Name: Tuning in de Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologieën voor opname uit het Geïsoleerde Knaagdier Septohippocampale Circuit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Leer methoden voor het opnemen van theta-oscillaties in het hippocampus van knaagdieren met patch-clamp en optogenetische technieken. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar neurale netwerken en geheugen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek en natuurwetenschappen.

Alle procedures zijn uitgevoerd volgens de protocollen en richtlijnen die zijn goedgekeurd door de McGill University Animal Care Committee en de Canadese Raad voor Dierenverzorging. 1. Acute Hippocampus In Vitro Bereiding OPMERKING: Het isoleren van het intacte hippocampale preparaat omvat drie belangrijke stappen: (1) Bereiding van oplossingen en uitrusting, (2) Dissectie van de hippocampus en (3) Het opstellen van het snelle perfusiesnelheidssysteem dat nodig is voor het genereren van intrinsieke theta-oscillaties. In dit protocol is de tijdige uitvoering van procedures - van dissectie tot opname - bijzonder belangrijk omdat de geïsoleerde hippocampus zo&#39;n dichte maar delicate voorbereiding vormt dat het behoud van functionele connectiviteit van de structuur in vitro zorgvuldig vereist. Voorbereiding van alles op voorhand zorgt ervoor dat een voldoende mate van perfusie zo vroeg mogelijk beschikbaar is om cel d te minimaliserenVersterken en onderhouden van de fysiologische functie. <ol><li> Succrose-gebaseerde kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (aCSF) oplossing <ol><li> Bereid 1X stock sucroseoplossing voor om te gebruiken voor dissectie en post-dissectie incubatie. Combineer alle componenten in Tabel 1, behalve CaCl2 in 1 liter gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. </li></ol></li><li> Standaard aCSF oplossing <ol><li> Bereid standaard aCSF voor hoge perfusie van de geïsoleerde hippocampus tijdens elektrofysiologische opnamen. Om de geconcentreerde (5X) voorraad aCSF te maken, loste alle componenten in tabel 2 op , behalve CaCl 2 , in 2 liter gedeïoniseerd water en opslaan bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereid de uitrusting voor <ol><li> Voordat u de dissectie start, zet u de bankruimte op met een ijzige plastic lade (30 x 20 x 5 cm)Ee glazen petrischalen (10 x 2 cm) (zie afbeelding 1 ). </li><li> Voeg 300 ml sucroseoplossing (1X voorraad) in een 500 ml bekerglas bel met carbogeen (95% O2, 5% CO2) en voeg Ca2 + [1,2 mM]. </li><li> Breng 60 ml van deze sucroseoplossing over op een glas Petri-schotel en laat het bij kamertemperatuur. Plaats de rest in een 4 ° C vriezer gedurende 10 - 15 minuten. </li><li> Bubble de ijskoude sucroseoplossing met carbogeen gedurende de dissectie. </li><li> Vul een tweede Petri schotel (koude houderkamer) met sucroseoplossing (4 ° C) en blijf ijs. </li><li> Voeg 30 ml ijskoude sucroseoplossing toe aan een beker van 50 ml. </li></ol></li></ol> 2. Hele Hippocampus Dissectie OPMERKING: De methode voor het dissecteren van de geïsoleerde hippocampus is in wezen identiek aan die ontwikkeld en beschreven oorspronkelijk 22 , maar met aanvullende details en veranderingen met betrekking tot de peRfusie snelheid en opname technieken. <ol><li> Hersensectie <ol><li> Verdoof de muis (P20 - 35) onder een afzuigkap met een kleine papieren handdoek geweekt met 1 ml isofluraan (100%) die in de kooi wordt toegevoegd. </li><li> Decapiteer de verdoofde muis en snel onderdompelen het hoofd in ijskoude sucroseoplossing (50 ml beker, ~ 5 s). Overbrengen op een papieren handdoek. </li><li> Gebruik een scalpel om een ​​mediale huidinsnijding (caudale tot rostral) te maken en de huid aan de zijkanten te drukken om het kraan bloot te leggen. </li><li> Knip de schedel open met een kleine schaar en gebruik een spatel om de hersenen snel uit te trekken en te laten vallen in de Petri-schotel met ijskoude sucroseoplossing. Laat 1-2 minuten voor de hersenen afkoelen. </li><li> Terwijl de hersenen zich herstellen, voeg 2 - 3 ml sacharoseoplossing toe op een lenspapier bedekte Petri (dissectie) schotel op ijs. </li></ol></li><li> Isolatie van de hippocampus <ol><li> Plaats de hersenen op de dissectieschotel in een rechtop positien. </li><li> Verwijder de cerebellum en de frontale cortex met een scheermesje. Snijd de hersenen halverwege het midsagittale vlak en keer de