Name: Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer een klinische isolatiemethode voor nierperivasculaire stromale cellen (kPSCs) met behulp van orgaanperfusie en NG2-celverrijking. Deze techniek genereert voldoende cellen voor regeneratieve therapieën bij nierziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek heeft financiering ontvangen van de Europese Gemeenschap zevende kader programma (KP7/2007-2013) onder overeenkomstnummer 305436 subsidie STELLAR.

De lokale medische ethische commissie en het ethische adviesorgaan van het Europese consortium (STELLAR) keurden het onderzoek goed en de verzameling van menselijke transplantgraad-nieren die voornamelijk om chirurgische redenen zijn weggegooid. Er werd toestemming gegeven voor onderzoek voor alle nieren.
1. Voorbereidingen voor celcultuur
<ol>
	<li>Bereid een pool van bloedplaatjeslysaat voor.
	<ol>
		<li>Bewaar de bloedplaatjes die minder dan 2 d zijn verlopen op -80 °C tot gebruik (voor maximaal 1 jaar). 
		OPMERKING: De bloedplaatjes waren oorspronkelijk afkomstig van een commerciële leverancier. Ziekenhuisoverschotmateriaal dat werd gedistribueerd door de lokale bloedbank werd verkregen.</li>
		<li>Ontdooi de bloedplaatjes van ten minste 5 donoren (bij voorkeur 10) O/N bij 4 °C.</li>
		<li>Pool de bloedplaatjes in een grote steriele fles, overbreng naar kegelcentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 10 min bij 1.960 x g bij 4 °C. 
		OPMERKING: Het volume van de bloedplaatjes hangt af van het aantal donoren en de hoeveelheid ziekenhuisoverschotmateriaal per donor.</li>
		<li>Pipet de supernatant naar bloedzakken (50 mL/zak) door de loop van een 50 mL spuit. Bewaar op -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereiding van celcultuurmedium.
	<ol>
		<li>Ontdooi een zak bloedplaatjeslysaat in een waterbad bij 37 °C.</li>
		<li>Voeg 1 L (dwz 2 flessen) Minimum Essential Medium - alpha modificatie (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, en 20 mL penicilline (5.000 U/mL)/streptomycine (5.000 µg/mL) (pen/strep) toe aan de zak.</li>
		<li>Incubeer gedurende 3 h bij 37 °C.</li>
		<li>Schud de zak voor degelling door zachtjes op de zak te tikken wanneer de zak op een vlakke ondergrond ligt.</li>
		<li>Filter het 5% bloedplaatjeslysaatmedium door het lysaat met een steriele 50 mL spuit door de filter van het transfusiesysteem te trekken.</li>
		<li>Bewaar het medium in 50 mL buisjes en bewaar op -80 °C tot gebruik. 
		OPMERKING: Elke nieuwe batch bloedplaatjeslysaat wordt getest in celcultuur en vergeleken met de vorige batch door cellen van belang (bmMSCs of kPSCs) tot confluency in beide batches te laten groeien. In celaantal en levensvatbaarheid mogen de kPSCs of bmMCs die in de nieuwe batch zijn gekweekt niet meer dan 10% afwijken, en de markerexpressie van CD73, CD90, CD105 en CD31, CD34 en CD45 zoals geanalyseerd door flowcytometrie mogen niet afwijken. De methoden van celcultuur worden beschreven in sectie 6 van het protocol (Cultuur van kPSC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Voorbereidingen voor celoogst
<ol>
	<li>Bereiding van oplossingen.
	<ol>
		<li>Bereid het platte medium voor door 10 mL pen/strep toe te voegen aan 500 mL (1 fles) Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.</li>
		<li>Bereid het wasmedium voor door 50 mL Normaal Humaan Serum (NHS) en 10 mL pen/strep toe te voegen aan 1 fles DMEM-F12.</li>
		<li>Bereid de enzym-stockbuffer voor door 2,9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1,2 mL NaHCO3 2,5% [w/v] en 160 µL CaCl2 (1 M) toe te voegen aan 160 mL University of Wisconsin-oplossing.</li>
		<li>Bereid de collagenaseoplossing voor door langzaam 20 mL enzymstockbuffer toe te voegen aan de fles GMP-grade collagenase met >2.000 U/fles collagenase. Los op bij 4 °C gedurende ongeveer 40 min. Schud zachtjes meerdere keren tijdens de oplosperiode.</li>
		<li>Bereid het bevriezingsmedium voor door 5 mL dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan 45 mL NHS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voorbereiding van perfusiebak (Figuur 1A).
	<ol>
		<li>Reinig de flowcabine en bedek deze met chirurgische lakens. Verwarm een waterbad tot ongeveer 40 - 45 °C om de perfusiebak op 37 °C te verwarmen. Trek chirurgische jassen en chirurgische handschoenen aan.</li>
		<li>Verbind een gesteriliseerde perfusiebak met het waterbad om de perfusiebak voor te verwarmen met warm water. Zorg ervoor dat er geen lucht in de perfusiebak is door te beginnen met de perfusiebak in verticale positie. Voeg indien nodig meer water toe aan het waterbad om luchtinvoer in de perfusiebak te voorkomen.</li>
		<li>Plaats de LS25 buis in de pomp. Laat beide steriele uiteinden van de buis in de flowcabine. Plaats een Kocher's pincet op een uiteinde van de buis en laat deze op de bodem van de perfusiebak rusten. Plaats een steriele gaas op de buis om obstructie te voorkomen. Bevestig een Luer-connector op het andere buiseinde.</li>
		<li>Voeg ongeveer 100 mL plat medium toe aan de perfusiebak en begin met het spoelen van de buis op een pompsnelheid van 100 mL/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Isolatie van niercellen
<ol>
	<li>Voorbereiding van de nier.
	<ol>
		<li>Verwijder de nier uit de dubbele steriele zakken en plaats deze op de steriele perfusiebak (Figuur 1B). Verwijder het perirenale vetweefsel en de nierkapsel met schaar en zacht scheuren (Figuur 1C) en identificeer de nierarterie op de aortapatch zoals getoond in Figuur 1D.</li>

