Microfluïdische Imaging Flow Cytometry door Asymmetrische Deteksie Time-stretch Optische Microscopie (ATOM)
28 juni 2017
Dit protocol beschrijft de implementatie van een asymmetrische detectie tijdstens optisch microscopiesysteem voor single-cell imaging in ultrafast microfluidische stroom en zijn toepassingen in beeldstroomcytometrie.
Het algemene doel van dit protocol is om een asymmetrisch detectietijdrek optische microscopiesysteem voor te bereiden en te gebruiken voor label-vrije hoge contrast enkele-cel beeldvorming in ultra-snelle microfluïdische stroming. Het belangrijkste voordeel van ATOM is dat het ultra-snelle beeldacquisitie mogelijk maakt met lijnscansnelheden tot tientallen megahertz terwijl het de beeldcontrast op de niet-gelabelde cellen verbetert. ATOM maakt complexe morfologische analyse van cellulaire en subcellulaire structuren mogelijk met een niet-gecentreerde cel-gebaseerde assays tot 100.000 cellen per seconde, wat niet mogelijk is met standaard flowcytometrie.
Om te beginnen met het opzetten van het systeem, gebruik een vezelcollimator om een breedband femto- of picoseconde dichtbij IR gepulseerde laser te koppelen aan een single mode dispersieve optische vezel die is verbonden met een optische versterker. Belicht een transmissiediffractiegradiënt met de laser om een spectraal regen te produceren. Orienteer de gradiënt dicht bij de Littrow-configuratie om de diffractie-efficiëntie te maximaliseren.
Configureer een telescopische relaislenssamenstelling in een 4f beeldvormingssysteem om de spectraal regen op de achterste brandpuntsvlak van een objectieflens onder een monsterplatform te richten. Zorg ervoor dat de spectraal regen de achterste opening van de objectieflens vult. Plaats een andere objectieflens met een vlak spiegel op zijn achterste opening boven het monsterplatform.
Pas de objectieflenzen aan totdat hun brandvlakken overlappen. Controleer of de spectraal regen het beeldvlak dubbel passeert en dezelfde weg terug naar de gradiënt volgt. Plaats een microfluïdische chip op het monsterplatform en zorg ervoor dat de spectraal regen over het microfluïdische kanaal valt.
Leidt het teruggekeerde licht om met een lichtdeler nadat het de gradiënt heeft doorlopen. Scheid het teruggekeerde licht in twee bundels met een andere lichtdeler. Gebruik vezelcollimators om de bundels te koppelen aan enkele mode vezels van verschillende lengtes om een tijdsvertraging tussen de bundels in te voeren.
Verbind de vezels met een realtime oscilloscoop via een vezelkoppeling en een fotodetector. Stem de versterking van de optische versterker totdat het signaal-ruisverhouding van het optische signaal groter is dan 10 decibel. Blokkeer vervolgens ongeveer de helft van elke teruggekeerde bundel met mesrand straalblokken.
Pas de straalblokken aan totdat het gemeten optische vermogen in elke vezel ongeveer de helft is van het vermogen vóór de blok. Controleer of de oscilloscoopbandbreedte en bemonsteringssnelheid allebei hoog genoeg zijn om de beeldresolutie niet te beïnvloeden. Om het experiment te beginnen, verdun celmonsters tot tussen 10 tot de 5e en 10 tot de 6e cellen per milliliter met fosfaat gebufferd zoutoplossing of bronwater.
Laad vervolgens de celoplossing in een 10 milliliter spuit. Verbind de spuit met de microfluïdische kanaal inlaat. Leid de microfluïdische kanaal uitlaat naar een centrifugeerbuisje.
Bevestig de spuit in een spuitpomp en stel de stromingssnelheid geschikt in voor de kanaalbreedte. Kies het aantal gegevenspunten dat moet worden opgeslagen voor het experiment. Verzamel en sla vervolgens de optische signaalgegevens op.
Digitaliseer en exporteer de gegevens van de oscilloscoop naar een computer. Verwerk de gegevens tot 2D beelden en extracteer een bibliotheek van parameters uit de beelden. Importeer de beelden in de parameterbibliotheek in een visualisatieprogramma.
Ken een parameter van belang toe aan elke as en selecteer de gegevensset die moet worden weergegeven als een scatterplot. Controleer de celbeelden geassocieerd met elke groep in de plot om trends te identificeren. Gebruik handmatig gating of toon aanvullende datasets voor verdere analyse indien nodig.
ATOM werd gebruikt om hoge contrast enkele-cel beelden van menselijke cellen en fytoplankton te verkrijgen. Karakteristieke celstructuren zoals vacuolen, pyrenoïden en flagellen, zijn zichtbaar in de fytoplankton beelden. Parameters zoals celgrootte en circulariteit werden bepaald uit de ATOM beelden om cellen te classificeren voor cytometrische analyse.
De classificatieresultaten kunnen worden weergegeven als 2D scatterplots. Hier werd volume versus circulariteit uitgezet voor een MCF7 getoond in geel en PBMC getoond in rood. Twee clusters werden waargenomen voor MCF7.