twee geïsoleerde hemisfeer terug naar de kamer. Laat nog 1 tot 2 minuten voor herstellen. </li><li> Plaats de afzonderlijke hemisecteerde hersenen rechtop op de dissectieschotel. </li><li> Draai de schotel rond tot de midsagitale structuren de waarnemer tegenkomen en de ingebouwde omtrek van het septalcomplex is zichtbaar als een dunne, peervormige weefsel die aan de thalamus ligt. </li><li> Houd de gestemde hersenen stabiel met de microspatel en plaats het kleine uiteinde van de polytetrafluorethyleen (PTFE) -coated spatel direct achter (caudale naar) het septalgebied. </li><li> Plaats de gecoate spatel onder het septum en beweeg de tip naar beneden totdat de dissectieschotel is bereikt. Verdeel de vezels die het septalgebied caudaal verbinden. Herhaal dezelfde operatie langs de voorkant van de septum en snijd de vezels die aan het voorste gedeelte van de hersenen verbinden. </li><li> Met de spatel liggend in het midden van de cortex net boven de hippocampus in de rechtopstand houden, gebruik de microspatel om de thalamische, hypothalamische en resterende hersenstamkernen zorgvuldig te trekken. Gebruik de spatel om het afgetrokken weefsel af te snijden en te verwijderen. </li><li> Draai het geïsoleerde halfrond aan de zijkant en identificeer de omtrek van de hippocampus. </li><li> Plaats de gecoate spatel in de laterale ventrikel, onder het rostrale uiteinde van de dorsale hippocampus. </li><li> Houd de spatel horizontaal in lijn met het midsagittale vlak van de hemi-gescoorde hersenen en schuif het door de gladde contour van de ventriculaire muren tot het punt caudaal optreedt. </li><li> Houd de spatel onder de hippocampus vast en druk het licht op de verbindingsvezels, langs de binnenlaag waar de hippocampus aansluit bij de overliggende cortex. Breng de microspatel aan de buitenkant van deze laag aan en schuif tegen de gecoate spatel om door de verbindingsfiets te snijdenBers. </li><li> Om de extractie te voltooien, draai de dissectieschotel en plaats de gecoate spatel onder de ventrale hippocampus. Houd de binnenkant van de corticale vouw lichtjes vast met de spatel en snijd de entorhinaire verbindingen door middel van een snijbeweging tegen de microspatel. OPMERKING: Het gehele septohippocampale complex kan verwijderd worden door de gecoate spatel onder de gehele hippocampus te plaatsen en het resterende hersenweefsel van onder te trekken. </li><li> Zodra de isolatie voltooid is, houd de hippocampus op het gerecht rustig en voeg een druppel ijskoude sucroseoplossing toe om het koel te houden. Trek de resterende cortex en vezels zorgvuldig af en verwijder de hippocampus uit het septum door een scheermesje door de fornix zachtjes aan te brengen. OPMERKING: Als patchclamp opnames uit piramidale cellen moeten worden uitgevoerd (zie paragraaf 4.6 Optogenetische controle), kan de geïsoleerde hippocampus transversaal gesneden worden op een hoek van 45 ° om de pyramidale laag van CA1 (&quot;anglE-cut &quot;voorbereiding), zonder het lokale netwerk circuit in het overige gedeelte van de hippocampus in gevaar te brengen. </li><li> Zet het preparaat over op kamertemperatuursaccharoseoplossing en laat het 15 tot 30 minuten herstellen voordat u naar de opnamekamer gaat. </li></ol></li></ol> 3. Stel de snelle perfusie op voor het opnemen van de geïsoleerde Hippocampus <ol><li> Stel het zwaartekrachtvoedingssysteem in om de continuïteit van hoge zuurstofgezette aCSF bij 20-25 ml / min in te zetten. <ol><li> Maak vooraf een fles van ACSF (1X) en dompel ze minstens 30 minuten in een warmbad (~ 30 ° C) voor het begin van het experiment. Zet het in-line-verwarmingssysteem aan (30 ° C). </li><li> Gebruik aquarium bubblers en buisleidingen verbonden met een carbogen tank zuurstof aCSF gedurende het experiment en voeg CaCl2 [2 mM] voor de start van de perfusie. </li><li> Stop aCSF-stroom en verplaats de hippocampus naar de opnamekamer met behulp van de bredeEinde van een glazen pipet. Laat het sucrose verzadigde preparaat zinken en vestig aan de onderkant. </li><li> Plaats de voorbereiding in het midden van de opnamekamer (in lijn met de inlaatas) met het gladde oppervlak van CA1 en SUB bovenop. Stabiliseer de hippocampus met kleine gewichten bij de septal en de tijdelijke extremiteiten en start de aCSF-stroom opnieuw. </li></ol></li></ol> 4. Elektrofysiologie in de Geïsoleerde Hippocampus <ol><li> Extracellulaire opname van in