<ol><li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation.</a> Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).</li>
<li>Reinders, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+allograft+rejection+after+renal+transplantation%3A+results+of+a+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+a+pilot+study+of+safety+and+clinical+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+pretransplant+infusion+protects+from+graft+dysfunction+while+fostering+immunoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation.</a> Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Sacchetti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Identical+%22Mesenchymal+Stem+Cells%22+at+Different+Times+and+Sites%3A+Human+Committed+Progenitors+of+Distinct+Origin+and+Differentiation+Potential+Are+Incorporated+as+Adventitial+Cells+in+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myocardial+pericytes%3A+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li>
<li>Dekel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+nontubular+sca-1%2Blin-+multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+from+adult+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+duct-derived+cells+display+mesenchymal+stem+cell+properties+and+retain+selective+in+vitro+and+in+vivo+epithelial+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity.</a> J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-Grade+Isolated+Human+Kidney+Perivascular+Stromal+Cells+as+an+Organotypic+Cell+Source+for+Kidney+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+mesenchymal+stem+cells+in+human+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).</li>
<li>Ryan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HK-2%3A+an+immortalized+proximal+tubule+epithelial+cell+line+from+normal+adult+human+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney.</a> Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).</li>
<li>Nijhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycemic+Stability+Through+Islet-After-Kidney+Transplantation+Using+an+Alemtuzumab-Based+Induction+Regimen+and+Long-Term+Triple-Maintenance+Immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression.</a> Am J Transplant. , (2015).</li>
</ol>

