Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

Het algemene doel van deze isolatiemethode van klinische graad is het isoleren van humane perivasculaire stromale cellen uit de nier, of kPSC, voor de celtherapeutische behandeling van diverse nierziekten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de regeneratieve geneeskunde, zoals de geschiktheid van humane kPSC's voor celtherapie bij nierziekten en transplantaties. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze klinisch toepasbaar is en kan worden gebruikt om een voldoende aantal kPSC's te genereren voor celtherapeutische doeleinden.

Ellen Lievers, een technicus in ons laboratorium, zal de functionele tests van kPSCs demonstreren. Voordat u begint met de procedure voor de isolatie van niercellen, sluit u een gesteriliseerde perfusiebak in verticale positie aan op een waterbad. Wanneer de perfusiebak is opgewarmd door het water, brengt u de bak in horizontale positie, terwijl deze nog steeds is aangesloten op het waterbad, en plaatst u vervolgens een L/S 25-slang in de pomp.

Plaats de klem voor culturen aan één uiteinde van de slang en laat de slang op de bodem van de tray rusten. Plaats steriel gaas bovenop de slang om obstructie te voorkomen, en bevestig een luer-connector aan het andere uiteinde van de slang, voeg vervolgens ongeveer 100 milliliters medium toe aan de tray en begin met het spoelen van de L/S 25-slang bij een pompsnelheid van 100 milliliters per minuut. Om de niercellen te isoleren, wordt de nier vanuit de dubbele steriele zakken overgebracht naar de steriele perfusietray, waarna met een schaar en door voorzichtig te scheuren het perirenale vetweefsel en het nierkapsel worden verwijderd.

Zodra de nierslagader op de aortapatch is gelokaliseerd, gebruikt u de hulpspike om de nierslagader te canuleren en bevestigt u de spike met een gesteriliseerde kabelbinder. Sluit bij ingeschakelde pomp het uiteinde van de pompslang aan op de luer-connector. Spoel de nier vervolgens door met het medium in de tray met een stroomsnelheid van 100 milliliter per minuut.

Voeg vervolgens 20 milliliters collagenase en 2,5 milliliters DNAse toe aan de perfusiebak en laat de enzymen de nier verteren; draai het orgaan af en toe voorzichtig met de hand totdat het zacht wordt en de perfusievloeistof troebel begint te worden. De duur van de collagenase-vertering is kritisch; een te korte duur leidt tot celklonters, terwijl een te lange duur leidt tot celdood. Masseer na afloop van de enzymatische perfusie de nier voorzichtig totdat er een celsuspensie is verkregen, en verwijder het niet-verteerde materiaal en de spike.

Voeg 50 milliliter normaal menselijk serum toe aan de celsuspensie en plaats vervolgens, terwijl de pomp op een lage stroomsnelheid staat, de aan de nier verbonden buis boven verschillende opvangbuizen van 50 milliliter, zodat de celsuspensie vanuit de perfusiebak in de opvangbuizen kan lopen. Wanneer alle cellen zijn opgevangen, worden de celsuspensies gecentrifugeerd en de pellets twee keer gewassen met wasmedium, aangevuld met 10% normaal menselijk serum. Na de tweede wasbeurt worden de pellets geresuspendeerd in een volume celkweekmedium dat gelijk is aan dat van de celpellets.

Om de ruwe niercellen te kweken, voegt u ongeveer één milliliter cel-suspensie toe aan 24 milliliter alpha-MEM 5% platelet lysate celkweekmedium per T 175 celkweekfles, en incubeert u de flessen bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder na twee dagen het supernatant en het celdebris, en voed de cellen met 25 milliliter vers celkweekmedium. Wanneer de cellen confluent zijn, isoleert u de NG2-positieve fractie via magnetische celseparatie, volgens standaardprotocollen.

Zaai vervolgens 4 x 10³ NG2-positieve cellen per vierkante centimeter in een passende kweekfles en plaats de fles in de celkweekincubator. Wanneer de cellen een confluentie van 90 tot 100% bereiken, wordt het supernatant geoogst en worden de adherente cellen twee keer gewassen met PBS. Detacheer de cellen met het juiste volume trypsine, afhankelijk van de flesgrootte, en stop de reactie na vijf minuten met het gereserveerde supernatant.

Resuspendeer de cellen voorzichtig, breng de celsuspensie vervolgens over naar een conische buis van passende grootte voor centrifugatie en zaai de cellen opnieuw uit bij een dichtheid van 4 × 10³ cellen per cm².

Zaai na vier tot vijf passages de kPSC's uit in een zeswellsplaat met een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per 2 mL medium per well, en zaai 5 × 10⁵ proximale tubulaire epitheelcellen uit in 2 mL medium voor proximale tubulaire epitheelcellen per well in een aparte zeswellsplaat. Plaats beide platen gedurende 48 uur in de celkweekincubator, oogst aan het einde van de incubatie het supernatant van de kPSC-cellen, verwijder vervolgens het supernatant van de proximale tubulaire epitheelcellen en gebruik een gele pipetpunt om een kras te maken in de cellaag op de bodem van elke well. Was de gekraste cellen met PBS en voeg het geconditioneerde medium van de niervasculaire stromale celkweken toe.

Beeld vervolgens de kras na vier, acht, 12 en 24 uur af op dezelfde gemarkeerde positie met een inverted brightfield-microscoop om het percentage sluiting in de loop van de tijd te beoordelen. Perivasculaire stromale cellen van de nier zijn plastic-adherente, spoelvormige cellen die positief zijn voor stromale en perivasculaire celmarkers, en negatief voor de markers CD31, CD34, CD45 en HLA-DR. Doorgaans kan een homogene populatie perivasculaire stromale niercellen worden bereikt bij passage vier, waarbij de cellen rond passage negen tot 10 senescentie bereiken.

In deze representatieve wound scratch assay om de functionele capaciteit van de kPSCs te beoordelen, sloot de wond significant sneller wanneer geconditioneerd medium van een nier-perivasculaire stromale celcultuur werd toegevoegd dan in wells die waren gekweekt met het controlemedium. Zodra de primaire isolatietechniek beheerst is en ongeveer twee uur in beslag neemt, zal het één tot twee maanden duren om een homogene kPSC-populatie te genereren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de behandeling met collagenase te stoppen zodra de nier zacht wordt en de vloeistoffen minder transparant worden.

Naast de hier gedemonstreerde procedures kunnen deze technieken ook worden gebruikt voor de isolatie van perivasculaire stromale cellen uit andere solide organen. De kPSCs die met deze techniek worden geïsoleerd, kunnen worden gebruikt om het regeneratieve potentieel van deze cellen te bestuderen in verschillende modellen van nierziekten en transplantatie. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om kPSCs op klinische wijze te isoleren en te kweken.

Vergeet niet dat het werken met menselijk materiaal het risico op virusoverdracht met zich meebrengt; neem altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het testen op HIV, hepatitis B en hepatitis C, bij het uitvoeren van deze procedure.