vitro hippocampale theta-oscillaties <ol><li> Voor extracellulaire monitoring van Local Field Potential (LFP) of single-unit activiteit van de in vitro geïsoleerde hippocampus, gebruik glazen micropipetten (1 - 3 MΩ) gevuld met aCSF. Record geluidsgerichte AC-gekoppelde veldpotentiële signalen met een patch-klemversterker van winst x1000, online bandpasfiltrering 0,1 - 500 Hz en een sampling snelheid van 5-20 kHz. OPMERKING: De op maat gemaakte microscoop die in dit protocol wordt gebruiktIs uitgerust met lage (2.5X) en hoge vergroting (40X) doelstellingen voor een kleine vergroting van de hippocampus, evenals infrarood video microscopie en epifluorescentie voor single cell recognition. De componenten van dit systeem zijn onder andere de opstaande fluorescentiemicroscoop, fluorescentiefilterblokjes, een analoge videocamera en digitale framegrabber met beeldsoftware, een op maat gemaakte perfusiekamer ( Figuur 2A , inzet i) en microgroeven met hoge precisie voor neuronale opnames en Optische vezel plaatsing. </li><li> Gebruik de camera gemonteerd op de microscoop en aangesloten op een computer display om de hippocampale voorbereiding onder lage vergroting (2.5X) te inspecteren en snel te controleren of er geen onderbrekingen of schade aan het externe oppervlak zijn. De diagonaal georiënteerde opstelling van alveusvezels langs het gladde oppervlak van CA1 zou zichtbaar moeten zijn ( Figuur 2A , inzet ii) wanneer het licht door de hippocam doorgaatpus. </li><li> Gebruik de kleine vergrotingsbreedte-doelstelling om de geïsoleerde hippocampus en de plaatsing van LFP-elektroden op specifieke opnamelocaties te bekijken. OPMERKING: Een afbeelding van het geïsoleerde hippocampale preparaat met meerdere elektroden geplaatst in verschillende opnamelocaties is geïllustreerd in figuur 2A . </li><li> Leg een LFP-elektrode in het bad tot het het oppervlak (alveus) van het CA1-gebied raakt. OPMERKING: dit levert meestal een snelle transient op in de AC-gekoppelde opname, vergelijkbaar met wat er gebeurt als de elektrode in contact komt met het opnamemedium. Een audiomonitor kan handig zijn om naar dit LFP-kanaalsignaal na deze stap te luisteren. OPMERKING: Vaak zullen de vroege tekenen van activiteit pas na 10 tot 15 minuten verschijnen, daarom is het belangrijk om niet snel in de voorbereiding te komen. Als na deze periode de oppervlak LFP-elektrode nog steeds geen activiteit opneemt, ga je een beetje verder door de stratum-oriëntenEn pauzeer periodiek om te zien of er een vorm van activiteit optreedt terwijl u de hoofdcellaag nadert. Als er na 5 tot 10 minuten niets wordt gedetecteerd, trek de elektrode de voorzichtig terug en plaats deze elders in dezelfde regio. </li><li> Bevorder de LFP-elektrode door de pyramidale laag. Let op dat die extracellulaire spikingactiviteit aanvankelijk stijgt, aangezien afzonderlijke ontlading van individuele neuronen (meestal piramidale en remmende basketcellen) wordt gedetecteerd. Verlaag de elektrode verder en let op dat de spiking weer verdwijnt als het punt in de radiatum komt. Let op dat een duidelijk zichtbare netwerkoscillatie in het theta-frequentiebereik (4-12 Hz) duidelijk wordt en bereikt de maximale amplitude (~ 100 - 300 μV), aangezien de opname locatie door de radiatum wordt verlaagd. </li></ol></li><li> Theta-oscillaties over een enkele regio <ol><li> Om de ruimtelijke eigenschappen van spontane theta-oscillaties in het CA1-gebied te testen, plaats de tip oFa referentie LFP elektrode in een mediale CA1 plaats (mediaal gelegen langs de longitudinale septotemporale as) en verlaag het in de radiatum zoals eerder beschreven. </li><li> Plaats een tweede LFP-elektrode in een CA1-plaats (200 - 800 μm septal of temporaal van de eerste LFP) en let op dat CA1 theta-oscillaties over relatief grote afstanden kunnen synchroniseren. </li></ol></li><li> Theta oscillaties over lagen <ol><li> Om de eigenschappen van theta oscillaties over hippocampale lagen te testen, laat een referentie LFP elektrode in een CA1 radiatum site. Begin vanaf net boven de stratum-oosters, laat een tweede elektrode in de pyramidale cellaag, en door de radiatum. Let op een geleidelijke inversie van het LFP-signaal (relatieve fase-omkering) over de pyramidale laag. OPMERKING: Zie figuur 2B voor representatieve voorbeelden van deze soorten activiteiten. Voorbeelden van laminaire / diepteprofielen en huidige brondichtheid (CSD) analyseIllustreert de plaats van fase omkering in geïsoleerde hippocampi zijn eerder 23 , 24 , 25 gepubliceerd . </li></ol></li><li> Gamma-oscillaties en theta-gamma koppeling in de intakte hippocampus <ol><li> Plaats een veldelektrode aan de CA1 / SUB-rand en laat deze zakken tot hij op de interface zit tussen de pyramidale en moleculaire lagen. Op dit niveau kan een veldpotentiaal die duidelijke gamma-oscillaties met amplitudeveranderingen weergeeft, die fase-lock naar het lokale theta-ritme vertoont 24 opgenomen kunnen worden. Schaal aanpassen om de langzame tijdschaal van de theta-gamma-koppeling in acht te nemen. Merk op dat gamma-uitbarstingen zich voordoen in twee verschillende frequentiebanden, die kan worden aangetoond door het doorlopende LFP-signaal in het langzame (25 - 50 Hz) en het snelle gamma (150 - 250 Hz) bereik te filteren (zie figuur 2C voor representatief gefilterd sporen). </li></ol></li><li> Hele-cel patch klem opname tijdens in vitro hippocampale theta oscillaties OPMERKING: In dit deel van het protocol is het doel visueel begeleide gehele cel-patch klemopnamen te verkrijgen van geïdentificeerde interneuronen in geïsoleerde hippocampi van transgene PV-TOM muizen die het fluorescerende eiwit, tdTomato, onder controle van de PV-promotor uitdrukken (voor Meer details zie materialen en Ref 26 ). <ol><li> Gebruik fluorescentie video-microscopie met lage (2,5x) en high power (40X) vergroting om TDTomato-positieve interneuronen te lokaliseren die zich dichtbij het oppervlak van een hippocampale voorbereiding van een PV-TOM muis bevinden ( Figuur 3 ). Merk op dat, terwijl PV-TOM neuronen succesvol kunnen worden visualiseerd en gericht zijn op patch via de alveus (tot 100 μm), kunnen niet-fluorescerende pyramidale cellen ook relatief gemakkelijk worden bereikt wanneer de hippocampus wordt bereid met de hoekgesneden techniek (zie Sectie 2.2.14 noot).</li><li> Plaats onder een lage vergroting van de hippocampus een LFP-elektrode in CA1 / SUB om theta-oscillaties te controleren tijdens het voorbereiden op patchclamp-experimenten. </li><li> Overschakelen naar 40X vergroting en dompel het doel over het doelgebied; Zet het tot de bovenste lagen zichtbaar zijn. Manipuleer de positie van de microscoop om voldoende open toegang te bieden voor patchpipetaanpak van de tegenovergestelde kant. </li><li> Selecteer onder fluorescentiemicroscopie een fluorescerende PV-TOM-cel en benader deze met een patchpipet (2 - 3 MΩ) gevuld met standaard intracellulaire oplossing. </li><li> Gebruik een mondstuk om de positieve druk op de pipet toe te passen en controleer de weerstand als de elektrode op de cel wordt verlaagd. Wanneer de tip de target cel tegenkomt, neemt de pipetweerstand toe en er verschijnt een duidelijke dimple als de positieve druk op het membraan duwt. Laat de druk los en controleer of de huidige puls fladert als een zegel begint te vormen. Onmiddellijk clVersterker tot een hyperpolariseerd potentieel (-70 mV), en zodra een GΩ zegel is bereikt, breek het celmembraan met een kleine hoeveelheid negatieve druk die door de pipethouder wordt aangebracht. </li><li> Eens in de volledige celconfiguratie, onderzoeken de fysiologische eigenschappen van geïdentificeerde PV-cel tijdens spontane hippocampale oscillaties ( Figuur 3B ). </li><li> Houd er rekening mee dat intracellulaire membraanpotentiële opname van PV-cellen wordt gekenmerkt door snelle spikgedrag en uitbarstingen van actiepotenties gesynchroniseerd met het lopende CA1 / SUB-theta-ritme. </li><li> Schakel over naar spanningsclamp en houd de cel bij verschillende membraanpotentialen om de verhouding van excitatorische tegeninhibitorische synaptische stromingen te karakteriseren die wordt gegenereerd door de intrinsieke ritmische activiteit. Een voorbeeld van patchclamp opname uit een pyramidale cel wordt getoond in figuur 3A ter vergelijking. </li></ol></li><li> Optogenetische controle in de geïsoleerde hippocampus </strong&gt; OPMERKING: Voor optogenetische controle van hippocampale netwerkactiviteit wordt hier een celtypespecifieke strategie met betrekking tot ritmische activering van PV-bevattende GABAergic cellen gebruikt, aangezien deze cellen bleken een belangrijke rol te spelen bij het synchroniseren van hoofdcelpopulaties in de geïsoleerde hippocampus 25 . Selectieve expressie van de excitatoire channelrhodopsin-2 (ChR2) in PV-cellen wordt