Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Dit protocol is bedoeld als richtlijn voor de fabricage van zelf-geassembleerde, driedimensionale bundels van longitudinaal uitgelijnde astrocytaire somata en uitlopers binnen een hydrogel-microkolom van micronformaat, voor gebruik als in vitro neurobiologisch model of als neuroregeneratieve therapie. Trauma en neurodegeneratieve ziekten zijn bijzonder schadelijk voor patiënten vanwege de beperkte neurogene capaciteit in een inhiberende omgeving, wat regeneratie in het centrale zenuwstelsel beperkt. Engineered astrocytaire bundels pakken de beperkingen van huidige behandelstrategieën aan door te proberen belangrijke neuroanatomische kenmerken en glia-gemedieerde ontwikkelingsmechanismen te repliceren om gerichte celmigratie en axonale padvinding te bevorderen.

De architectuur van deze astrocytaire steigers is primair geïnspireerd door de uitgelijnde astrocytaire uitlopers in de gliale buizen van de rostrale migratiestroom. Begin met het bereiden van een 3% gewicht per volume agarose-oplossing en DPBS in een steriel bekerglas. Blijf verhitten en roeren om te voorkomen dat de oplossing voortijdig stolt.

Steek een acupunctuurnaald in de onderste opening van de bulbdispenser. Plaats een capillaire buis over de blootgestelde naald en bevestig beide door een deel ervan in het rubberen gedeelte van de cilinder van de bulbdispenser te steken. Sluit de cilinder af om de assemblage te voltooien.

Breng één milliliter vloeibare agarose over naar het oppervlak van een lege petrischaal. Terwijl u het rubberen dopje van de bulbdispenser dichtknijpt, steekt u één uiteinde van de capillaire buis in de agarose en laat u de druk op het dopje los om de agarose in de buis op te zuigen. Plaats de bulb, buizen en naaldenassemblages op een petrischaal en laat de agarose gedurende 5 minuten stollen in de capillaire buizen.

Trek vervolgens de naald uit de capillaire buis, terwijl de microkolom nog steeds om de naald heen blijft zitten. Gebruik de punten van een pincet om de microkolom naar het uiteinde van de naald te schuiven, houd de naald vervolgens boven een open petrischaal met DPBS en duw de microkolom in de DPBS. Om microkolom-bootjes te maken, die de latere hantering van deze constructen vergemakkelijken, begint u met het maken van een 4% gewicht-per-volume agarose-oplossing, waarbij de oplossing verwarmd en geroerd wordt.

Gebruik een pincet om een microkolom naar een lege petrischaal te verplaatsen. Gebruik vervolgens, terwijl u onder een stereoscoop werkt, een microscalpel om de microkolommen op de gewenste lengte bij te snijden, waarbij de uiteinden in een hoek van 45 graden worden afgesneden. Nadat drie extra microkolommen zijn bijgesneden, worden de vier kolommen parallel aan elkaar uitgelijnd.

Vul een pipet met 50 µL 4% agarose-oplossing en breng een lijn vloeistof aan over de microkolom-array om de constructen te verbinden en samen te voegen tot een 'boot'. Laat dit 1 tot 2 minuten afkoelen om de gelering van de 4% agarose mogelijk te maken. Gebruik vervolgens een fijne pincet om de microkolom-boot op te pakken via de verbindende agarosebrug.

En verplaats het naar een petrischaal met DPBS. Breng de microkolomhouder over naar een biologische veiligheidskast en steriliseer deze door blootstelling aan ultraviolet licht gedurende dertig minuten. Bereid in een biologische veiligheidskast een oplossing van 1 mg/mL rattenstaart type 1 collageen in co-kweekmedium.

Plaats het vervolgens op ijs. Pas de pH van de ECM-oplossing naar behoefte aan met zuur of base totdat de pH stabiel is in het bereik van 7,2 tot 7,4. Verplaats de microkolomhouder met een pincet naar een petrischaal van 35 of 60 mL.

Plaats, onder begeleiding van het stereomicroscoop, de 10 mL-tip van een micropipet aan één uiteinde van elke microkolom en zuig deze leeg om het lumen te ontdoen van DPBS en luchtbellen. Vul een P10-micropipet met de collageenoplossing. Plaats de 10 mL-tip tegen één uiteinde van elke microkolom en breng voldoende oplossing aan om het lumen te vullen.

Pipette vervolgens een reservoir ECM aan beide uiteinden van de microkolom. Wanneer alle kolommen zijn gevuld, pipetteert u cocultuurmedium in een ring rond de petrischaal om te voorkomen dat de kolommen uitdrogen. Incubeer de schaal met de microkolommen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste één uur om de polymerisatie van collageen te bevorderen voordat de cellen worden toegevoegd.

Plaats vervolgens de punt van een P10-micropipet aan één uiteinde van een microkolom en breng ongeveer 5 mL van de celoplossing over naar het lumen om deze te vullen. Nadat alle microkolommen in een bootje zijn geplaatst, worden deze 1 uur lang geïncubeerd bij 37 °C en 5% koolstofdioxide om de hechting van astrocyten aan de ECM te bevorderen. Vul na de incubatieperiode de schalen met de geplaatste microkolommen voorzichtig met 3 of 6 mL cocultuurmedium, respectievelijk voor petrischalen van 35 of 60 mL.

Houd de geplaatste microkolommen en de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de zelfassemblage van de uitgelijnde astrocytaire bundels te bevorderen, welke na zes tot tien uur een gebundelde, kabelachtige structuur zouden moeten vormen. Eén uur na het plaatsen zijn de astrocyten bolvormig en verspreid over het construct. Vijf uur na het plaatsen beginnen de astrocyten met het uitstrekken en inkrimpen van hun uitlopers.

Acht uur na het uitplaten zijn de astrocyten uitgelijnd en gecontracteerd. In dit voorbeeld is er 24 uur na het uitplaten een dichte bundel astrocytaire uitlopers gevormd. Deze volledig gevormde astrocytaire bundel, 24 uur na het uitplaten, vertoont het zippering-effect, waarbij de uiteinden van de kabel zich hechten aan verschillende uiteinden van de wand van het lumen.

Deze video laat bundling in actie zien, 3 tot 10 uur na het uitplaten. Immuno-labeling van de astrocytaire steigers demonstreert de longitudinale uitlijning van astrocytaire processen. In deze confocale afbeelding van een astrocytair bundeltje wordt de astrocytaire marker GFAP uitgelezen.

En de kernen zijn in blauw te zien. Deze hogere vergroting van de bundel maakt visualisatie van de cytoarchitectuur van de astrocyten binnen de microkolommen mogelijk. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om levende steigers te vervaardigen die bestaan uit longitudinaal uitgelijnde astrocytische bundels met een biologisch geïnspireerde cytoarchitectuur binnen een biomateriaalbehuizing.

Na deze procedure kan een transplantatiestrategie worden ontworpen om de astrocytische bundels, met of zonder omhulling door biomateriaal, af te leveren bij beschadigd hersenweefsel om gerichte celmigratie vanuit neurogene regio's te bevorderen en te sturen naar de beperkende micro-omgeving van het centrale zenuwstelsel. Daarnaast kan deze techniek worden uitgebreid als een biofidel platvorm voor het modelleren van glia-gemedieerde neurobiologische fenomenen, waarbij wordt geprofiteerd van de nabootsing van de natuurlijke driedimensionale omgeving en de inherente experimentele controle van in vitro systemen.