Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken
30 juni 2017
We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.
Het algemene doel van deze methodologie is om de dynamische fenotypische reacties van heterocellulaire populaties op verstoringen kwantitatief te evalueren terwijl tussen subpopulaties wordt onderscheiden. De meeste fysiologische interacties vinden plaats in de aanwezigheid van meerdere celtypen. Deze methode kan celbiologen helpen beoordelen hoe heterogene cellen reageren op identieke omgevingsdruk en hoe verschillende cellen elkaar beïnvloeden.
Deze techniek heeft verschillende voordelen, het onderscheidt tussen meerdere celtypen, het maakt gelijktijdige analyse mogelijk van subpopulaties inclusief geboorte- en sterftecijfers en morfologische dynamiek. Hoewel dit protocol kan worden gebruikt om veel biologische processen te bestuderen, zullen we de workflow demonstreren met behulp van H3255-tumorcellen en CCD19LU-fibroblastcellen behandeld met Erlotinib, een chemotherapeutisch medicijn. Om te beginnen, nadat de celsuspensies volgens het tekstprotocol in buisjes zijn bereid, draai de buisjes om de cellen in oplossing te mengen om het zaaien te standaardiseren.
Pipet vervolgens 10 microliter van elke celsuspensie in een microcentrifugebuisje en voeg 10 microliter trypanblauw toe. Pipet 10 microliter van de oplossing in een celtellingsplaatje en plaats het plaatje in een geautomatiseerde celteller. Herhaal de celtelling minimaal drie keer, of tot de verkregen tellingen consistent zijn.
Gebruik een meerkanaals pipetter om in totaal 1.500 cellen in 100 microliter RPMI in de putjes van een 96-wellplaat te zaaien. Plaat elke celsuspensie in drievoudige exemplaren met identieke plateopstellingen voor elk tijdstip. Bewaar de cellen een nacht lang in een incubator.
Voeg DMSO toe aan Erlotinib-poeder om een 10 millimolair Erlotinib-voorraadoplossing te maken. Gebruik vervolgens celkweekmedium om het medicijn te verdunnen tot twee keer de hoogste uiteindelijke concentratie van 10 micromolair. Verdun het medicijn vier keer serieel in een 1:10-verhouding, voor een totaal van vijf medicijnconcentraties en een controle zonder medicijn.
Pipet 100 microliter van de medicijnoplossing in de juiste putjes van de 96-wellplaat van cellen voor een uiteindelijke medicijnconcentratie van 1x verdund in medium. Bereid vervolgens vijf microgram per milliliter nucleaire kleurstof en vijf micromolair dode celkleurstof in PBS voor om de cellen te kleuren voor fluorescentie-gebaseerde classificatie. Voor morfologie-gebaseerde classificatie, bereid vijf microgram per milliliter nucleaire kleurstof, vijf micromolair dode celkleurstof en vijf micromolair celkleurstof in PBS voor.
Voeg 20 microliter kleurstofoplossing toe aan elk putje. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, beschermd tegen licht. Gebruik 70% ethanol om de bodem van de plaat af te vegen en plaats de plaat in de beeldvormingskamer om beelden te verkrijgen.
Klik in het tabblad instellingen onder kanaalselectie op de plusknop om de juiste kanalen toe te voegen aan het beeld. Onder layoutselectie, stel een z-stapel van testbeelden elke twee micron in, beginnend bij nul micron en eindigend bij 20 micron, om het scherpstelvlak te identificeren. Klik op momentopname onder elk kanaal om intensiteiten te evalueren en belichtingstijden te optimaliseren.
Voer hogere of lagere waarden in onder tijd zoals vereist. Kernen in cellen moeten scherp zijn om de nauwkeurigheid van de downstream analyse te garanderen. Markeer de juiste putjes op het plateschema.