bereikt door de PV-Cre-muislijn te kruisen met muizen die constitutief ChR2 Cre-afhankelijk maken (Ai32), waardoor PV-ChY-muizen worden genereerd. Alternatief kunnen virale vectorconstructies ( bijv . AAVdj-ChETA-eYFP) geïnjecteerd worden in de hippocampus van PV-Cre of PV-TOM muizen (P15-16) om de expressie van de excitatorische opsin in CA1 / SUB-interneuronen te stimuleren ( Figuur 4A ). OPMERKING: Deze strategie is eerder beschreven 25 . <ol><li> Plaats een LFP-elektrode in het CA1 / SUB-gebied en plak een nabije pyramidale cel in de geïsoleerde hippocAmpus van een muis die de blauwlichtgevoelige excitatorische opsin ChR2 uitdrukt in PV-interneuronen. </li><li> Plaats een optische vezellichtgeleider (0,2 - 1 mm diameter) boven de hippocampale voorbereiding en plaats het op het opgenomen gebied. Gebruik blauw licht (473 nm) van een LED-bron voor optogenetische stimulatie, bestaande uit lichtimpulsen (10 - 20 ms, geactiveerd door een transistor-transistorlogische signaal) of sinusgolfspanningskommando&#39;s die bij de frequenties van de frequenties (4 - 12 Hz) worden afgeleverd. OPMERKING: Het aangepaste LED-gebaseerde lichtstimulatiesamenstel is elders 25 beschreven. </li><li> Schakel over naar de huidige klem en karakteriseer de activiteit van de pyramidale tijdens spontane theta-oscillaties. </li><li> Start het stimulatieprotocol en teken de lichtreacties op. Oplossen die veldoscillaties en synaptische activiteit in de opgenomen neuron worden steeds meer gesynchroniseerd tijdens optogenetische stimulatie en dat ritmische pacing van PV-cellen resulteert in een robuuste controle van beide frequentiesEncy en kracht van theta oscillaties ( Figuur 4 ). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+rhythm+of+navigation%3A+link+between+path+integration+and+landmark+navigation%2C+episodic+and+semantic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory.</a> Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).</li>
<li>Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grid+Cells+and+Place+Cells%3A+An+Integrated+View+of+their+Navigational+and+Memory+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function.</a> Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).</li>
<li>O'Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li>
<li>Winson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+hippocampal+theta+rhythm+results+in+spatial+memory+deficit+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat.</a> Science. 201 (4351), 160-163 (1978).</li>
<li>M'Harzi, M., Jarrard, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+selection+in+a+task+with+spatial+and+nonspatial+components%3A+effects+of+fimbria-fornix+lesions+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neural+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats.</a> Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).</li>
<li>Osipova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+and+gamma+oscillations+predict+encoding+and+retrieval+of+declarative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory.</a> J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).</li>
<li>Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+the+rabbit%27s+septum+as+a+relay+station+between+the+midbrain+and+the+hippocampus.+II.+The+differential+influence+of+drugs+upon+both+the+septal+cell+firing+pattern+and+the+hippocampus+theta+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).</li>
<li>Mitchell, S. J., Ranck, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+theta+rhythm+in+medial+entorhinal+cortex+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats.</a> Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).</li>
<li>Alonso, A., Garcia-Austt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sources+of+theta+rhythm+in+the+entorhinal+cortex+of+the+rat.+I.+Laminar+distribution+of+theta+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials.</a> Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).</li>
<li>Vertes, R. P., Kocsis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem-diencephalo-septohippocampal+systems+controlling+the+theta+rhythm+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus.</a> Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).</li>
<li>Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+records+of+carbachol-induced+theta+rhythm+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices.</a> Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).</li>
