Inductie van Cellulaire Differentiatie en Single Cell Imaging van Vibrio parahaemolyticus Zwemmer en zwermcellen

Het algemene doel van deze methode is om cellulaire differentiatie van de bacterie Vibrio parahaemolyticus te induceren en de vorming van een populatie gedifferentieerde swarmer-cellen die gemakkelijk beschikbaar is voor eenmalige celanalyse door middel van fluorescentiemicroscopie. Deze methode zal wetenschappers helpen begrijpen hoe bacteriën de intracellulaire organisatie reguleren tijdens cellulaire differentiatie en morfogenese. Aangezien het beeldvormen van cellen binnen bacteriële gemeenschappen een uitdaging kan zijn, is het grootste voordeel van deze techniek dat het een populatie van gedifferentieerde swarmer-cellen produceert die bestaan in een enkele cel-laag, gemakkelijk beschikbaar voor analyse door middel van eenmalige celmicroscopie.

De implicaties van deze techniek reiken tot een beter begrip van hoe bacteriën veranderingen in de celcyclus, celmorfologie en intracellulaire organisatie reguleren tijdens cellulaire differentiatie. Demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien betrouwbare inductie van cellulaire differentiatie en de vorming van cellen die beschikbaar zijn voor eenmalige celanalyse moeilijk te bereiken zijn. Om de agaroplossing voor het maken van swarming platen voor te bereiden, schort u vier gram hartinfuus of H.I.agar poeder op in 100 milliliter dubbel gedestilleerd water.

Laat de H.I.agar oplossing voorzichtig koken in een magnetron, schud de fles van tijd tot tijd tot het poeder is opgelost. Autoclaveer de agaroplossing bij 121 graden Celsius gedurende 20 minuten, koel de agaroplossing af tot 60 tot 65 graden Celsius met constant roeren. De volgende stap betreft de omgang met 2, 2'Bipyridyl, dat zeer giftig is, dus handschoenen en veiligheidsbril moeten worden gedragen.

Voeg 2, 2'Bipyridyl toe tot een eindconcentratie van 50 micromolar. Voeg calciumchloride toe tot een eindconcentratie van vier millamolar. Inoculeer een kleine hoeveelheid V.parahaemolyticus cellen vanaf de rand van een enkele kolonie in 5 milliliter LB bouillon.

Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius in een schudende incubator tot het een optische dichtheid van 0,8 bij 600 nanometer bereikt. Dit duurt meestal ongeveer twee tot drie uur. Terwijl de celcultuur groeit, pipet 30 tot 35 milliliter van de uiteindelijke H.I.agar oplossing in een ronde 150 millimeter petrischaal en laat de agar stollen.

Vlak voordat u de celcultuur aanbrengt, droogt u de agarplaat rechtop met een open deksel bij 37 graden Celsius gedurende ten minste 10 minuten, of totdat eventuele vloeistofresten zijn verdwenen, maar niet langer. Breng één microliter celcultuur aan op het centrum van de H.I.agar swarming plaat en laat de vlek drogen. Verzegeld de plaat met doorzichtige plakband, zorg ervoor dat er geen luchtbellen en plooien in het plakband ontstaan.

Incubeer de plaat bij 24 graden Celsius een nacht. Dit zal resulteren in de vorming van een V.Parahaemolyticus swarm-kolonie met swarm flares die zich uitstrekken vanuit het centrum van de kolonie, zoals te zien is in deze time-lapse videoclip. De eerste stap in deze procedure is het voorbereiden van agarose glijbanen voor microscopie.

Voeg één gram agarose toe aan 100 milliliter van een 20%PBS en een 10%LB bouillon oplossing. Kook de oplossing voorzichtig in de magnetron om de agarose op te lossen en laat het vervolgens afkoelen tot 65 tot 70 graden Celsius terwijl u het mengt met een magnetische roerstaaf. Plaats een schone microscoopslide op een perfect vlakke sectie van een werktafel.

Bevestig de slide aan de tafel door beide uiteinden van de slide te bedekken met twee lagen laboratoriumlabeltape. De afstand tussen de twee stukken tape moet ongeveer drie centimeter zijn. Pipet ongeveer 250 microliters van de eerder bereide agarose oplossing op het niet-bedekte glazen oppervlak.

Plaats een tweede microscoopslide in dezelfde oriëntatie als de onderste slide erop en druk lichtjes naar beneden zodat de resterende agarose naar de zijden kan stromen. Laat de agarose een tot twee minuten stollen. Gebruik een scalpel om eventuele resterende agarose die aan de zijden van de microscoopslide is bevestigd, af te snijden.

Wanneer de agarose is gestold, trek de bovenste glazen slide langzaam van de onderste in een horizontale beweging. Verwijder langzaam het plakband van de uiteinden van de microscoopslide. De agarose slide moet zo snel mogelijk worden gebruikt, omdat deze langzaam zal beginnen uitdrogen.

Onmiddellijk voordat u de swarmer-cellen naar de microscoopslide overbrengt, gebruikt u een scalpel om het plakband van de eerder voorbereide swarmerplaat af te snijden. Tijdens het uitsnijden van de swarming agar, is het belangrijk om de snede van buiten naar binnen van de swarming kolonie te richten om te voorkomen dat de swarming flares worden verontreinigd met cellen die afkomstig zijn vanuit het midden van de kolonie. Gebruik een nieuwe scalpel om een stukje swarming agar van drie millimeter bij tien millimeter uit te snijden vanaf de buitenste rand van een swarming kolonie, zorg ervoor dat de sneden van de buitenkant van de swarming kolonierand naar het binnen van de kolonie zijn gericht.

Breng het stukje swarming agar over naar de microscoop agarose slide met de cellen gericht naar de agarose pad om de swarming cellen op de agarose pad af te drukken. Wacht ongeveer 30 seconden en verwijder vervolgens voorzichtig het agar stukje van de agarose pad. Plaats een glazen dekglas op de agarose pad waar de cellen zijn afgedrukt.

De cellen zijn nu klaar voor fluorescentiemicroscopie. Stereo-microscopie beeldvorming van een V.parahaemolyticus swarmer kolonie met toenemende vergroting toont swarm flares die zich uitstrekken vanaf de rand van de swarm kolonie. Cellen in de flares zijn gegroepeerd in mono of bilayers alleen, terwijl cellen in het midden van de swarm kolonie in meerdere lagen zijn gestapeld.

DIC microscopie beeldvorming onthulde dat de flares alleen bestaan uit een volledig gedifferentieerde populatie van swarmer-cellen, terwijl cellen uit het midden van de swarm kolonie aanzienlijk korter zijn en waarschijnlijk een mengsel van zwemmer- en swarmer-cellen vertegenwoordigen. Als bewijs van principe werden DIC en fluorescentie microscopie beeldvorming uitgevoerd op wild