Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken
June 30th, 2017
We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.
Het algemene doel van deze methodologie is om de dynamische fenotypische reacties van heterocellulaire populaties op verstoringen kwantitatief te evalueren terwijl tussen subpopulaties wordt onderscheiden. De meeste fysiologische interacties vinden plaats in de aanwezigheid van meerdere celtypen. Deze methode kan celbiologen helpen beoordelen hoe heterogene cellen reageren op identieke omgevingsdruk en hoe verschillende cellen elkaar beïnvloeden.
Deze techniek heeft verschillende voordelen, het onderscheidt tussen meerdere celtypen, het maakt gelijktijdige analyse mogelijk van subpopulaties inclusief geboorte- en sterftecijfers en morfologische dynamiek. Hoewel dit protocol kan worden gebruikt om veel biologische processen te bestuderen, zullen we de workflow demonstreren met behulp van H3255-tumorcellen en CCD19LU-fibroblastcellen behandeld met Erlotinib, een chemotherapeutisch medicijn. Om te beginnen, nadat de celsuspensies volgens het tekstprotocol in buisjes zijn bereid, draai de buisjes om de cellen in oplossing te mengen om het zaaien te standaardiseren.
Pipet vervolgens 10 microliter van elke celsuspensie in een microcentrifugebuisje en voeg 10 microliter trypanblauw toe. Pipet 10 microliter van de oplossing in een celtellingsplaatje en plaats het plaatje in een geautomatiseerde celteller. Herhaal de celtelling minimaal drie keer, of tot de verkregen tellingen consistent zijn.
Gebruik een meerkanaals pipetter om in totaal 1.500 cellen in 100 microliter RPMI in de putjes van een 96-wellplaat te zaaien. Plaat elke celsuspensie in drievoudige exemplaren met identieke plateopstellingen voor elk tijdstip. Bewaar de cellen een nacht lang in een incubator.
Voeg DMSO toe aan Erlotinib-poeder om een 10 millimolair Erlotinib-voorraadoplossing te maken. Gebruik vervolgens celkweekmedium om het medicijn te verdunnen tot twee keer de hoogste uiteindelijke concentratie van 10 micromolair. Verdun het medicijn vier keer serieel in een 1:10-verhouding, voor een totaal van vijf medicijnconcentraties en een controle zonder medicijn.
Pipet 100 microliter van de medicijnoplossing in de juiste putjes van de 96-wellplaat van cellen voor een uiteindelijke medicijnconcentratie van 1x verdund in medium. Bereid vervolgens vijf microgram per milliliter nucleaire kleurstof en vijf micromolair dode celkleurstof in PBS voor om de cellen te kleuren voor fluorescentie-gebaseerde classificatie. Voor morfologie-gebaseerde classificatie, bereid vijf microgram per milliliter nucleaire kleurstof, vijf micromolair dode celkleurstof en vijf micromolair celkleurstof in PBS voor.
Voeg 20 microliter kleurstofoplossing toe aan elk putje. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, beschermd tegen licht. Gebruik 70% ethanol om de bodem van de plaat af te vegen en plaats de plaat in de beeldvormingskamer om beelden te verkrijgen.
Klik in het tabblad instellingen onder kanaalselectie op de plusknop om de juiste kanalen toe te voegen aan het beeld. Onder layoutselectie, stel een z-stapel van testbeelden elke twee micron in, beginnend bij nul micron en eindigend bij 20 micron, om het scherpstelvlak te identificeren. Klik op momentopname onder elk kanaal om intensiteiten te evalueren en belichtingstijden te optimaliseren.
Voer hogere of lagere waarden in onder tijd zoals vereist. Kernen in cellen moeten scherp zijn om de nauwkeurigheid van de downstream analyse te garanderen. Markeer de juiste putjes op het plateschema.
Markeer vervolgens in het schema van de putjes de 25 velden die op een vergelijkbare manier moeten worden geïmagereerd. Onder experiment uitvoeren, identificeer de plaat in plaatnaam, klik vervolgens op de startknop om het beeldverwervingsprotocol uit te voeren met een 10x objectief om grijswaarden TIFF-beelden in de gekozen kanalen te genereren. Nadat de open source softwares zijn geïnstalleerd, CellProfiler en CellProfiler-analyse, opent u CellProfiler, klikt u op Bestand, Importeren, Pijplijn uit bestand en selecteert u het juiste bestand.
Selecteer de op fluorescentie gebaseerde classificatiepijplijn om cellen te classificeren als H3255 of CCD19LU op basis van EGFP-intensiteit en om morfologische kenmerken te berekenen. Klik op Bekijk uitvoerinstellingen en selecteer vervolgens de locatie van de beeldbestanden voor analyse en de bestemming voor de geëxtraheerde gegevens. Voordat de analyse wordt uitgevoerd, moet het protocol in testmodus worden getest om de parameterwaarden te controleren.
Het is belangrijk dat nucleaire en cellulaire segmentatie nauwkeurig zijn. Dit protocol is ontworpen om cellen met variërende nucleaire kleurstof te identificeren, zorg ervoor dat de pixelwaarde waarmee de kernen worden uitgebreid, groot genoeg is om de kernen met de hoogste DNA-kleuring te maskeren, maar klein genoeg om omringende kernen niet te maskeren. Om populaties op basis van fluorescentie te classificeren, schaal eerst het GFP-intensiteitsbereik opnieuw, meet vervolgens de GFP-intensiteit van elk geïdentificeerde nucleair en classificeer objecten op basis van een door de gebruiker gedefinieerde drempel.