Markeer vervolgens in het schema van de putjes de 25 velden die op een vergelijkbare manier moeten worden geïmagereerd. Onder experiment uitvoeren, identificeer de plaat in plaatnaam, klik vervolgens op de startknop om het beeldverwervingsprotocol uit te voeren met een 10x objectief om grijswaarden TIFF-beelden in de gekozen kanalen te genereren. Nadat de open source softwares zijn geïnstalleerd, CellProfiler en CellProfiler-analyse, opent u CellProfiler, klikt u op Bestand, Importeren, Pijplijn uit bestand en selecteert u het juiste bestand.
Selecteer de op fluorescentie gebaseerde classificatiepijplijn om cellen te classificeren als H3255 of CCD19LU op basis van EGFP-intensiteit en om morfologische kenmerken te berekenen. Klik op Bekijk uitvoerinstellingen en selecteer vervolgens de locatie van de beeldbestanden voor analyse en de bestemming voor de geëxtraheerde gegevens. Voordat de analyse wordt uitgevoerd, moet het protocol in testmodus worden getest om de parameterwaarden te controleren.
Het is belangrijk dat nucleaire en cellulaire segmentatie nauwkeurig zijn. Dit protocol is ontworpen om cellen met variërende nucleaire kleurstof te identificeren, zorg ervoor dat de pixelwaarde waarmee de kernen worden uitgebreid, groot genoeg is om de kernen met de hoogste DNA-kleuring te maskeren, maar klein genoeg om omringende kernen niet te maskeren. Om populaties op basis van fluorescentie te classificeren, schaal eerst het GFP-intensiteitsbereik opnieuw, meet vervolgens de GFP-intensiteit van elk geïdentificeerde nucleair en classificeer objecten op basis van een door de gebruiker gedefinieerde drempel.
Klik vervolgens op afbeeldingen analyseren om met de analyse te beginnen. Wanneer de analyse is voltooid, gaat u naar de standaarduitvoermap om de berekende gegevens te bekijken. Voor morfologie-gebaseerde classificatie, voer het juiste protocol uit in de celprofiler om hele celmorfologiekenmerken te genereren.
Open de Cell Profiler Analysis-software, selecteer het database-eigenschappenbestand dat in Cell Profiler is gegenereerd en klik op openen. Klik op het tabblad Classifier linksbovenin op het scherm. Om willekeurige celbeelden uit het experiment op te halen, klikt u op ophalen, de afbeeldingen verschijnen in het ongeclassificeerde venster.
Classificeer cellen handmatig als positief of negatief, wat hier H3255 of CCD19LU vertegenwoordigt, door cellen te selecteren en naar de juiste map te slepen. Nadat ten minste 50 cellen per subpopulatie zijn geclassificeerd, klikt u op Classifier trainen en klikt u vervolgens op Voortgang controleren. Klik ten slotte op Alles scoren om een tabel met celtellingen voor elke subpopulatie te genereren.
In een heterocellulaire koude cultuur van H3255-tumor en CCD1
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor het onderzoeken van heterocellulaire populatiedynamiek als reactie op perturbaties. De methodologie maakt gebruik van een op beeldvorming gebaseerd platform om kwantitatieve datasets te genereren voor de karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
- Populatiedynamiek
Achtergrond
- Fysiologische interacties vinden vaak plaats tussen meerdere celtypen.
- Het is cruciaal om te begrijpen hoe heterogene cellen reageren op omgevingsfactoren.
- Deze methode maakt het mogelijk om interacties tussen verschillende celpopulaties te beoordelen.
- Het kan worden toegepast op diverse biologische processen.
Doel van de studie
- Om dynamische fenotypische responsen van heterocellulaire populaties kwantitatief te evalueren.
- Om onderscheid te maken tussen subpopulaties onder identieke omstandigheden.
- Om de workflow te demonstreren met behulp van specifieke celtypen en behandelingen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van celsuspensies en standaardisatie van het uitplaten.
- Gebruik van trypaanblauw voor celtelling en geautomatiseerde analyse.
- Medicamenteuze behandeling met Erlotinib en fluorescentiekleuring voor classificatie.
- Beeldacquisitie en analyse met behulp van CellProfiler-software.
Belangrijkste resultaten
- Hoge concordantie tussen methodologieën op basis van fluorescentie en morfologie.
