Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen
10 januari 2018
Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.
Dit protocol heeft als doel de fabricage te begeleiden van zelf-geassembleerde, driedimensionale bundels van longitudinaal uitgelijnde astrocytische somata en processen binnen een micro-metergrote hydrogel micro-kolom voor gebruik als een in vitro neurobiologische model of als een neuro-regeneratieve therapie. Trauma en neurodegeneratieve ziekten zijn bijzonder nadelig voor patiënten vanwege de beperkte neurogene capaciteit in een remmende omgeving die regeneratie in het centrale zenuwstelsel beperkt. Geconstrueerde astrocytische bundels gaan in op de beperkingen van huidige behandelingsstrategieën door te proberen belangrijke neuroanatomische kenmerken en door gliacellen gemedieerde ontwikkelingsmechanismen te repliceren om gerichte celmigratie en axonpadvinding te bevorderen.
De architectuur van deze astrocytische schalen is voornamelijk geïnspireerd door de uitgelijnde astrocytische processen in de gliale buizen van de rostrale migratiestroom. Begin met het bereiden van een 3%gewicht per volume agarose-oplossing en DPBS in een steriele beker. Houd het verwarmen en roeren aan om te voorkomen dat de oplossing voortijdig stolt.
Plaats een acupunctienaald in de onderste opening van de bulb dispenser. Plaats een capillair buisje over de blootgestelde naald en bevestig de twee door een deel ervan in het rubberen gedeelte van de bulb dispenser cilinder te steken. Sluit de cilinder af om de montage te voltooien.
Breng een milliliter vloeibare agarose over op het oppervlak van een lege petrischaal. Terwijl u de rubberen dop van de bulb dispenser knijpt, steekt u een uiteinde van het capillair buisje in de agarose en laat u de druk op de dop los om agarose in het buisje te trekken. Plaats de bulb, buis en naald constructies op een petrischaal en laat de agarose 5 minuten stollen in de capillaire buisjes.
Trek vervolgens de naald uit het capillaire buisje, waarbij de micro-kolom nog steeds om de naald heen zit. Gebruik de uiteinden van een pincet om de micro-kolom naar het uiteinde van de naald te duwen en houd de naald boven een open petrischaal met DPBS en duw de micro-kolom in de DPBS. Om micro-kolom bootjes te fabriceren, die latere manipulatie van deze constructies vergemakkelijken, begint u met het maken van een 4%gewicht per volume agarose-oplossing en houdt u de oplossing verwarmd en geroerd.
Gebruik een pincet om een micro-kolom naar een lege petrischaal te verplaatsen. Gebruik vervolgens, terwijl u onder een stereoscoop werkt, een micro scalpel om de micro-kolommen bij te snijden tot de gewenste lengte, waarbij de uiteinden onder een hoek van 45 graden worden gesneden. Na het bijsnijden van drie meer micro-kolommen, lijnt u de vier kolommen parallel uit.
Laad een pipet met 50 microliter 4%agarose-oplossing en doseer een lijn vloeistof over de micro-kolom-array om de constructies te verbinden en in een bootje te bundelen. Laat afkoelen gedurende 1 tot 2 minuten om gelering van de 4%agarose mogelijk te maken. Gebruik vervolgens een fijn pincet om het micro-kolom bootje op te pakken door de verbindende agarose brug.
En verplaats het naar een petrischaal met DPBS. Breng het micro-kolom bootje over in een bioveiligheidskast en steriliseer het door het dertig minuten aan ultraviolet licht bloot te stellen. Binnen een bioveiligheidskast, bereid een oplossing van 1 milligram per milliliter rattenstaart type 1 collageen in co-cultuur medium voor.
En plaats het vervolgens op ijs. Pas het pH van de ECM oplossing aan met zuur of base indien nodig totdat de pH stabiel is in het bereik van 7,2 tot 7,4. Breng het micro-kolom bootje over naar een 35 of 60 mL petrischaal met behulp van een pincet.
Gebruik de stereoscoop als leidraad, plaats de 10 mL tip van een micropipet aan één uiteinde van elke micro-kolom en zuig om het lumen van DPBS en luchtbellen leeg te maken. Laad een P10 micropipet met de collageenoplossing. Plaats de 10 mL tip tegen één uiteinde van elke micro-kolom en breng voldoende oplossing aan om het lumen te vullen.
Pipetteer vervolgens een reservoir van ECM aan beide uiteinden van de micro-kolom. Zodra alle kolommen zijn gevuld, pipetteer co-cultuur medium in een ring rond de petrischaal om te voorkomen dat de kolommen uitdrogen. Incubeer de schaal met de micro-kolommen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende minimaal een uur om de polymerisatie van collageen te bevorderen voordat u cellen toevoegt.
Plaats vervolgens de punt van een P10 micropipet aan één uiteinde van een micro-kolom en breng ongeveer 5 mL celoplossing in het lumen aan om het te vullen. Nadat alle micro-kolommen in een bootje zijn geplaatst, incubeer ze gedurende 1 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de hechting van astrocyten aan de ECM te bevorderen. Na de incubatieperiode, vult u voorzichtig de schalen met de geplaatste micro-kolommen met 3 of 6 mL co-cultuurmedium, voor respectievelijk 35 of 60 mL petrischalen.
