Neuro evaluaties in een muismodel van neonatale hypoxische ischemische hersenletsel
24 november 2017
Wij unilaterale halsslagader occlusie uitgevoerd op postnatale dag 7-10 CD-1 pups om een neonatale hypoxische ischemische (HI) model te maken van de muis en onderzocht de effecten van HI hersenletsel. We studeerde neuro functies in deze muizen in vergelijking met normale muizen niet bediende.
Het algemene doel van de chirurgie voor hypoxisch-ischemische neonatale hersenbeschadiging, gevolgd door cognitieve en motorische testen, is het creëren van een muismodel om dergelijke letsels en de daarmee samenhangende hersenschade te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over neonatale hypoxisch-ischemische hersenbeschadiging, zoals de manier waarop dergelijke letsels de motorische en cognitieve functies beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze bekend is en algemeen wordt toegepast.
Het is ook een preklinisch model voor cerebrale parese en neonatale beroertes. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat de rechter arteria carotis unilateraal moeilijk te identificeren is. De procedure zal worden gedemonstreerd door mijzelf en Yoon-Kyum Shin, een promovendus uit ons laboratorium.
Nadat ten minste vijf P7-muizenpups zijn geanestheseerd, plaatst u een pup met de buik omhoog onder een dissectiemicroscoop. Reinig vervolgens de nek met alcohol. Om de operatie te beginnen, maakt u met een schaar een incisie van 0,7 mm in de nek.
Verwijder vervolgens voorzichtig het vetweefsel met een pincet totdat de rechter arteria carotis unilateraal is blootgelegd. Ligeer daarna de rechter arteria carotis unilateraal met een 5-0 hechtdraad. Hecht nu de incisie in de nek met 5-0 nylon en steriliseer de incisie.
Laat de pup vervolgens ongeveer een uur herstellen in een hypoxische kamer van 37 °C met het deksel open. Plaats een andere chirurgisch gemanipuleerde muis in de hypoxische kamer om te herstellen. Zodra de pups allemaal volledig wakker zijn, sluit u het deksel van de kamer en verlaagt u de gasniveaus om hypoxische omstandigheden te creëren.
Plaats de pups met hersenletsel na 90 minuten hypoxie terug in hun kooien. Bereid de pups een week later, zoals voorheen, voor op de operatie om te zoeken naar bewijzen van de beschadiging. Maak een incisie in de hoofdhuid om de hersenlaesie in het posterolaterale gebied van de rechterhemisfeer te identificeren.
Kijk door de semi-transparante schedel naar bewijzen van een corticale beschadiging en een hippocampale beschadiging. Categoriseer de pups op basis hiervan als beschadigd of als niet-beschadigde controles. Sluit na controle de hoofdhuid met hechtingen en steriliseer de incisie.
Wanneer de muizen zes weken oud zijn, wordt hun geheugen geëvalueerd op basis van het leren en het vermijden van een aversieve stimulus. Gebruik voor deze taak een commercieel twee-compartimenten step-through passief vermijdingsapparaat. Plaats ter beginbehandeling een muis gedurende 30 seconden in het lichte compartiment van de box.
Open vervolgens de deur tussen de compartimenten en noteer de latentietijd van het dier om het donkere compartiment te betreden. Geef maximaal 300 seconden de tijd om de taak uit te voeren. Sluit de deur zodra alle vier de ledematen van de muis zich volledig in het donkere compartiment bevinden.
Dien vervolgens een elektrische voetshock van 1/2 milliamp toe gedurende twee seconden en plaats de muis terug in de kooi. Herhaal de test 24 uur later. Geef de muis ditmaal de volledige 300 seconden om naar de donkere kamer te bewegen, en geef de muis geen shock.
Voer de ladderlooptest uit bij de zes weken oude muizen om subtiele verstoringen van de motorische functie te onderscheiden, met behulp van zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses. Stel eerst de ladderapparatuur op en plaats vervolgens een videocamera om de bewegingen van de ledematen van een muis op de apparatuur vast te leggen. Plaats daarna een muis op het startpaneel en begin de opname met de videocamera.
Zorg ervoor dat de poten in de video scherp in beeld zijn. Wanneer de muis het laatste paneel van het ladderapparaat aanraakt, stopt u de opname. Verplaats de muis vervolgens terug naar het startpaneel en neem op hoe de muis het apparaat opnieuw oversteekt.