<li>Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+neuronal+activity+in+hippocampus+by+individual+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons.</a> Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).</li>
<li>Williams, J. H., Kauer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+carbachol-induced+oscillatory+activity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus.</a> J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).</li>
<li>Chapman, C. A., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+theta-frequency+oscillations+in+hippocampal+inhibitory+interneurons+and+pacing+of+pyramidal+cell+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing.</a> J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).</li>
<li>Strata, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillations+in+CA3+hippocampal+pyramids%3A+physiological+relevance+to+theta+rhythm+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation.</a> Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).</li>
<li>Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+multiple+theta+generators+in+the+hippocampus%3A+a+partial+coherence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis.</a> J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).</li>
<li>Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+oscillations+in+the+hippocampal+slice+in+the+slow+%280.5-2+Hz%29%2C+theta+%285-12+Hz%29%2C+and+gamma+%2835-70+Hz%29+bands%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands.</a> Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).</li>
<li>Gillies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+atropine-resistant+theta+oscillations+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1.</a> J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).</li>
<li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li>
<li>Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+cell+repertoire+during+carbachol-induced+theta+rhythm+in+rat+hippocampal+formation+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices.</a> Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).</li>
<li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocamposeptal+pathway+generates+rhythmic+firing+of+GABAergic+neurons+in+the+medial+septum+and+diagonal+bands%3A+an+investigation+using+a+complete+septohippocampal+preparation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro.</a> J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).</li>
<li>Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+theta+oscillations+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Self-generated theta oscillations in the hippocampus.</a> Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).</li>
<li>Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+gamma+rhythms+are+intrinsically+and+independently+generated+in+the+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum.</a> J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).</li>
<li>Amilhon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+Interneurons+of+Hippocampus+Tune+Population+Activity+at+Theta+Frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency.</a> Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).</li>
<li>Huh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+Inputs+Determine+Phase-Locking+Strength+and+Spike-Timing+of+CA1+Stratum+Oriens%2FAlveus+Parvalbumin+and+Somatostatin+Interneurons+during+Intrinsically+Generated+Hippocampal+Theta+Rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm.</a> J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).</li>
<li>Gu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-dependent+phase+synchronization+between+septal+and+temporal+CA3+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks.</a> J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).</li>
<li>Jackson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+theta+rhythm+flow+through+intact+hippocampal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits.</a> Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+neurons+and+the+mechanisms+of+network+oscillations%3A+implications+for+understanding+cortical+dysfunction+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia.</a> Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende commerciële of financiële belangen.

