopoplossing en SDS, en vortex kort om te mengen. Voordat met de tijdscursus wordt begonnen, is het belangrijk om de buizen met stopoplossing, de pipetten, pipettenpunten en een timer naast de warmteblokken te hebben, zodat de vroege tijdspunten efficiënt kunnen worden verzameld.
Om de tijdscursus te starten, voeg 1,1 microliter een-molar calciumchloride toe aan de gepermeabiliseerde cellen om MNase te activeren, en draai verschillende keren snel om te mengen. Breng de gemengde reactie onmiddellijk terug naar 30 graden Celsius en start een timer. Bij elk te verzamelen tijdstip, pipetteer de reactie op en neer om een gelijkmatige verdeling van cellen te verzekeren, en verwijder vervolgens een 100 microliter aliquot van gepermeabiliseerde cellen naar een microfugebuis met stopoplossing en SDS.
Vortex kort om te mengen. Zodra alle tijdstippen zijn verzameld, voeg vier microliter 20 milligram per milliliter proteïnase K toe aan elk monster. Vortex kort om te mengen, en incubeer bij 55 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Voeg 200 microliter fenol:chloroform:isoamyl alcohol toe aan elk monster, vortex krachtig om te mengen, en centrifugeer bij maximale snelheid gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de waterige fase naar een nieuwe buis. Voeg 30 microgram glycogeen toe, en 500 milliliter 100%ethanol.
Vortex krachtig om te mengen, en precipiteer op droogijs gedurende 10 minuten, of tot de oplossing stroperig is. Pellet de geprecipiteerde DNA door centrifugatie bij maximale snelheid, en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Decanteer het supernatant en was elk pellet met één milliliter kamertemperatuur 70%ethanol.
Decanteer het ethanol en verwijder de resterende hoeveelheid door om te draaien, en voorzichtig te tikken op de buizen op een papieren handdoek. Draai de monsters kortjes in een tafelcentrifuge, en gebruik vervolgens een pipette om resterend ethanol te verwijderen, zorgvuldig om het pellet niet te verstoren. Droog de pellets aan de lucht bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Terwijl de DNA-pellets aan het drogen zijn, maak een mastermix van Tris buffer en RNase A voor het resuspenderen van de pellets eenmaal ze gedroogd zijn, en vortex om te mengen. Voeg 30 microliter van de RNase A-oplossing toe aan elk gedroogd DNA-pellet, vortex om te mengen, en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten om RNA te verteren. Na 20 minuten meng één microliter 6X DNA ladingsdye met vijf microliter van elk monster, en draai op een 1,5% agarose gel bij 120 volt gedurende 40 minuten.
Begin de grootteselectieprocedure door aan elk monster 75 microliter SPRI-kralen toe te voegen in een polyethyleenglycoplossing. Pipetteer 10 keer op en neer om de kralen en DNA-mengsel te mengen, en incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Tijdens de incubatie van de SPRI-kralen, bereid microfugebuizen voor met 96 microliter 10 millimolair Tris pH 8,0, en vier microliter vijf
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft chromatin endogenous cleavage gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een methode voor het in kaart brengen van eiwitbindingsplaatsen over het gehele genoom. De techniek maakt gebruik van micrococcale nuclease (MNase) fusie-eiwitten om resolutierijke kaarten van eiwit-DNA-interacties te genereren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Chromatinebiologie
- Genomics
- Transcriptieregulatie
Achtergrond
- ChEC-seq is een orthogonale methode ten opzichte van chromatine-immunoprecipitatie (ChIP).
- Het vermijdt het gebruik van formaldehyde-crosslinking en de solubilisatie van chromatine.
- De methode levert genomische bindingskaarten met een hoge resolutie en een lage achtergrondruis.
- Het pakt beperkingen aan die worden aangetroffen in standaard ChEC-seq-protocollen.
Doel van de studie
- Om genome-brede kaarten van eiwit-DNA-interacties in situ te genereren.
- Om de associatie van regulatoire factoren met chromatine te onderzoeken.
- Om het begrip van genregulerende regio's te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Pre-cultuur van experimentele stammen met MNase-getagde factoren.
- Gebruik van micrococcaal nuclease voor chromatine-splitsing.
- High-throughput sequencing voor het in kaart brengen van interacties.
- Analyse van genomische bindingsplaatsen.
Belangrijkste resultaten
- Kaarten met een hoge resolutie van eiwit-DNA-interacties zijn succesvol gegenereerd.
- De methode vertoonde een verwaarloosbare achtergrond in de bindingskaarten.
- Belangrijke regulatoire factoren zijn in kaart gebracht ten opzichte van genregulerende regio's.
- De procedure is gevalideerd door Sebastian Grunberg van het Fred Hutchinson Cancer Research Center.
Conclusies
- ChEC-seq biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van eiwit-DNA-interacties.
- De hoge resolutie en de lage achtergrondruis van deze techniek maken deze voordelig voor transcriptiestudies.
