Name: In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Ontdek in vitro-analyses voor het bestuderen van bloed-hersenbarrière-integriteit en netwerkverstoring met celkweektechnieken. Deze methode helpt onderzoekers mechanismen van neurologische ziekten te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Leon Tai wordt gefinancierd door University of Illinois Chicago start-up fondsen.

Alle experimenten volgen de protocols van de Universiteit van Illinois, Chicago Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Algemene Voorbereiding OPMERKING: De microvasculaire endotheliale cellijn van de hersenen (hCMEC / D3) is een extensief gekenmerkt immortalized human BEC lijn 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Cultuur de hCMEC / D3-cellen op weefselkweekflessen gecoat met collageen Type I (kalfhuid, 1:20 verdunning van 0,1% oplossing in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) die Ca 2+ en Mg 2+ bevat ) in basaal Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) bevattende 2-5% foetale boviene serum (FBS), 10% ascorbinezuur, 10% gentamicinesulfaat, 25% hydrocortison en 1/4 van het totale volume van de toegevoerde groeifactor supplementen per 500 ml media [ Vaat endothelium grOvth-factor (VEGF), epidermale groeifactor (EGF), insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) en humane basis fibroblastische groeifactor (bFGF), zie tabel van materialen ]. OPMERKING: EBM-2 medium met FBS en groeifactoren wordt aangeduid als &quot;EBM-2 compleet&quot;. EBM-2 zonder FBS en supplementen wordt aangeduid als &quot;EBM-2 basaal&quot;. Bij volledige confluentie zijn de hCMEC / D3 cellen ~ 1 x 10 5 cellen / cm 2 . <ol><li> Passage de hCMEC / D3 cellen in een verhouding van 1: 5 door eerst gedurende 3 minuten met HBSS te incuberen zonder Ca 2+ en Mg 2+, gevolgd door afscheiding met 5 ml trypsine / EDTA (0,25%) gedurende 5 minuten. Neutraliseer de trypsine met behulp van EBM-2 compleet (1: 1 neutralisatie) en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C; Weggooi de supernatant. Resuspendeer de pellet in EBM-2 compleet en herplatteer bij een verhouding van 1: 5. </li><li> Cultuur de primaire menselijke pericytes en astrocyten volgens het protocol van de leverancier [ Lijst van stoffen ]. CulturE de pericytes in pericyte basaal medium met FBS en pericyte groei supplement. </li><li> Cultuur de menselijke astrocyten in astrocytemedium die astrocytegroei factoren bevatten. Cultuur zowel de pericytes als de astrocyten in weefselkweekflessen bekleed met 3 ml poly-L-lysine (PLL) voor celadhesie en gebruik de cellen tussen de passages 2 en 5. </li><li> Euthanize 7 muizen en verwijder de hersenstengels en cerebella met tang; Verwijder de meninges door de hersenen zorgvuldig te rollen op gaas. Knip het resterende hersenweefsel in een Petri schotel in Minimal Essential Medium (MEM) met HEPES (5 ml per hersen) met een steriel scheermesje. Isoleer de primaire muis-BEC&#39;s uit 2 maanden oude C57BL / 6J-muizen volgens het beschreven protocol 20 . </li><li> Breng het gehakte hersenweefsel over in een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en incubeer het weefsel in een papain (833,33 μL per hersen) en DNase (41,7 μL per hersen)Oplossing, in een 37 ° C waterbad gedurende 1 uur, om het weefsel te verteren. </li><li> Triturateer het homogenaat sequentieel door middel van 19 en 21 gauge naalden, meng bij een verhouding van 1: 1 met een 22% Bovine Serum Albumin (BSA) oplossing en centrifugeer bij 1360 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de resulterende pellet in 1 ml EBM-2 compleet en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer opnieuw in 1 ml EBM-2 en vul de cellen (1 ml / putje) op 6-putjes platen bedekt met collageen (~ 1 brein per putje). </li><li> Vervang de media 24 uur later met EBM-2 compleet met 4 μg / ml puromycine hydrochloride; Vervang met EBM-2 compleet na 2 dagen. De primaire BEC&#39;s worden gekweekt als voor de hCMEC / D3-cellen en zijn bij volledige confluentie bij 