D.G.L., M.A.E., en T.J.R. zijn geassocieerd met een octrooi-aanvraag met betrekking tot dit onderzoek. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Gerelateerde cellen werden geïsoleerd van vele verschillende menselijke solide organen, met inbegrip van de nier9,15,16, alvleesklier, vet en kraakbeen. De meeste methoden, zijn echter gebaseerd op kleine monsters van weefsel, dat zijn ontleed en daarna behandeld met spijsverteringsenzymen. Bovendien, dit is meestal niet uitgevoerd met klinische grade producten. Dit maakt deze strategieën minder geschikt voor directe klinische vertaling indien grote hoeveelheden van klinische-grade cellen noodzakelijk zijn.
Hier laten we een methode van de roman isolatie van menselijke kPSCs voor hele organen gebaseerd op perfusie met klinische rang enzymen en materialen. Het protocol is aangepast van het protocol van de isolatie van klinische eilandjes van Langerhans die momenteel in gebruik voor klinische toepassing in onze center-18.
Dit is de eerste klinische rang methode indien grote hoeveelheden van kPSCs kunnen worden bereikt. De variabiliteit in cel opbrengst is grotendeels donor afhankelijk. Echter, wanneer het rendement van de cel dat we momenteel van een fractie van de ruwe celsuspensie van drie verschillende donoren verkrijgen is geëxtrapoleerd, in theorie, een gemiddelde opbrengst van 2,7 x 1012 kPSCs per donor kan worden bereikt. Zoals MSC therapie meestal uit 2 cel infusies met 1-2 x 106 cellen/kg lichaam gewicht4 bestaat, wordt deze cel nummers volstaan voor allogene behandeling van verschillende patiënten.
Een cruciale stap in de isolatie-procedure is de duur van collagenase spijsvertering. Wanneer de spijsvertering-periode te kort is, blijft grote bosjes van weefsel, die moeilijker te cultuur zal worden. Wanneer de perfusie-periode lang is, kan toegenomen celdood worden waargenomen. Daarom, zodra de nier begint te zacht en het vocht minder transparant worden, de nier voorzichtig moet worden gemasseerd en de collagenase behandeling moet worden gestopt.
Een andere belangrijke stap is de cultuur van de cellen na NG2 cel verrijking. Soms na de NG2 cel verrijking start de gerelateerde cellen niet beginnen te groeien in 3D structuren te vermenigvuldigen. In dit geval, wanneer de cellen trypsinized en reseeded, zal de cellen meestal beginnen te groeien in enkelgelaagde cultuur.
Als grondstof, werden menselijk transplantatie rang nieren verwijderd voornamelijk omwille van de chirurgische gebruikt. Dit zijn de functionele organen zonder grote fibrose. Wij erkennen dat dit een beperking zou kunnen zijn, aangezien dit een relatief zeldzame is en moeilijk te verkrijgen van orgel bron. Transplanteren nieren zou kunnen zijn een andere bron; echter, afhankelijk van de reden van uitname van de nieren, deze nieren bevatten meer fibrose en dus myofibroblasts, en daarom moet worden gezorgd aangezien myofibroblasts zou kunnen worden geïsoleerd en in plaats van gerelateerde cellen gekweekt.
Zoals de kPSCs geïsoleerd met deze show protocol organo-typisch eigenschappen met nier epitheliale wond genezing capaciteiten15, celtherapie met kPSCs in nierziekten en transplantatie zou een interessante toekomstige toepassing. Voor dit doel zijn er verschillende strategieën van cel/levering van het product. De eerste strategie is IV infusie van kPSCs, zoals gebruikt op dit moment in de klinische studies van bmMSC. Een andere interessante toepassing is het gebruik van kPSCs of kPSC-uitgescheiden factoren in machine perfusie voor transplantatie. Op deze manier kan de kwaliteit van de transplanteren nieren verbeteren kan leiden tot een verbeterde nierfunctie na de transplantatie. Voor beide strategieën zijn kPSCs een interessante bron voor nieuwe cel verder te verkennen voor klinische doeleinden.