Voer dit in totaal vier keer per muis uit op elke testdatum. Tel later, bij het analyseren van de video, handmatig het aantal slippen per ledemaat terwijl de video met een snelheid van 1/10 wordt afgespeeld. Wanneer een ledemaat tussen de staven door glijdt, wordt dit beschouwd als een slip.
Wanneer de muizen zes weken oud zijn, wordt hun grijpkracht beoordeeld. Gebruik hiervoor een rekstrook voor trek/duwkracht, bevestigd aan een driehoekige draad met een diameter van twee millimeter, die geheel op een paneel is gefixeerd. Plaats de muis op het paneel terwijl u deze bij de staart vasthoudt.
Laat de muis vervolgens met de voorpoten het metaaldraad net aanraken. Zodra de muizen het draad vastgrijpen, trekt u voorzichtig aan de staart totdat ze de grip loslaten. Het apparaat registreert de piekkracht op het draad in gram.
Herhaal deze test vijf keer voordat de muis een rustperiode krijgt. Tijdens de gripkrachttest zijn er merkbare bewegingen van nauwkeurige prestaties. Probeer deze bewegingen over vijf pogingen vast te stellen voordat de muis ten minste één minuut rust krijgt om spiervermoeidheid te verminderen.
Nadat de muis ten minste één minuut heeft gerust, wordt de serie van vijf pogingen herhaald. Geef de muis vervolgens opnieuw rust en voer de serie voor de laatste maal uit voor die testdag. Gebruik voor de analyse het gemiddelde van de drie hoogste scores voor ofwel één voorpoot of voor beide voorpoten uit de verzamelde gegevens.
Na het oogsten van de hersenen van dieren met hypoxia-ischemie-letsel van 14 weken oud, werden de hersenen morfologisch geëvalueerd op de aanwezigheid van geen corticaal letsel, een mild letsel of een ernstig letsel. Dezelfde dieren waren een week eerder gescand met een MRI, wat ook zeer onthullend was. Zelfs de morfologisch normale hersenen vertoonden mild letsel in de hippocampus.
Op zes weken leeftijd, vijf weken na het letsel, werden de muizen beoordeeld met diverse gedragstaken. Muizen met hypoxia-ischemie-letsel vertoonden cognitieve beperkingen bij de passieve vermijdingstaak van 24 uur. Omdat alleen de rechterhersenhelft was beschadigd, vertoonden de muizen hemiplegische motorische functies.
Dit bleek uit het verschil in het percentage uitglijdingen op de dwarssporten van de ladder voor elke voorpoot. Bovendien, aangezien gripkracht de motorische cortex in de hersenen betrekt, vertoonden de normale groep en de groep met corticale letsels verschillen in grijpkracht. Er werd geen verschil waargenomen tussen de normale controles en de categorisch ongeschonden muizen, maar de muizen met letsel waren duidelijk beperkt in hun vermogen.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de rechter arteria carotis unilateraal moet ligeren om neonatale hypoxisch-ischemische muizen te genereren en hoe u de daaropvolgende gedragsanalyse moet uitvoeren. Het is belangrijk op te merken dat zelfs wanneer er zeven dagen na het letsel geen zichtbare schade aan de cerebrale cortex te zien is, een MRI een letsel aan de hippocampus kan onthullen. Daarnaast is het belangrijk om te onthouden dat de pups voorzichtig behandeld moeten worden en dat de operatie zo snel mogelijk moet worden voltooid.
Welpjes hebben een zeer zwakke en dunne huid, wees daarom zeer voorzichtig.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de effecten van neonataal hypoxisch-ischemisch (HI) hersenletsel in een muismodel. Om het HI-model te creëren, werd een unilaterale occlusie van de arteria carotis uitgevoerd bij CD-1 muispups op postnatale dag 7-10, waardoor de neurobehaviorale functies konden worden beoordeeld.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neonatale hersenbeschadiging
- Beoordeling van motorische en cognitieve functies
Achtergrond
- Neonatale hypoxisch-ischemische hersenbeschadiging is een aanzienlijk probleem binnen de pediatrische gezondheidszorg.
- Dit model helpt bij het begrijpen van de impact van dergelijke letsels op de hersenontwikkeling.
- Het dient als preklinisch model voor aandoeningen zoals cerebrale parese en neonatale beroertes.
- Het identificeren van de juiste halsslagader kan uitdagend zijn voor mensen die nog niet bekend zijn met de techniek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar muismodel te vestigen voor het bestuderen van neonatale HI-hersenbeschadiging.