1 x 105 cellen / cm2. </li><li> Bereid een 100 μM oAβ, 24 uur voor de test op. OPMERKING: oAβ wordt beschouwd als de ziekte relevante vorm van A. Voor oAβ, gebruik de goed gekarakteriseerde preparaten beschreven door DahlgreN et al. 21 . </li><li> Ontdooi de keldermembraan voorraadoplossing &#39;s nachts bij 4 ° C en evenwijd in steriele PCR buisstrips (8 buizen) bij 140 μl keldermembraan per buis. Bevestig elke strip en berg bij -20 ° C. Doe één strip per 96-putjesplaat op 4 ° C, 24 uur voor de test. Pre-afkoel de pipet tips om stolling te vermijden. OPMERKING: Alle afhandeling van de basismembraanmatrix moet op ijs worden uitgevoerd om snelle stolling te vermijden. Aangezien 10 μl per putje keldermembraan op de dag van de test gebruikt wordt, is elke strip voldoende voor een 96-putjesplaat. </li><li> Incubeer volledig confluente BEC&#39;s in EBM-2 basaal, 24 uur voorafgaand aan de test. OPMERKING: De reden is: EBM-2 compleet bevat aangevulde factoren en FBS met als doel de optimale celgroei te bevorderen; Echter, dezelfde moleculaire trajecten die celgroei bevorderen, zijn ook belangrijk voor de dekking van de endotheelcel en de dynamiek van de hersenen, zowel in aanwezigheid als in abseNce van een stressor. Daarom verhogen serum en supplement de BEC&#39;s om het confounding effect van de resterende activatie van cellulaire signaalwegen te verminderen. Van de notitie worden de cellen kort (5 min) blootgesteld aan FBS tijdens de neutralisatie van getriptineerde cellen voorafgaand aan de test. In tegenstelling tot BEC&#39;s zijn de pericytes en astrocyten niet gehongerd aan het serum, door de eis van verschillende factoren voor groei en de relatieve instabiliteit van deze celtypes in reactie op serumhongersnood (Tai laboratorium, ongepubliceerde waarnemingen). OPMERKING: EBM-2 basaal wordt gebruikt tijdens de analyse voor de single en triple cultuur meshwork formatie en ontwrichting assays. Dit is van cruciaal belang om te voorkomen dat de stressor of de behandelingsafhankelijke signalering confronteren. </li></ol> 2. Meshwork-achtige Formation and Disruption Assays <ol><li> Enkele BEC-kweekassays: OPMERKING: Drie verschillende paradigma&#39;s voor de enkele culturen van BEC&#39;s worden getoond in Figuur 1A </strong&gt;. Elk paradigma is ontworpen om de respons van BEC&#39;s te beoordelen in verschillende modellen van vaartuigdekking. Paradigma 1 is een netwerkvorming. Dit paradigma is ontworpen om de effecten van stressoren en / of behandelingen op angiogenese en meshworkvorming te onderzoeken. BEC&#39;s, oAβ en behandelingen worden allemaal toegevoegd aan de plaat op het 0 h tijdspunt. Paradigm 2 is het voorkomen van meshwork verstoring. Cellen worden geplateerd in aanwezigheid van een groeifactor of geneesmiddel en gedurende 4 uur geïncubeerd om meshwork-achtige structuren te vormen. Een stressor, oAp in dit geval, wordt na 4 uur toegevoegd. Dit paradigma beoordeelt het vermogen van een behandeling om stress-geïnduceerde schade te voorkomen op voorgevormde meshwork-achtige structuren. Paradigm 3 is gelijktijdige behandeling van meshwork verstoring. Cellen worden geplateerd en mogen gedurende 4 uur meshwerk-achtige structuren vormen. Behandelingen en oAβ worden vervolgens gelijktijdig toegevoegd op het 4 h tijdspunt, waarbij de capaciteit van het voorgevormde celnetwerk wordt beoordeeld om te reageren op verschillende behandelingen. Alle paradigma&#39;s voorLaat dezelfde gemeenschappelijke stappen zien, behalve met verschillen in de timing van de toevoeging van de behandeling. <ol><li> Op de dag van de test pipetteert u de membraanmatrix van de kelder bij 10 μl / putje in de bodem van 96-putjes platen en laat u gedurende 1 uur bij 37 ° C instellen. </li><li> Suspenseer de gelyofiliseerde groene cel tracking kleurstof (zie Tabel van Materialen ) in 10 μL DMSO om een ​​10 mM voorraadoplossing te genereren en verdund tot 10 μM (1: 1000) in EBM-2 basaal. Verwijder het medium uit de volledig samenvloeiende fles en vervang met EBM-2 basaal die de groene celvolgorde bevat (5 ml voor een 75 cm 2 fles). Preload BEC&#39;s met de groene cel tracking kleurstof, 20 minuten voorafgaand aan het begin van de test. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 20-30 minuten bij 37 ° C, verwijder het medium met cell tracking kleurstof en los de cellen zoals beschreven in stap 1.1. Neutraliseer de media met EBM-2 die 10% FBS bevat en centrifugeer bij 240 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resulteer de pellet in 1 ml EBM-2 basaal. </li><li> Plateer de BEC&#39;s in de 96-putjesplaat bij 10.000 cellen / put in EBM-2 basaal (0 uur tijdspunt in alle paradigma&#39;s). OPMERKING: Afhankelijk van het paradigma dat wordt gebruikt, worden behandelingen, stressors of voertuigcontroles op de aangegeven tijdstippen toegevoegd. In alle paradigma&#39;s wordt het medium geoogst voor latere analyse ( bijv. ELISA-analyse) en cellen worden 24 uur vastgemaakt met vers bereid 4% paraformaldehyde in fosfaatbufferde serum (PBS). Als een alternatieve aanpak om de term effecten van oAβ op maasvorming te bepalen, kan het protocol worden aangepast om samenvloeiende celkweekflessen met oAβ te incuberen en vervolgens de maaswerkvormingsparadigma&#39;s (+/- oAβ) uit te voeren. OPMERKING: Het uiteindelijke volume in elke put voor alle paradigma&#39;s bedraagt ​​70 μL. Alle behandelingen (oAβ, EGF, enz. ) Worden aan hun respectieve putjes toegevoegd bij een verdunning van 1:20, dwz 3,5 μl per behandeling. Voor Paradigm 1 worden de cellen toegevoegd in een cel suspensie oplossing bij 63 μl / well. Onmiddellijk oAp, gewenste behandelingen en controles worden toegevoegd bij 3,5 μl / putje elk, waardoor in totaal 70 μl wordt verkregen. Voor Paradigm 2 worden 63 μl cel suspensie en 3,5 μl behandeling ( bijv. 100 ng / ml EGF) toegevoegd op het 0 h tijdspunt. Na 4 uur incubatie wordt 3,5 μl van een oAβ-voorraad toegevoegd ( bijv. Voor 100 nM laatste oAp-concentratie, 3,5 μl van 2 uM oAβ-voorraad). Voor Paradigm 3 wordt 63 μl cel suspensie toegevoegd op het 0 h tijdspunt en bij 4 uur worden oAp en gewenste behandelingen toegevoegd bij 3,5 μl / putje elk, waardoor in totaal 70 μl wordt verkregen. Deze volumes kunnen worden aangepast volgens de behandelingen. Bijvoorbeeld, als er maar één behandeling nodig is, kan het celsuspensievolume worden aangepast aan 66,5 μL (handhaven 10.000 cellen / putje) en het behandelingsvolume kan bij 3,5 μl blijven. </li></ol></li><li> Triple culture assay: OPMERKING: Naast de enkele cultuuranalyses van BEC&#39;s, hebben we ontwikkeldEen triple culture assay paradigma ( Figuur 1B ) uit te voeren om de respons van BEC&#39;s, pericytes en astrocyten binnen voorgevormde netwerken aan relevante stressoren te bepalen ( bijv. OAβ). BEC&#39;s worden geplateerd in aanwezigheid van gewenste behandelingen op 0 uur. Om 4 uur worden pericytes zachtjes aan de plaat toegevoegd. Om 7 uur worden astrocyten toegevoegd aan de plaat, gevolgd door de toevoeging van een stressor op 11 uur. Cellen worden vervolgens geïncubeerd tot het 24 h tijdspunt. OPMERKING: Voor de drievoudige cultuuranalyses is het belangrijk timing te overwegen om ervoor te zorgen dat alle cellen tegelijkertijd samenvloeien. Menselijke astrocyten en pericyten moeten 1 week vóór de test worden gekweekt, terwijl de hCMEC / D3-cellen 4-5 dagen vóór de testdatum moeten worden geplateerd of doorgevoerd. Verder is het belangrijk om lage passage (2-5) primaire cellen te gebruiken om fenotypische drift te vermijden. <ol><li> Voeg de werkzame oplossing van de groene celopsporing toe aan de hCMEC / D3-cellen 20 minuten voordat de test wordt gestart. Platte de hCMEC / D3 cellen op 10, 000 cellen / put in EBM-2 basaal (0 uur tijdspunt). De gebruikte hoeveelheden zijn 45 μL cel suspensie en 3,5 μl behandeling ( dwz de uiteindelijke EGF concentraties van 50 ng / mL, 100 ng / mL of 1000 ng / mL uit voorraden die 20 keer meer geconcentreerd zijn). </li><li> Na de incubatie van 3,5 uur bij 37 ° C, voeg de werkende oplossing met blauwe