Terwijl elektrofysiologische opnamen van acute hippocampale plakjes een standaard in vitro techniek vormen, verschillen de methoden die hier worden gepresenteerd aanzienlijk van de klassieke aanpak. In tegenstelling tot de dunne plakpreparaten waar specifieke cellagen zichtbaar zijn op het oppervlak en direct kunnen worden onderzocht, zijn de intacte hippocampale preparaten meer vergelijkbaar met in vivo configuraties, waarbij elektroden worden verlaagd naar gerichte hersenregio&#39;s terwijl ze door a...

Hippocampale theta-oscillaties (4-12 Hz) behoren tot de meest overheersende vormen van ritmische activiteit in de zoogdierbrein en worden geacht belangrijke sleutelrol te spelen in cognitieve functies zoals de verwerking van spatiotemporale informatie en de vorming van episodische herinneringen 1 , 2 , 3 . Terwijl verscheidene in vivo studies die de relatie van theta-gemoduleerde plaatscellen met ruimtelijke navigatie- en letselstudies beklemtonen, evenals klinisch bewijs, ondersteunen het standpunt dat hippocampale theta-oscillaties betrokken zijn bij geheugenvorming 4 , 5 , 6 , de mechanismen Bij de opwekking van hippocampale theta-oscillaties worden nog steeds niet volledig begrepen. Vroege in vivo onderzoeken suggereerden dat theta activiteit voornamelijk afhankelijk was van extrinsieke oscillators, in het bijzonder ritmische invoerVan afferente hersenstructuren zoals de septum en entorhinaire cortex 7 , 8 , 9 , 10 . Een rol voor intrinsieke factoren - interne connectiviteit van hippocampale neurale netwerken, samen met de eigenschappen van hippocampale neuronen - werd ook gepostuleerd op basis van in vitro waarnemingen 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Echter, afgezien van enkele landmarkstudies 19 , 20 , 21 , moeilijkheden bij het ontwikkelen van benaderingen die fysiologisch realistische populatieactiviteiten kunnen repliceren in eenvoudige in vitro- snijbereidingS hebben langdurig gedetailleerd experimenteel onderzoek van de intrinsieke capaciteiten van de hippocampus en aanverwante gebieden vertraagd om theta-oscillaties zelf te genereren. Een belangrijk nadeel van de standaard in vitro thin-slice experimentele instelling is dat de 3D-cellulaire en synaptische organisatie van hersenstructuren gewoonlijk wordt gecompenseerd. Dit betekent dat veel vormen van gecoördineerde netwerkactiviteiten die zijn gebaseerd op ruimtelijk verdeelde celsamenstellingen, variërend van gelokaliseerde groepen (≤1 mm radius) naar populaties van neuronen die zich verspreiden over een of meer hersengebieden (&gt; 1 mm) niet kunnen worden ondersteund. Gezien deze overwegingen was een ander soort aanpak nodig om te bestuderen hoe theta-oscillaties zich in de hippocampus voordoen en zich verspreiden naar verwante corticale en subcortische uitvoerstructuren. In de afgelopen jaren is de initiële ontwikkeling van de &quot;complete septo-hippocampale&quot; voorbereiding om bi-directionele interaCtions van de twee structuren 22 en de daaropvolgende evolutie van de &quot;geïsoleerde hippocampus&quot; -bereiding hebben aangetoond dat intrinsieke theta-oscillaties spontaan optreden in de hippocampus die de externe ritmische ingang 23 mist. De waarde van deze benaderingen ligt op het initiële inzicht dat de gehele functionele structuur van deze regio&#39;s behouden moest worden om in vitro 22 als een theta-ritmegenerator te kunnen functioneren.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631-25G</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Dissecting Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-25</td><td>hersenextractie</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4, 14 cm</td><td>WPI</td><td>500237</td><td>hersenextractie</td></tr><tr><td>Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm)</td><td>WPI</td><td>500456</td><td>hersenextractie</td></tr><tr><td>Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20</td><td>Ultident</td><td>02-90010-20</td><td>hersenextractie</td></tr><tr><td>Fine Point Curved Dissecting Scissors</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711999</td><td>hersenextractie</td></tr><tr><td>Teflon (PTFE) -coated thin spatula</td><td>VWR</td><td>82027-534</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Hayman Style Microspatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Lab