- Toekomstige toepassingen kunnen de dynamiek van chromatineregulatie verder verduidelijken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
ChEC-seq maakt high-resolution mapping van eiwit-DNA-interacties mogelijk zonder crosslinking, sonicatie of afhankelijkheid van antilichamen, waarmee belangrijke beperkingen van ChIP-seq in workflows voor targetvalidatie worden aangepakt. Deze orthogonale benadering ondersteunt mechanische de-risking door onafhankelijke bevestiging te bieden van bindingsplaatsen van transcriptiefactoren en patronen van chromatinebezetting. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve genomische bindingsgegevens met een lage achtergrond te leveren voor pathway-verduidelijking en hypothesetesten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om bindingsplaatsen van transcriptionele regulatoren te onderzoeken ten opzichte van genregulerende regio's voor de validatie van doelhypothesen.
- Operationele waarde: Biedt antilichaam-onafhankelijke mapping, waardoor variabiliteit door reagenskwaliteit en batch-effecten wordt geëlimineerd.
- Strategische waarde: Ondersteunt orthogonale validatie van ChIP-seq-bevindingen om fout-positieven bij de selectie van doelen te verminderen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert hoge-resolutie, kwantitatieve fragment-uiteinde kaarten die een nauwkeurige definitie van de grenzen van eiwit-DNA-interacties mogelijk maken.
- Operationele waarde: Levert een signaal met een lage achtergrond, wat de sensitiviteit en reproduceerbaarheid van de assay over tijdskuren en replica's verbetert.
- Strategische waarde: Faciliteert schaalbare, gemultiplexte verzameling van tijdspunten voor kinetische profilering van chromatinebinding.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Brengt megadalton-complexen die niet aan DNA binden (bijv. Mediator) in kaart op chromatine, wat mechanistisch inzicht biedt in de functie van steunproteïnen in ziekterelevante systemen.
- Operationele waarde: Werkt in situ met levende gistcellen, waardoor natuurlijke chromatinetoestanden behouden blijven en artefacten door fixatie of extractie worden voorkomen.
- Strategische waarde: Biedt een genetisch codeerbaar platform voor het labelen van endogene proteïnen, wat schaalbare risicoreductie van targets in stammenbibliotheken ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
ChEC-seq past binnen de fase van discovery biology en ondersteunt hypothesetesten en pathway-verduidelijking voorafgaand aan assayontwikkeling en screeningscascades.
- Discovery-biologie: Maakt directe toetsing mogelijk van waar regulerende factoren zich binden aan chromatine, waardoor mechanistische modellen van genregulatie worden verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve klievingsprofielen op die geschikt zijn voor het vergelijken van wild-type, mutante of conditiespecifieke bindingsdynamiek.
- Analyses: Levert tellingen van fragmentuiteinden en motiefgecentreerde piekgegevens op die een statistische vergelijking van bindingssterkte en lokalisatie faciliteren.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van gistmodellen naar hogere eukaryoten door geconserveerde bindingsprincipes van transcriptionele regulatoren te definiëren.
- Hergebruik in de praktijk: Vestigt een herbruikbaar platform voor genomische mapping dat toepasbaar is op elk MNase-fusieabel chromatine-geassocieerd eiwit in genetisch hanteerbare systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target-validatie door middel van bindingskaarten met een hoge resolutie en een lage achtergrond.
- Operationele waarde: Standaardisatie via calcium-getriggerde, tijdopgeloste splitsing en een gestandaardiseerde workflow voor DNA-terugwinning.
- Strategische waarde: Verminderd biologisch risico bij de selectie van targets door orthogonale bevestiging van ChIP-seq-gegevens en de ontdekking van nieuwe bindingsgebeurtenissen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde chromatinebezetting en functionele relevantie.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de moleculaire biologie van gisten, protein tagging en calcium-afhankelijke nuclease-assays.
- Afhankelijk van induceerbare MNase-fusie-expressie en optimalisatie van de permeabilisatie (bijv. digitonine-titratie).
- Vereist gestandaardiseerde monstername in een tijdreeks en gesynchroniseerde calciumtoevoeging voor reproduceerbare kinetiek.
- Aanpassing aan zoogdiersystemen kan overwegingen met betrekking tot nucleaire afgifte en chromatine-toegankelijkheid vereisen.
- Praktische beperking: de doorvoer wordt beperkt door handmatige monsterverwerking en de frequentie van de tijdspuntcollectie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
- Wetenschappelijke waarde: Aantallen fragmentuiteinden bieden een kwantitatieve weergave van de splitsingsfrequentie per genomisch basepaar.
- Operationele waarde: Maakt normalisatie en vergelijking tussen tijdspunten, stammen of experimentele condities mogelijk.
- Strategische waarde: Ondersteunt statistische drempelwaardebepaling voor peak calling en differentiële bindingsanalyse.