Door de hoge contrast beelden te identificeren die overeenkomen met individuele gegevenspunten, werd gevonden dat de lagere cluster overeenkomt met celfragmenten en puin. Eenmaal beheerst kan het beeldvormingssysteem in twee tot drie uur worden ingesteld als het op de juiste manier wordt uitgevoerd. De beeldvormingsprocedures kunnen binnen een uur worden uitgevoerd.
Vergeet niet speciale aandacht te besteden aan oogveiligheid tijdens het werken met de laserbron en laserstraaluitlijning. Voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van veiligheidsbrillen moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures. Terwijl u deze procedure probeert, vergeet niet om de optische straaluitlijning door het hele beeldvormingssysteem op te volgen om een optimale beeldadvertentie te garanderen.
Hoewel deze techniek inzicht kan geven in de detectie en kwantificering van zeldzame of duidelijke cellen tijdens een ziekteproces, kan het ook worden toegepast op celtypeclassificatie binnen grote en heterogene celpopulaties. Deze techniek is bijzonder voordelig bij het overwinnen van de doorvoerlimiet van beeldvormingscytometrie, met behoud van de beeldadvertentie. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ATOM kunt implementeren vanaf de systeemopzet tot de beeldvormingsprocedures.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de implementatie van een asymmetrisch-detectie tijd-stretch optische microscopie systeem voor label-vrije hoge contrast enkele-cel beeldvorming in ultrasnelle microfluïdische stroming. Het ATOM systeem maakt ultra-snelle beeldvastlegging mogelijk en verbetert het beeldcontrast op ongelabelde cellen, waardoor complexe morfologische analyse mogelijk wordt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Optische Microscopie
- Enkele-Cel Beeldvorming
- Microfluïdica
Achtergrond
- ATOM maakt beeldvorming mogelijk bij lijnscan snelheden van maximaal tientallen megahertz.
- Het verbetert het beeldcontrast voor ongelabelde cellen.
- Maakt analyse van cellulaire en subcellulaire structuren mogelijk.
- Ondersteunt niet-gecentreerde cel-gebaseerde assays met hoge doorvoer.
Doel van studie
- Om een asymmetrisch detectie tijd-stretch optische microscopie systeem voor te bereiden en te gebruiken.
- Om label-vrije hoge contrast beeldvorming van enkele cellen te bereiken.
- Om beeldvorming in ultra-snelle microfluïdische stroming mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- De opstelling omvat het gebruik van een vezel collimator en een nabij-IR gepulseerde laser.
- Koppelen van de laser aan een enkele modus dispersieve optische vezel.
- Gebruik van een optische versterker om het signaal te verbeteren.
- Belichten van een transmissie diffractie rooster om een spectraal douche te produceren.
Belangrijkste resultaten
- Beeldvorming van maximaal 100.000 cellen per seconde bereikt.
- Verbeterd contrast voor ongelabelde cellen aangetoond.
- Complexe morfologische analyse mogelijk gemaakt die niet mogelijk is met standaard flow cytometry.
- Een nieuwe aanpak voor hoog-doorvoer beeldvorming geboden.
Conclusies
- ATOM vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in enkele-cel beeldvorming technologie.
- Het maakt snelle en gedetailleerde analyse van cellulaire structuren mogelijk.
- Deze methode kan benaderingen in flow cytometry en aanverwante velden transformeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through label-free morphological analysis of cellular and subcellular structures.
- Operational Value: Supports functional target validation by de-risking mechanistic ambiguity via high-throughput biophysical phenotyping.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating quantitative morphological parameters (e.g., size, circularity) for cytometric classification of cell states and functions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering high-contrast, sub-cellular resolution images without labels or stains.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through ultrafast line scan rates and consistent optical signal processing.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by enabling imaging flow cytometry at 100,000 cells/s, overcoming traditional throughput bottlenecks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by detecting rare or aberrant cells in heterogeneous populations, as demonstrated with human cell lines and micro-algae.
- Preclinical Alignment: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through label-free imaging that complements biomarker-based assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement by linking morphological trends to functional outcomes via scatter plot analysis and manual gating.
Pipeline & Workflow Integration
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling complex morphological analysis of cellular structures in microfluidic flow.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through high-speed image capture and quantitative parameter extraction from single-cell images.
- Analytics: Provides measurable outputs such as cell size, circularity, and texture for comparative analysis and classification in scatter plots.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling label-free imaging of heterogeneous cell populations, supporting biomarker-independent phenotypic screening.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for high-throughput imaging across model systems, reducing dependency on staining protocols and accelerating assay development cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free morphological de-risking and reduction of ambiguity in cellular classification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via ultrafast imaging and consistent signal-to-noise ratio control (>10 dB).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of rare or aberrant cells.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative morphological data from high-throughput imaging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical microscopy, ultrafast laser systems, and microfluidic flow control.
- Needs broadband femtosecond/picosecond near-IR pulsed laser, optical amplifier, diffraction grating, and high-bandwidth oscilloscope.
- Demands cross-team standardization for beam alignment, knife-edge blocking, and fiber length calibration to maintain image contrast and timing.
- Involves adaptation considerations for varying cell types and microfluidic channel dimensions to ensure optimal spectral shower coverage.
- Includes practical limitations such as laser safety requirements and the need for precise optical path alignment to avoid resolution degradation.