celopsporingskleur toe (10 μM celtracker blauw in EBM-2 basaal) aan de menselijke primaire pericytes. Voeg bij het 4 h tijdspunt (~ 30 min incubatie met cell tracking kleurstof) 2,000 pericytes / putje op de plaat die de hCMEC / D3 bevat in een volume van 6 μL / putje. </li><li> Na een extra 2,5 uur incubatie (totaal 6,5 uur vanaf 0 uur tijdspunt), voeg de werkende oplossing met oranje celopsporingsverf (10 μM celtracker oranje in EBM-2 basaal) toe aan de menselijke primaire astrocyten. Voeg bij het 7 h tijdspunt zachtjes 10.000 astrocyten / putjes toe aan de plaat in 12 μl volume. Daarom is de totale cellulaire verhouding voor endotheelcellen: pericytes: astrocyten iS 5: 1: 5. Verder is het volume op dit punt bereikt 66,5 μL. </li><li> Voeg oAβ (3,5 μL 100 μM voorraad) 4 uur later (totaal 11 uur vanaf 0 uur tijdspunt). </li><li> Zet de cellen 13 uur later in vers bereide 4% paraformaldehyde in PBS. Voorzichtigheid: Draag beschermende kleding, handschoenen en bril tijdens het hanteren van paraformaldehyde. </li></ol></li></ol> 3. Kwantificering <ol><li> Vang fluorescentiebeelden van de hele put van de 96-putjesplaat bij 1,6x vergroting met een belichtingstijd van 2 s bij maximaal 50% maximale vermogen met behulp van een dissectiemicroscoop. OPMERKING: gelijkwaardige microscopen kunnen worden gebruikt; Het is echter van cruciaal belang om de hele put vast te leggen voor uitgebreide analyse. </li><li> Voor kwantitatieve analyse verwerk de beelden met behulp van de ImageJ angiogenese analysator plugin 22 om het aantal takken, aantal mazen en totale cellengte te kwantificeren (deze uitlezingen worden automatisch door de softwa getabuleerdRe) zoals hieronder beschreven. Een gedetailleerd visueel protocol van deze stap is verschaft in figuur 2 . <ol><li> Open Fiji ImageJ door op het software icoon te klikken. </li><li> Klik op de dubbele rode voorwaartse pijlen aan het einde van de werkbalk en klik vervolgens op &quot;Angiogenesis Analyzer&quot;. </li><li> Selecteer de map met beeldbestanden, klik op &quot;Openen&quot;. </li><li> Wanneer het vak &#39;Instellingen voor analyse&#39; verschijnt, klikt u op &#39;OK&#39;. </li><li> Wanneer het vak &quot;Bewerkingsafbeeldingen&quot; verschijnt, wat het aantal beelden aangeeft dat u wilt verwerken, klikt u op &quot;OK&quot;. </li><li> Wanneer het vak &quot;Progress progress window&quot; verschijnt, die de geschatte verwerkingstijd aangeeft. Tijdens deze tijd kwantificeert het programma de uitgangen, waaronder het aantal takken, aantal mazen en totale cellengte. OPMERKING: Nadat alle beelden gekwantificeerd zijn, verschijnt het resultaatbestand in de originele afbeeldingsmap als een spreadsheetdocument. </li><li> kiezenHet spreadsheetbestand bevat resultaten en vergelijk het aantal takken, mazen en totale cellengte tussen groepen. OPMERKING: In de triple cultuuranalyse wordt ImageJ verder gebruikt om percyte / astrocyt dekking en aantal te analyseren. Beelden worden gedrempeld door een verblind experimentator en de functie &quot;analyse deeltjes&quot; die gebruikt wordt om uitlees te genereren. Vaste cellen en buisvormige structuren kunnen ook immunostained zijn voor Aβ 17 of andere markers. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).</li>
<li>Engelhardt, B., Liebner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+development+and+maintenance+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier.</a> Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19664713">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).</li>
<li>Pardridge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+protein+and+gene+medicines+through+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier.</a> Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).</li>
<li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li>
<li>Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+triggers+extensive+cerebral+angiogenesis+causing+blood+brain+barrier+permeability+and+hypervascularity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (8), e23789(2011).</li>