Mesenchymale stromale cellen (MSCs) zijn f immuuncellen die oorspronkelijk geïsoleerd uit het beenmerg werden. Ze worden gekenmerkt door hun vorm van morfologie, mogelijkheid om te differentiëren in vet, been en kraakbeen en de naleving van de kunststof spindel. MSCs express de stromale markers CD73, CD90, CD105 terwijl negatief voor de markeringen CD31 en CD451,2,3. MSCs zijn een veelbelovende kandidaat voor celtherapie vanwege hun weefsel homeostatische en immunomodulerende capaciteiten. bmMSCs zijn momenteel bestudeerd wordt in klinische proeven voor verschillende ziekten, zoals nierziekten en niertransplantatie als herzien elders4.
Eerder werd aangetoond dat gerelateerde cellen van verscheidene verschillende solide organen, met inbegrip van vetweefsel, placenta en skeletspieren kenmerken met MSCs9delen. Deze cellen vertonen echter ook weefsel-specifieke functies die in organotypic reparatie10 resulteren kunnen. Menselijke myocardiale gerelateerde cellen, bijvoorbeeld, angiogenic reacties na hypoxie gestimuleerd en gedifferentieerde in cardiomyocytes, terwijl gerelateerde cellen geïsoleerd van andere weefsels bleek niet dat deze potentieel11.
Gerelateerde stromale cellen kunnen ook worden geïsoleerd van de muis12,13,14 en menselijke nieren15,16. Wij uitgebreid gekenmerkt kPSCs en ten opzichte van deze bmMSCs. We vonden dat kPSCs, vergelijkbaar met bmMSCs, hebben van immunosuppressieve capaciteiten en vasculaire plexus vorming kunnen ondersteunen. Echter, er zijn weefsel specifieke verschillen tussen de celtypes, als kPSCs toonden een organotypic transcriptionele expressie handtekening, met inbegrip van de nefrogene transcriptiefactoren, HoxD10 en HoxD11. kPSCs, in tegenstelling tot bmMSCs, niet myofibroblast transformatie na stimulatie met TGF-β ondergaan en waren niet in staat om te differentiëren in adipocytes. Bovendien versneld kPSCs epitheliale integriteit in een nier buisvormige epitheliale wond kras assay, een verschijnsel dat niet met bmMSCs werd waargenomen. Deze verbeterde wond reparatie was gemedieerde via hepatocyte groeifactor vrijmaking. Bovendien verbeterd kPSCs nier schade in een muismodel van acute nier schade15. Daarom kPSCs lijken te hebben van de superieure renale reparatie capaciteiten en een interessante nieuwe bron voor celtherapie in nierziekten.
Om te kunnen kPSCs voor cel therapie doeleinden gebruiken, moeten kPSCs worden afgezonderd in een klinische rang wijze met klinische rang enzymen en protocollen. Bovendien, om te kunnen behandelen verschillende patiënten met kPSCs van 1 donor, voldoende cel nummers moeten worden verkregen. Hier laten we in detail, de klinische rang isolatie procedure van kPSCs van hele transplantatie rang nieren, levert voldoende aantallen cellen worden gebruikt voor klinische cellulaire therapie.

<table><tbody><tr><td>Baxter bags</td><td>Fenwal</td><td>R4R-7004</td><td></td></tr><tr><td>Human platelets</td><td>Sanquin</td><td></td><td>ziekenhuisoverschotmateriaal verlopen minder dan 2 d wordt gebruikt</td></tr><tr><td>platelet lysate</td><td></td><td></td><td>op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Disposable sterile bottles</td><td>Corning</td><td>09-761-11</td><td></td></tr><tr><td>500 mL PP centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>glutamax</td><td>thermo fisher</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>pen/strep&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>transfusion system</td><td>Codan</td><td>455609</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>life technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Serum (NHS)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Lonza</td><td>BE-17-737E</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 7.5%</td><td>Lonza</td><td>BE17-613E</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>UW</td><td>Bridge to life</td><td>32911</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagenase NB1 GMP grade</td><td>SERVA</td><td>17455.03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>surgical drapes</td><td>3M Nederland</td><td>DH999969404</td><td></td></tr><tr><td>perfusion pump</td><td>metrohm</td><td>x007528300</td><td></td></tr><tr><td>pump head</td><td>metrohm</td><td>x077202600</td><td></td></tr><tr><td>perfusion tray</td><td></td><td></td><td>op maat gemaakt</td></tr><tr><td>LS25 masterflex tubes</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-25</td><td></td></tr><tr><td>accessory spike</td><td>Gambro DASCO</td><td>6038020</td><td></td></tr><tr><td>pulmozyme</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>culture flasks 25 cm2</td><td>greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 75 cm2</td><td>greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 175 cm2</td><td>greiner</td><td>661160</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>sigma</td><td>t4174</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500g</td><td></td></tr><tr><td>FcR blocking reagent</td><td>miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>anti melanoma beads (NG2)</td><td>miltenyi</td><td>130-090-452</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer 70 &micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnet</td><td>miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>CD146 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td>550315</td><td></td></tr><tr><td>NG2 APC</td><td>R&amp;D</td><td>FAB2585A</td><td></td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td>555596</td><td></td></tr><tr><td>HLA ABC APC</td><td>BD&nbsp;</td><td>555555</td><td></td></tr><tr><td>CD105 FITC</td><td>Ancell</td><td>326-040</td><td></td></tr><tr><td>HLA DR APC</td><td>BD&nbsp;</td><td>559866</td><td></td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td>555516</td><td></td></tr><tr><td>CD73 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td>550257</td><td></td></tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td>555445</td><td></td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>miltenyi</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-r&nbsp;</td><td>R&amp;D</td><td>mab 1263</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td>345815</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td>345816</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td>345818</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b PE</td><td>BD&nbsp;</td><td>555743</td><td></td></tr><tr><td>goat anti mouse PE</td><td>Dako</td><td>R0480</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Merck</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Ham&rsquo;s F12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>triiodothyrinine</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Immortalized human renal PTEC (HK2)</td><td></td><td></td><td>met dank aan M. Ryan, University College Dublin</td></tr></tbody></table>