Bewaar de geplateerde micro-kolommen en het kweekmedium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de zelfsamenstelling van de uitgelijnde astrocytische bundels te bevorderen, die na zes tot tien uur een gebundelde, kabelachtige structuur zouden moeten vormen. Een uur na het plateren zijn astrocyten bolvormig en verspreid door de constructie. Vijf uur na het plateren beginnen astrocyten met het uitbreiden en samentrekken van hun processen.
Na acht uur na het plateren zijn astrocyten uitgelijnd en samengetrokken. Na 24 uur na het plateren is er in dit voorbeeld een dicht bundeltje astrocytische processen gevormd. Dit volledig gevormde astrocytische bundeltje, 24 uur na het plateren, toont het 'ritsluik' effect, waarbij de uiteinden van de kabel zich aan verschillende uiteinden van de wand van het lumen hechten.
Deze video toont bundeling in actie, 3 tot 10 uur na het plateren. Immuno-labeling van de astrocytische schalen toont de longitudinale uitlijning van astrocytische processen. In deze confocale afbeelding van een astrocytisch bundeltje wordt de astrocytische marker GFAP gelezen.
En de kernen zijn blauw te zien. Deze hogere vergroting van het bundeltje maakt visualisatie mogelijk van de cyto-architectuur van de astrocyte
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het fabriceren van zelf-geassembleerde, driedimensionale bundels van longitudinaal uitgelijnde astrocytische somata en processen binnen een micron-grootte hydrogel micro-kolom. Deze geëngineerde astrocytische bundels hebben tot doel belangrijke neuro-anatomische kenmerken te repliceren en neuroregeneratie te faciliteren door neuronale migratie en axonaal padvinden te richten.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Neuroregeneratie
- Biomaterialen
Achtergrond
- Traumata en neurodegeneratieve ziekten beperken regeneratie in het centrale zenuwstelsel.
- Huidige behandelingsstrategieën worden geconfronteerd met uitdagingen vanwege de remmende omgeving.
- Uitgelijnde astrocytische processen zijn cruciaal voor neuro-ontwikkelingsmechanismen.
- Geëngineerde scaffolds kunnen deze beperkingen aanpakken door natuurlijke structuren te imiteren.
Doel van het onderzoek
- Om een nieuw in vitro neuro-biologisch model te ontwikkelen.
- Om neuro-regeneratieve therapie te faciliteren.
- Om gerichte celmigratie en axon padvinden te bevorderen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een 3% gewicht per volume agarose oplossing.
- Gebruik van DPBS in een steriele omgeving.
- Verwarmen en roeren om de consistentie van de oplossing te behouden.
- Zelf-assemblage van astrocytische bundels binnen hydrogel micro-kolommen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van uitgelijnde astrocytische bundels.
- Demonstratie van potentieel voor neuro-ontwikkelingsstudies.
- Bewijs van het faciliteren van neuronale migratie en axonaal padvinden.
- Creatie van een biomateriaal dat natuurlijke astrocytische omgevingen nabootst.
Conclusies
- Geëngineerde astrocytische bundels kunnen dienen als effectieve testbedden voor onderzoek.
- Deze scaffolds kunnen het begrip van neuro-ontwikkelingsprocessen verbeteren.
- Potentiële toepassingen in neuro-regeneratieve therapieën zijn veelbelovend.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Engineered aligned astrocyte networks provide a biologically inspired platform to study neurodevelopmental mechanisms and support neuroregeneration strategies. By mimicking natural glial scaffolds, these constructs enable hypothesis testing of axonal pathfinding and neuronal migration in a controlled in vitro system. This approach addresses a key discovery-stage challenge in CNS repair by offering a scalable, reproducible model for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease and neurotrauma research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial-mediated developmental mechanisms and therapeutic hypothesis testing for neuroregeneration.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible system for evaluating astrocyte-neuron interactions and pathway clarification.
- Predictive Value: Supports target confidence by modeling permissive substrates for axonal extension and neuronal attachment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts on neurite extension and alignment along astrocytic bundles for compound screening.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable micro-column assemblies compatible with high-content imaging and automated analysis.
- Assay Readiness: Produces stable, aligned scaffolds with >97% viability suitable for multi-well plating and longitudinal monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by maintaining structural integrity post-extraction for implantation studies.
- Operational Value: Enables testing of transplantation strategies in injury models to assess directed cell migration and axonal pathfinding.
- Risk Mitigation: Facilitates mechanistic de-risking of glial-mediated regeneration approaches prior to in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, supporting hypothesis-driven research on glial-guided neuroregeneration.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by modeling developmental glial scaffolds in a tunable microenvironment.
- Screening: Enables assay-ready systems with quantitative neurite outgrowth measurements for evaluating pro-regenerative compounds.
- Analytics: Provides aligned, measurable cytoarchitectural outputs for comparing experimental conditions and tracking structural maturation.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical continuity through implantable constructs that retain alignment and viability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for modeling glial-neuron interactions across neurodegenerative and neurotrauma indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by recapitulating developmental glial architectures.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined hydrogel micro-column fabrication and collagen coating.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neuroregeneration pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial-targeted therapies through validated, disease-relevant system modeling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, astrocyte culture, and biomaterial handling.
- Depends on agarose micro-column fabrication, collagen coating, and sterile co-culture systems.
- Necessitates cross-team standardization for consistent lumen diameter (<350 µm) and alignment induction.
- Involves adaptation considerations for different astrocyte sources and extracellular matrix compositions.
- Includes practical limitations such as construct length variability and dependency on precise micro-column dimensions for self-assembly.