<li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s-related+peptide+amyloid-beta+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e39598(2012).</li>
<li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+amyloid+angiogenic+activity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo.</a> Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).</li>
<li>Paris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+angiogenesis+in+a+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).</li>
<li>Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+beds+are+decreased+in+Alzheimer%27s+disease%2C+but+not+in+Binswanger%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease.</a> Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).</li>
<li>Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vascular+Perturbations+in+an+Abeta-Injected+Animal+Model+and+in+AD+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain.</a> Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280(2011).</li>
<li>Donnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+peptides+accelerate+the+senescence+of+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%2C+impairing+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis.</a> FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).</li>
<li>Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+occludin+down-regulation+and+increased+permeability+in+human+brain+endothelial+cells+is+mediated+by+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).</li>
<li>Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-glycoprotein+and+breast+cancer+resistance+protein+restrict+apical-to-basolateral+permeability+of+human+brain+endothelium+to+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).</li>
<li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+P-glycoprotein+expression+by+the+immortalised+human+brain+endothelial+cell+line%2C+hCMEC%2FD3%2C+restricts+apical-to-basolateral+permeability+to+rhodamine+123%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123.</a> Brain Res. 1292, 14-24 (2009).</li>
<li>Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+prevents+oligomeric+amyloid-beta+induced+angiogenesis+deficits+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).</li>
<li>Dahlgren, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+and+fibrillar+species+of+amyloid-beta+peptides+differentially+affect+neuronal+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability.</a> J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).</li>
<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://image.bio.methods.free.fr/ImageJ/?Angiogenesis-Analyzer-for-ImageJ">Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li>
<li>Thomas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+prevents+APOE4+and+amyloid-beta-induced+cognitive+and+cerebrovascular+deficits+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111(2016).</li>
<li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li>
<li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroangiogenesis%3A+a+vascular+basis+for+Alzheimer%27s+disease+and+cognitive+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li>
<li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+for+senile+dementias%3A+neuroangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li>
<li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer%27s+Disease+and+Vascular+Dementia%3A+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beschreven methoden kunnen worden gebruikt om verschillende fundamentele biologische vragen aan te pakken die betrekking hebben op cerebrovasculaire dekking 24 . Specifiek kunnen zij identificeren welke receptoren en signaalwegen een rol spelen bij angiogenese, vaatdekking in kankerweefsel en perifere endotheliale cellen die relevant zijn voor de hersenen. Voorbeelden omvatten angiogene groeifactorreceptoren, stikstofoxide, mitogeen geactiveerde proteïne kinase signalering en calcium signaleri...