een nieuwe klinische grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymale stromale cellen (MSCs) zijn homeostatische en immuun f weefselcellen die hebben gunstige effecten aangetoond in nierziekten en -transplantatie. Gerelateerde stromale cellen (PSC) bepaalde karakteristieken gemeen met beenmerg MSCs (bmMSCs). Echter bezitten ze ook, waarschijnlijk als gevolg van lokale inprenting, weefsel-specifieke eigenschappen en spelen een rol in de homeostase van het lokale weefsel. De specificiteit van dit weefsel kan resulteren in specifieke reparatie van weefsel, ook binnen de menselijke nieren. Eerder toonden wij dat menselijke nieren PSC's (kPSCs) nier epitheliale wond genezing overwegende dat bmMSCs heb niet dit potentieel hebben versterkt. Bovendien kunnen kPSCs nier schade in vivoverzachten. KPSCs vormen dus een interessante bron voor celtherapie, met name voor nierziekten en niertransplantatie. Hier laten we de gedetailleerde isolatie en cultuur methode voor kPSCs van transplantatie-grade menselijke nieren gebaseerd op geheel-orgel perfusie van spijsverteringsenzymen via de renale slagader en een verrijking voor de gerelateerde marker NG2. Op deze manier kunnen grote cel hoeveelheden worden verkregen die geschikt voor cellulaire therapie zijn.

De klinische rang kPSCs isolatie methode is samengevat in Figuur 1. Ruwe nier cellen zijn geïsoleerd van de transplantatie van menselijke rang nieren door collagenase perfusie. De resulterende celsuspensie is gekweekt tot heuvels in 5% bloedplaatjes lysates. Vervolgens is de gerelateerde stromale cellen breuk geïsoleerd gebaseerd op NG2 expressie.
kPSCs kunststof aanhangend spindel-vormig cellen(Figuur 2)en zijn positief voor de stromale markeringen CD90, CD105, CD73 en gerelateerde markers NG2, PDGFR-B en CD146, terwijl negatief voor CD31, CD34, CD45 en HLA-DR (Figuur 2B). Meestal een homogene populatie van kPSCs kan worden bereikt bij passage 4 en kPSCs bereiken senescentie rond passage 9-10 (Figuur 2C). Wij adviseren dan ook om uit te voeren van de experimenten tussen passage 5-8.
Om te beoordelen van de functionele capaciteit van de geïsoleerde kPSCs, voeren wij een in vitro nier epitheliale wond kras assay op elke nieuwe partij van kPSCs, zoals we eerder liet zien dat het geconditioneerde medium van kPSCs kan versnellen epitheliale wondgenezing in deze kras assay15. Het kPSC geconditioneerde medium is gemaakt door kweken van kPSCs voor 48 uur in alphaMEM 5% bloedplaatjes lysates en het verzamelen van de bovendrijvende substantie. Vervolgens de vereeuwigd menselijke nieren proximale zaadvormende epitheliale cellen (HK-2)17 tot heuvels worden gekweekt en vervolgens een kras wond wordt gemaakt. Vervolgens ofwel het geconditioneerde medium van kPSCs of besturingselement medium wordt toegevoegd aan de putten en de snelheid van de wondgenezing wordt gemeten. Wanneer de geconditioneerde medium van kPSCs wordt toegevoegd, wordt de wond gesloten aanzienlijk sneller (Figuur 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg"> 
Figuur 1 : Klinische Grade isolatie methode van de menselijke kPSCs. Transplantatie rang nieren worden gecanuleerd en geperfundeerd met collagenase via de renale slagader (A - G) en de resulterende celsuspensie wordt gewassen en ofwel cryopreserved of cultuur (H - K) gestoken. Nadat de cellen bereiken confluentie (L), NG2 cel verrijking is uitgevoerd (M). Cellen zijn trypsinized wanneer ze ofwel confluente, prolifererende of wanneer 3D-structuren weergegeven (N - P) hebt gestopt. De release-criteria voor kPSCs zijn steriliteit, marker expressie en de mogelijkheid om buizen epitheliale wondgenezing (Q). Pijl: renale slagader. Schaal bar = 200 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg"> 
Figuur 2: karakterisering van menselijke kPSCs. Een) kPSCs zijn spindel-vormig, plastic Adherente cellen. B) kPSCs zijn positief voor mesenchymale markeringen CD73, CD90, CD105, gerelateerde markeringen NG2, PDGFR-β en CD146, terwijl negatieve voor CD31, CD34 en CD45. kPSCs express MHC-klasse ik (HLA-ABC) maar niet klasse II (HLA-DR). C) kenmerken van de groei van drie verschillende kPSC donoren van stroom cytometry bevestigd homogene NG2 positieve risicopopulaties (doorgang 4). kPSCs bereiken senescentie rond passage 9-10. D) kPSCs zijn in staat om de epitheliale reparatie nier in een wond kras assay. Representatieve beelden van controle medium en kPSC geconditioneerd medium bij t = 0, 4, 8 en 12 h staan. De bar van de schaal van A) = 200 µm, in D) = 100 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een nieuwe klinische rang isolatie en cultuur methode voor nieren gerelateerde stromale cellen (kPSCs) op basis van hele orgel perfusie met spijsverteringsenzymen en NG2-cel verrijking. Met deze methode is het mogelijk om het verwerven van voldoende cel nummers voor cellulaire therapie.

Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Het algemene doel van deze isolatiemethode van klinische graad is het isoleren van humane perivasculaire stromale cellen uit de nier, of kPSC, voor de celtherapeutische behandeling van diverse nierziekten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de regeneratieve geneeskunde, zoals de geschiktheid van humane kPSC's voor celtherapie bij nierziekten en transplantaties. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze klinisch toepasbaar is en kan worden gebruikt om een voldoende aantal kPSC's te genereren voor celtherapeutische doeleinden.Ellen Lievers, een technicus in ons laboratorium, zal de functionele tests van kPSCs demonstreren. Voordat u begint met de procedure voor de isolatie van niercellen, sluit u een gesteriliseerde perfusiebak in verticale positie aan op een waterbad. Wanneer de perfusiebak is opgewarmd door het water, brengt u de bak in horizontale positie, terwijl deze nog steeds is aangesloten op het waterbad, en plaatst u vervolgens een L/S 25-slang in de pomp.Plaats de klem voor culturen aan één uiteinde van de slang en laat de slang op de bodem van de tray rusten. Plaats steriel gaas bovenop de slang om obstructie te voorkomen, en bevestig een luer-connector aan het andere uiteinde van de slang, voeg vervolgens ongeveer 100 milliliters medium toe aan de tray en begin met het spoelen van de L/S 25-slang bij een pompsnelheid van 100 milliliters per minuut. Om de niercellen te isoleren, wordt de nier vanuit de dubbele steriele zakken overgebracht naar de steriele perfusietray, waarna met een schaar en door voorzichtig te scheuren het perirenale vetweefsel en het nierkapsel worden verwijderd.Zodra de nierslagader op de aortapatch is gelokaliseerd, gebruikt u de hulpspike om de nierslagader te canuleren en bevestigt u de spike met een gesteriliseerde kabelbinder. Sluit bij ingeschakelde pomp het uiteinde van de pompslang aan op de luer-connector. Spoel de nier vervolgens door met het medium in de tray met een stroomsnelheid van 100 milliliter per minuut.Voeg vervolgens 20 milliliters collagenase en 2,5 milliliters DNAse toe aan de perfusiebak en laat de enzymen de nier verteren; draai het orgaan af en toe voorzichtig met de hand totdat het zacht wordt en de perfusievloeistof troebel begint te worden. De duur van de collagenase-vertering is kritisch; een te korte duur leidt tot celklonters, terwijl een te lange duur leidt tot celdood. Masseer na afloop van de enzymatische perfusie de nier voorzichtig totdat er een celsuspensie is verkregen, en verwijder het niet-verteerde materiaal en de spike.Voeg 50 milliliter normaal menselijk serum toe aan de celsuspensie en plaats vervolgens, terwijl de pomp op een lage stroomsnelheid staat, de aan de nier verbonden buis boven verschillende opvangbuizen van 50 milliliter, zodat de celsuspensie vanuit de perfusiebak in de opvangbuizen kan lopen. Wanneer alle cellen zijn opgevangen, worden de celsuspensies gecentrifugeerd en de pellets twee keer gewassen met wasmedium, aangevuld met 10% normaal menselijk serum. Na de tweede wasbeurt worden de pellets geresuspendeerd in een volume celkweekmedium dat gelijk is aan dat van de celpellets.Om de ruwe niercellen te kweken, voegt u ongeveer één milliliter cel-suspensie toe aan 24 milliliter alpha-MEM 5% platelet lysate celkweekmedium per T 175 celkweekfles, en incubeert u de flessen bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder na twee dagen het