- Om de effecten van HI op de motorische en cognitieve functies bij muizen te evalueren.
- Om inzicht te verschaffen in potentiële therapeutische benaderingen voor neonatale hersenbeschadigingen.
Gebruikte methoden
- Unilaterale occlusie van de arteria carotis bij muizenpups.
- Beoordeling van neurobehaviorale functies na de operatie.
- Vergelijking van geopereerde muizen met niet-geopereerde controlegroepen.
- Samenwerking met promovendi voor de demonstratie van de procedure.
Belangrijkste resultaten
- Vestiging van een neonataal HI-model in CD-1 muizen.
- Identificatie van significante verschillen in neurobehaviorale functies.
- Inzichten in de effecten van HI op de motorische en cognitieve ontwikkeling.
- Validatie van het model voor toekomstig onderzoek naar neonatale hersenletsels.
Conclusies
- De unilaterale occlusie van de halsslagader is een effectieve methode voor het modelleren van neonatale HI.
- Dit model kan verder onderzoek naar therapeutische strategieën faciliteren.
- Het begrijpen van de neurobehaviorale uitkomsten is cruciaal voor het aanpakken van neonatale hersenbeschadigingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit neonatale hypoxisch-ischemische muismodel biedt een preklinisch systeem voor het evalueren van motorische en cognitieve tekorten die relevant zijn voor cerebrale parese en neonatale beroertes. Gedragsbeoordelingen maken mechanistische risicoreductie van therapeutische kandidaten mogelijk door letsel in de rechterhemisfeer te koppelen aan functionele uitkomsten. Het model ondersteunt targetvalidatie en assayontwikkeling in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot hemiplegische motorische dysfunctie en cognitieve stoornissen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterellevant systeem voor functionele targetvalidatie in pathways van neonatale hersenbeschadiging.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het voorspellend vertrouwen door de ernst van de corticale beschadiging te correleren met de resultaten van motorische en cognitieve tests.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde neurobehaviorale resultaten (latentietijd bij passieve vermijding, aantal ladderuitslippers, gripkracht) voor het screenen van verbindingen.
- Kwantitatieve meting: Levert reproduceerbare, kwantificeerbare eindpunten die geschikt zijn voor high-throughput gedragsanalyse.
- Relevantie voor screening: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op verdere evaluatie van neuroprotectieve of neurorestoratieve middelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert neonatale HI-condities bij mensen, zoals cerebrale parese en neonatale beroertes, met gezichtsvaliditeit wat betreft motorische tekorten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door middel van cognitieve en motorische fenotypering die is afgestemd op klinische observaties.
- Risico-gecorrigeerde besluitvorming: Informeert go/no-go-criteria door de ernst van het letsel te kwantificeren via MRI-gecorreleerde gedragsfenotypes.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het model past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische effectiviteitstesten, waardoor longitudinale beoordeling van neurobehavioraal herstel mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en het biologisch verminderen van risico's voor targets die betrokken zijn bij hypoxisch-ischemische cascades.
- Screening: Levert assay-klare fenotypes met gestandaardiseerde motorische en cognitieve read-outs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (latentie, slipfrequentie, grijpkracht) voor vergelijking tussen groepen en berekening van de effectgrootte.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via MRI-gevalideerde stratificatie van letsel en longitudinale gedragsmonitoring.
- Enterprise hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het screenen van meerdere therapeutische modaliteiten binnen programma's voor neurodegeneratieve en ontwikkelingsgerelateerde letsels.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door unilaterale carotisligatie te koppelen aan hemisfeer-specifieke functionele tekorten.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde chirurgische en gedragsprotocollen tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege voorspellende signalen van motorische en cognitieve werkzaamheid te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van gedragsmatig herstel in cohorts met vergelijkbare letsels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neonatale knaagdierschirurgie en microsurgische vaatligatie.
- Afhankelijk van hypoxicekamerapparatuur en nauwkeurige gasregulering voor een consistente inductie van het letsel.
- Noodzaak van geblindeerd gedragsonderzoek om waarnemersbias bij het tellen van slippen en het meten van latentie te voorkomen.
- Vereist aanpassing van de gedragsapparatuur aan de grootte en motorische capaciteit van muizen op zes weken leeftijd.
- Beperkt door variabiliteit in de penetrantie van het letsel, waardoor postoperatieve MRI of morfologische screening noodzakelijk is voor cohortstratificatie.