<html> De bloed-hersenbarrière (BBB) ​​van hersenschapsvaten is de grootste interface van bloed-tot-hersencontact en speelt een centrale rol in de homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS) 1 , 2 . Dynamische processen bij de BBB verhinderen de opname van ongewenste moleculen uit het bloed, verwijderen afvalstoffen uit het CNS, leveren essentiële voedingsstoffen en signaalmoleculen aan het CNS, en moduleren neuro-inflammatie 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-schade komt voor bij veroudering en verschillende neurodegeneratieve stoornissen waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), multiple sclerose en beroerte 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Daarom kan BBB-disfunctie een sleutelrol spelen bij neurodegeneratieve stoornissen, ook als therapeutisch doel. Het behoud van de vaartuigdekking is belangrijk voor de homeostatische functies van de BBB. In vivo en in vitro gegevensconflicten echter of de processen die bij neurodegeneratieve stoornissen betrokken zijn, een hoger of lager BBB-dekking veroorzaken 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , met name in AD. Daarom is er een sterke reden voor de ontwikkeling van in vitro modellen met behulp van relevante celtypen om de dynamiek van BBB-dekking te beoordelen en beter te begrijpen. Serebrale capillairen zijn samengesteld uit astrocyten, pericyten en hersenendotheelcellen (BEC&#39;s) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Alle celtypes dragen bij tot de functie van de BBB door middel van structurele ondersteuning en via de afscheiding van effectormoleculen zoals angiogene groeifactoren, cytokinen en chemokines die op paracrine- en autocrine-achtige wijze optreden. De belangrijkste effectorcellen van de BBB zijn echter BEC&#39;s 3 . In het algemeen zijn de celcultuurtechnieken voor het beoordelen van BBB-functie permeabiliteitsbepalingen uitgevoerd op cellen die op filterinzetten worden gegroeid, of het beoordelen van niveaus van belangrijke BEC-eiwitten, beide na de toevoeging van stressors 14 , 15 , 16 . Hoewel belangrijk, concentreren deze analyses zich niet op de cerebrovasculaire dekking. Hier zijn onze vorige methoden 17 gedetailleerd om BEC-dekking en meshwork-achtige structuren te beoordelen met behulp van enkele culturen van onsterfelijke menselijke BEC&#39;s, enkele culturen van primaire muis-BEC&#39;s en een gehumaniseerde triple cultuurModel (BEC, astrocyten en pericytes) van de BBB. Het doel was om het schadelijke effect van oAβ te demonstreren, die wordt beschouwd als een belangrijke bijdrage aan AD progressie, op BEC dekking. Het beschermende effect van de epidermale groeifactor (EGF) benadrukt het potentieel van de techniek als therapeutisch screeningsinstrument. De techniek heeft verschillende brede toepassingen voor basis- en toegepast onderzoek, waaronder: 1) het bepalen van de rol van specifieke pathways bij angiogenese en dekking van het vaatstelsel; 2) het evalueren van de effecten van ziekte- en verouderingsrelevante factoren op angiogenese en vaatbescherming; en 3) het identificeren van farmacologische targets.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cellen</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basaal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collageen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, geen fenolrood</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, geen calcium, geen magnesium, geen fenolrood</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Eindconcentraties van de SingleQuot groeifactor supplementen voor EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbinezuur</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycinesulfaat</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortison</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume van de meegeleverde groeifactoren: fibroblast groeifactor, epidermale groeifactor, insuline-achtige groeifactor, vasculaire endotheelgroeifactor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycinehydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papaïne celdissociatie systeem (papaïne en DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke periccyten</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyt basaal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyt groeisupplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke astrocyten</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyt media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyt groeisupplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basale membraan (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenese m-platen (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke epidermale groeifactor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker groen</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker oranje</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blauw</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutraal Gebufferd Formaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR buisjesstrips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissectiescoop</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière mesh-like vessel formation and disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Bloed-hersenbarrière (BBB) ​​dekking speelt een centrale rol in de homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS). De BBB wordt dynamisch onderhouden door astrocyten, pericytes en hersenendotheelcellen (BEC&#39;s). Hier worden details beschreven om BBB-dekking te beoordelen met behulp van enkele culturen van onsterfelijke menselijke BEC&#39;s, enkele culturen van primaire muis-BEC&#39;s en een gehumaniseerd triple culture-model (BEC, astrocyten en pericyten) van de BBB. Om de toepasbaarheid van de analyses op ziektetoestanden te benadrukken beschrijven we het effect van oligomere amyloïde-ß (oAβ), die een belangrijke bijdrage levert aan de ziekte van Alzheimer (AD), op BBB-dekking. Verder gebruiken we de epidermale groeifactor (EGF) om het drugscreeningspotentieel van de technieken te verlichten. Uit onze resultaten blijkt dat enkelvoudige en drievoudige gecultiveerde BEC&#39;s meshwork-achtige structuren vormen onder basale omstandigheden en dat oAβ deze celwerkvorming vormt en de voorgevormde maasstructuren ontaardt,Maar EGF blokkeert deze verstoring. Zo zijn de beschreven technieken belangrijk voor het analyseren van fundamentele en ziekte-relevante processen die de BBB-dekking moduleren.