supernatant en het celdebris, en voed de cellen met 25 milliliter vers celkweekmedium. Wanneer de cellen confluent zijn, isoleert u de NG2-positieve fractie via magnetische celseparatie, volgens standaardprotocollen.Zaai vervolgens 4 x 10³ NG2-positieve cellen per vierkante centimeter in een passende kweekfles en plaats de fles in de celkweekincubator. Wanneer de cellen een confluentie van 90 tot 100% bereiken, wordt het supernatant geoogst en worden de adherente cellen twee keer gewassen met PBS. Detacheer de cellen met het juiste volume trypsine, afhankelijk van de flesgrootte, en stop de reactie na vijf minuten met het gereserveerde supernatant.Resuspendeer de cellen voorzichtig, breng de celsuspensie vervolgens over naar een conische buis van passende grootte voor centrifugatie en zaai de cellen opnieuw uit bij een dichtheid van 4 × 10³ cellen per cm².Zaai na vier tot vijf passages de kPSC's uit in een zeswellsplaat met een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per 2 mL medium per well, en zaai 5 × 10⁵ proximale tubulaire epitheelcellen uit in 2 mL medium voor proximale tubulaire epitheelcellen per well in een aparte zeswellsplaat. Plaats beide platen gedurende 48 uur in de celkweekincubator, oogst aan het einde van de incubatie het supernatant van de kPSC-cellen, verwijder vervolgens het supernatant van de proximale tubulaire epitheelcellen en gebruik een gele pipetpunt om een kras te maken in de cellaag op de bodem van elke well. Was de gekraste cellen met PBS en voeg het geconditioneerde medium van de niervasculaire stromale celkweken toe.Beeld vervolgens de kras na vier, acht, 12 en 24 uur af op dezelfde gemarkeerde positie met een inverted brightfield-microscoop om het percentage sluiting in de loop van de tijd te beoordelen. Perivasculaire stromale cellen van de nier zijn plastic-adherente, spoelvormige cellen die positief zijn voor stromale en perivasculaire celmarkers, en negatief voor de markers CD31, CD34, CD45 en HLA-DR. Doorgaans kan een homogene populatie perivasculaire stromale niercellen worden bereikt bij passage vier, waarbij de cellen rond passage negen tot 10 senescentie bereiken.In deze representatieve wound scratch assay om de functionele capaciteit van de kPSCs te beoordelen, sloot de wond significant sneller wanneer geconditioneerd medium van een nier-perivasculaire stromale celcultuur werd toegevoegd dan in wells die waren gekweekt met het controlemedium. Zodra de primaire isolatietechniek beheerst is en ongeveer twee uur in beslag neemt, zal het één tot twee maanden duren om een homogene kPSC-populatie te genereren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de behandeling met collagenase te stoppen zodra de nier zacht wordt en de vloeistoffen minder transparant worden.Naast de hier gedemonstreerde procedures kunnen deze technieken ook worden gebruikt voor de isolatie van perivasculaire stromale cellen uit andere solide organen. De kPSCs die met deze techniek worden geïsoleerd, kunnen worden gebruikt om het regeneratieve potentieel van deze cellen te bestuderen in verschillende modellen van nierziekten en transplantatie. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om kPSCs op klinische wijze te isoleren en te kweken.Vergeet niet dat het werken met menselijk materiaal het risico op virusoverdracht met zich meebrengt; neem altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het testen op HIV, hepatitis B en hepatitis C, bij het uitvoeren van deze procedure.