Klik vervolgens op afbeeldingen analyseren om met de analyse te beginnen. Wanneer de analyse is voltooid, gaat u naar de standaarduitvoermap om de berekende gegevens te bekijken. Voor morfologie-gebaseerde classificatie, voer het juiste protocol uit in de celprofiler om hele celmorfologiekenmerken te genereren.
Open de Cell Profiler Analysis-software, selecteer het database-eigenschappenbestand dat in Cell Profiler is gegenereerd en klik op openen. Klik op het tabblad Classifier linksbovenin op het scherm. Om willekeurige celbeelden uit het experiment op te halen, klikt u op ophalen, de afbeeldingen verschijnen in het ongeclassificeerde venster.
Classificeer cellen handmatig als positief of negatief, wat hier H3255 of CCD19LU vertegenwoordigt, door cellen te selecteren en naar de juiste map te slepen. Nadat ten minste 50 cellen per subpopulatie zijn geclassificeerd, klikt u op Classifier trainen en klikt u vervolgens op Voortgang controleren. Klik ten slotte op Alles scoren om een tabel met celtellingen voor elke subpopulatie te genereren.
In een heterocellulaire koude cultuur van H3255-tumor en CCD1
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor het onderzoeken van heterocellulaire populatiedynamiek als reactie op verstoringen. De methodologie maakt gebruik van een beeldvormingsplatform om kwantitatieve datasets te genereren voor de karakterisering van meerdere cellulaire fenotipen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
- Populatiedynamiek
Achtergrond
- Fysiologische interacties komen vaak voor tussen meerdere celtypen.
- Het begrijpen hoe heterogene cellen reageren op omgevingsdruk is cruciaal.
- Deze methode maakt de beoordeling van interacties tussen verschillende celpopulaties mogelijk.
- Het kan worden toegepast op verschillende biologische processen.
Doel van het onderzoek
- Om dynamische fenotypische reacties van heterocellulaire populaties kwantitatief te evalueren.
- Om tussen subpopulaties onder identieke omstandigheden te discrimineren.
- Om de workflow te demonstreren met specifieke celtypen en behandelingen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van celsuspensies en standaardisatie van het zaaien.
- Gebruik van trypanblauw voor celtelling en geautomatiseerde analyse.
- Geneesmiddelbehandeling met Erlotinib en fluorescentiekleuring voor classificatie.
- Beeldverwerving en analyse met behulp van CellProfiler-software.
Belangrijkste resultaten
- Hoge concordantie tussen fluorescentie- en morfologie-gebaseerde methodologieën.
- Classificatie nauwkeurigheid van 97,4% en 92,5% voor onbehandelde en behandelde populaties, respectievelijk.
- Succesvolle identificatie en segmentatie van celkernen op basis van kleuring.
Conclusies
- Het protocol discrimineert effectief tussen meerdere celtypen.
- Het maakt gelijktijdige analyse van subpopulaties mogelijk, inclusief geboorte- en sterftecijfers.
- Deze methodologie kan worden aangepast voor verschillende biologische studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively dissect heterogeneous cell population responses to drug perturbations, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology and stromal-tumor interaction studies. By distinguishing subpopulations via fluorescence or morphology, it provides predictive confidence in compound effects on specific cellular compartments, informing go/no-go decisions in early discovery. The approach reduces assay variability and reagent consumption while increasing throughput for phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying subpopulation-specific responses to perturbations.
- Operational Value: Discriminates between cell types using fluorescence intensity or morphology, clarifying pathway contributions in co-culture systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential drug effects on tumor versus stromal compartments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts including morphology changes, proliferation, and apoptosis for each subpopulation.
- Operational Value: Standardizes seeding and staining protocols to ensure reproducibility across wells and time points.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and automated imaging for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase phenotypic responses to preclinical validation by tracking birth/death rates and morphological dynamics.
- Mechanistic De-risking: Isolates stromal influence on tumor progression, reducing ambiguity in target mechanism interpretation.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of imaging-based morphology shifts with functional outcomes for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing subpopulation-resolved data that informs mechanistic understanding and compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how heterogeneous cells respond to identical environmental pressures and influence one another.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized cell counting, drug dilution, and staining protocols that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Outputs segmentation, classification, and feature extraction data (nuclei area, cellular area, death rates) that allow teams to compare conditions quantitatively.
- Translational Research: Connects early phenotypic responses to stromal-tumor interactions, informing preclinical models of cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline applicable to diverse co-culture systems and perturbation types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through deconvolution of mixed population responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced reagent use versus traditional assays.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by revealing cytotoxic/cytostatic effects on specific subpopulations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on differential effects in tumor and stromal compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and CellProfiler pipeline configuration.
- Dependent on automated imaging hardware capable of z-stack acquisition and multi-channel fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and classification thresholds for fluorescence or morphology-based methods.
- Adaptation to new model systems may require optimization of nuclear/cellular segmentation parameters and classifier training.
- Practical limitations include challenges in identifying populations with complex morphological features, necessitating troubleshooting as noted in the protocol.