In enkele culturen vormen zowel de hCMEC / D3-cellen ( Figuur 3A ) en de primaire muis-BEC&#39;s ( Figuur 3B ) meshwerkvormige structuren in de put. De structuren worden gekenmerkt door een netwerkwerk van onderling verbonden knooppunten ( Figuur 3 ). In alle beschreven paradigma&#39;s ( Figuur 1 ) zijn de meshwork-achtige structuren gelijk na 24 uur in de controlegroep...

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

De doelstellingen van deze assay zijn het ontleden van de rol van ziekte-relevante processen bij de verstoring van de dekking van de bloed-hersenbarrière, het identificeren van de onderliggende mechanismen en het in vitro testen van potentiële behandelingen. Deze methode kan antwoord geven op belangrijke fundamentele en toegepaste onderzoeksvragen in de vakgebieden van de bloed-hersenbarrière en neurodegeneratie. Zo kan worden vastgesteld of ziekte-relevante stressfactoren reeds gevormde netwerkstructuren verstoren en kunnen de onderliggende pathways worden geïdentificeerd. Door middel van verdere screening kunnen behandelingen worden geïdentificeerd die stress-geïnduceerde verstoring van de bloed-hersenbarrière voorkomen voor toekomstige in vivo testen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het mechanistische begrip van en de behandeling van de ziekte van Alzheimer, vanwege het belang van de homeostatische functies van de bloed-hersenbarrière voor de cognitie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de dysfunctie van de bloed-hersenbarrière bij de ziekte van Alzheimer, kan ze ook worden toegepast op andere neurodegeneratieve aandoeningen met een dysfunctie van d

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes a permeability assay to evaluate the permeability of in vitro blood-brain barrier using sodium fluorescein molecules.

Blood-Brain Barrier Mimic Permeability Assay: An In Vitro Assay to Assess the Permeability of BBB Mimic to Tracer Molecules

This video demonstrates a method for assessing transendothelial electrical resistance (TEER) in mouse brain microvascular endothelial cells in vitro. A high TEER value indicates intact endothelial cell junctions, while the addition of activated T cells lowers the TEER value, reflecting disruption of the junctional barrier.

Assessing Transendothelial Electrical Resistance in an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Hier beschrijven we een menselijk bloed-hersenbarrière model dat het mogelijk maakt om de transmigratie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken.

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Drug targeting aan tumoren van het centrale zenuwstelsel is een grote uitdaging. Hier beschrijven we een protocol om te produceren van een in vitro nabootsen van de bloed-hersen tumor-barrière lymfkliertest en/of menselijke cellen gebruiken en bespreken het belang ervan voor de voorspelbaarheid van het centrale zenuwstelsel tumor targeting in vivo.

Predicting In Vivo Payloads levering met behulp van een bloed-hersen Tumor-barrière in een schotel

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Ontdek in vitro-analyses voor het bestuderen van bloed-hersenbarrière-integriteit en netwerkverstoring met celkweektechnieken. Deze methode helpt onderzoekers mechanismen van neurologische ziekten te begrijpen.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Meer video's verkennen