a-novel-clinical-grade-isolation-method-for-human-kidney-perivascular

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

In this video, we demonstrate the steps to isolate and purify renal tubular epithelial cells for a wide range of molecular biology and cell culture studies.

Murine Renal Cell Isolation: A Technique to Isolate and Generate Primary Culture of Renal Tubular Epithelial Cells

Dit protocol beschrijft de decellularisatie van Sprague Dawley rattennieren door antegrade perfusie van detergenten door het vaatstelsel, waardoor acellulaire nier extracellulaire matrices ontstaan die dienen als sjablonen voor herbevolking met menselijke nier epitheliale cellen. Recellularisatie en het gebruik van de resazurin perfusie assay om groei te monitoren wordt uitgevoerd binnen speciaal ontworpen perfusie bioreactoren.

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

Technieken die betrouwbaar en efficiënt zijn voor het isoleren van immuuncellen in de nieren zijn nodig voor downstream-toepassingen. Dit vereist oppervlakte-antilichaammarkering van een klein aantal immuuncellen in de nieren. Hierin beschrijven we een beknopte methode voor het isoleren van immuuncellen in de nieren die schijnbaar dit doel bereikt.

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Weefsel-engineered renale constructies bieden een oplossing voor het tekort aan organen en de schadelijke effecten van dialyse. Hier beschrijven we een protocol bij micro ontleden lymfkliertest nieren voor isolatie van cortico-Wallenberg segmenten. Deze segmenten zijn steiger-vrije cellulaire constructies, vorming van renale organoids ingeplant.

Microdissection van primaire renale weefsel segmenten en integratie met nieuwe steiger-vrije constructie technologie

De belangrijkste focus van dit protocol is efficiënt isoleren levensvatbare primaire glomeruli culturen met minimale contaminanten voor gebruik in een verscheidenheid van downstream toepassingen. De geïsoleerde glomeruli structurele relaties tussen component celtypes behouden en kunnen gekweekte ex vivo voor een korte tijd.

Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten

Hier wordt een chemisch gedefinieerd protocol gepresenteerd voor de afleiding van menselijke nierpodocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen met een hoge efficiëntie (&gt;90%) en onafhankelijk van genetische manipulaties of subpopulatieselectie. Dit protocol produceert het gewenste celtype binnen 26 dagen en kan nuttig zijn voor nefrotoxiciteitstests en ziektemodellering.

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

Hier wordt een protocol gepresenteerd om een gepersonaliseerd orgaan-op-een-chip-systeem te ontwikkelen dat de structuur en functie van de nierglomerulaire filtratiebarrière samenvat door genetisch gematchte epitheel- en vasculaire endotheelcellen te integreren die zijn gedifferentieerd van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit bio-technische systeem kan nierprecisiegeneeskunde en aanverwante toepassingen bevorderen.

Isogene nierglomeruluschip ontworpen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.

Stromale celisolatie van hematopoëtische organen

We presenteren een geoptimaliseerd protocol voor het verwerken van hele menselijke nieren om primaire renale proximale tubulule-epitheelcellen te isoleren en te kweken en de toepassing van deze cellen in een driedimensionaal, microfluïdisch, microfysiologisch platform om de proximale niertubulus te recapituleren.

Isolatie van primaire menselijke proximale tubule-epitheelcellen en hun gebruik bij het maken van een microfysiologisch model van de proximale niertubuli

Deze studie ontwikkelde een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van muizen mesangiale cellen (MC's) en hun ex vivo celcultuur. Deze cellen kunnen meerdere keren worden gepasseerd, ingevroren, nieuw leven ingeblazen en gekweekt zonder de celgroei of eiwitexpressie in gevaar te brengen.

Optimalisatie van isolatie en zuivering van muriene glomerulaire mesangiale cellen

Leer een klinische isolatiemethode voor nierperivasculaire stromale cellen (kPSCs) met behulp van orgaanperfusie en NG2-celverrijking. Deze techniek genereert voldoende cellen voor regeneratieve therapieën bij nierziekten.

Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

Meer video's verkennen