- Classificatienauwkeurigheid van 97,4% en 92,5% voor respectievelijk onbehandelde en behandelde populaties.
- Succesvolle identificatie en segmentatie van celkernen op basis van kleuring.
Conclusies
- Het protocol maakt effectief onderscheid tussen meerdere celtypen.
- Het maakt simultane analyse van subpopulaties mogelijk, inclusief geboorte- en sterftecijfers.
- Deze methodologie kan worden aangepast voor diverse biologische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol stelt biopharma R&D-teams in staat om de responsen van heterogene celpopulaties op geneesmiddelperturbaties kwantitatief te ontleden, wat targetvalidatie en mechanische risicoreductie ondersteunt bij oncologie- en stroma-tumorinteractiestudies. Door subpopulaties te onderscheiden via fluorescentie of morfologie, biedt het voorspellende zekerheid over de effecten van verbindingen op specifieke cellulaire compartimenten, wat go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase onderbouwt. De aanpak vermindert de assay-variabiliteit en het reagentiaverbruik, terwijl de doorvoer voor fenotypische screeningscampagnes wordt verhoogd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door subpopulatie-specifieke reacties op perturbaties te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt onderscheid tussen celtypen op basis van fluorescentie-intensiteit of morfologie, wat de bijdragen van signaalpaden in co-culturesystemen verduidelijkt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door differentiële drug-effecten op tumorcompartimenten versus stromale compartimenten te onthullen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fenotypische resultaten, waaronder morfologische veranderingen, proliferatie en apoptose voor elke subpopulatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de protocollen voor het uitplaten en kleuren om reproduceerbaarheid tussen wells en tijdspunten te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met 96-wells plaatformaten en geautomatiseerde imaging voor medium-throughput screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt fenotypische responsen in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door het volgen van geboorte-/sterftecijfers en morfologische dynamiek.
- Mechanistische risicoreductie: Isoleert de stromale invloed op tumorprogressie, waardoor ambiguïteit bij de interpretatie van het doelmechanisme wordt verminderd.
- Afstemming van biomarkers: Maakt correlatie mogelijk tussen op beeldvorming gebaseerde morfologische verschuivingen en functionele uitkomsten voor translationele relevantie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot leadidentificatie, en levert gegevens op subpopulatieniveau die bijdragen aan het mechanistische begrip en de prioritering van verbindingen vóór preklinische investeringen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door te kwantificeren hoe heterogene cellen reageren op identieke omgevingsdruk en elkaar beïnvloeden.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde protocollen voor celtelling, drugverdunning en kleuring, waardoor een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk wordt.
- Analytics: Levert gegevens over segmentatie, classificatie en kenmerkextractie (kernoppervlak, cellulair oppervlak, sterftecijfers) waarmee teams condities kwantitatief kunnen vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt vroege fenotypische responsen met stroma-tumorinteracties, wat bijdraagt aan preklinische modellen van kankerprogressie.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare imaging- en analysepipeline die toepasbaar is op diverse co-culturesystemen en typen perturbatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Predictieve betrouwbaarheid bij targetvalidatie door deconvolutie van responsen uit gemengde populaties.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en verminderd reagensgebruik vergeleken met traditionele assays.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het onthullen van cytotoxische/cytostatische effecten op specifieke subpopulaties.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van differentiële effecten in tumor- en stromale compartimenten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie, beeldanalyse en de configuratie van CellProfiler-pipelines.
- Afhankelijk van geautomatiseerde imaging-hardware die in staat is tot z-stack acquisitie en multichannel fluorescentiedetectie.
- Vereist standaardisatie van kleuringsprotocollen en classificatiedrempels tussen teams voor methoden gebaseerd op fluorescentie of morfologie.
- Aanpassing aan nieuwe modelsystemen kan optimalisatie van parameters voor nucleaire/cellulaire segmentatie en training van de classifier vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten uitdagingen bij het identificeren van populaties met complexe morfologische kenmerken, wat probleemoplossing vereist zoals vermeld in het protocol.