spoon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Droper</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Razor blades Single edged</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Lens paper (4 x 6")</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Glass petri dishes (100 x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>25354-080</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>hippocampus voorbereiding</td></tr><tr><td>Single Inline Solution Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td>perfusiesysteem</td></tr><tr><td>Aquarium air stones for bubbling</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>perfusiesysteem</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8)</td><td>Fisherbrand</td><td>14-171-129</td><td>perfusiesysteem</td></tr><tr><td>Electric Skillet</td><td>Black &amp; Decker</td><td>n.a.</td><td>perfusiesysteem</td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen)&nbsp;</td><td>Vitalaire</td><td>SG466204A</td><td>perfusiesysteem</td></tr><tr><td>Glass bottles/flasks (4 x 1 L)</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>perfusiesysteem</td></tr><tr><td>Submerged recording Chamber</td><td>custom design (FM)</td><td>n.a.</td><td>Commercieel alternatief mag worden gebruikt</td></tr><tr><td>Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) )</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator</td><td>Quest Scientific</td><td>Q-Humbug</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B patch-clamp amplifier</td><td>Molecular devices</td><td>MULTICLAMP</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Commander Program</td><td>Molecular devices</td><td>MULTICLAMP</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Digital/Analogue converter</td><td>Molecular devices</td><td>DDI440</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>PCLAMP10</td><td>Molecular devices</td><td>PCLAMP10</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Vibration isolation table&nbsp;</td><td>Newport</td><td>n.a.</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Micromanipulators (manually operated )</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MX130</td><td>elektrofysiologie (LFP)</td></tr><tr><td>Micromanipulators (automated)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MC1000e</td><td>elektrofysiologie (patch)</td></tr><tr><td>Audio monitor&nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3300</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Micropipette/Patch pipette puller</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Custom-built upright fluorescence microscope</td><td>Siskiyou</td><td>n.a.</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Analogue video camera</td><td>COHU</td><td>4912-2000/0000</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Digital frame grabber with imaging software</td><td>EPIX, Inc</td><td>PIXCI-SV7</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Olympus 2.5X objective</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Olympus 40X water immersion objective</td><td>Olympus</td><td>UIS2 LUMPLFLN</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system&nbsp;</td><td>custom</td><td>n.a.</td><td>optogenetische stimulatie (Amhilon et al., 2015)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV::Cre (KI) mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock number 008069</td><td>Sta Cre-gerichte genexpressie toe in PV interneuronen</td></tr><tr><td>Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock number 007905</td><td>Express TdTomato volgend op Cre-gemedieerde recombinatie</td></tr><tr><td>Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock number 012569</td><td>Express de verbeterde channelrhodopsin-2/EYFP fusie-eiwit volgend op blootstelling aan Cre recombinase</td></tr><tr><td>PVChY mice</td><td>In house breeding</td><td>n.a.</td><td>Nakomelingen verkregen uit kruising van de PV-Cre lijn met Ai32 muizen (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td></tr></tbody></table>

tuning in de hippocampal theta band<em&gt; in vitro</em&gt;: methodologieën voor opname uit het geïsoleerde knaagdier septohippocampale circuit

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Dit protocol beschrijft de procedures voor het opstellen en opnemen van de geïsoleerde gehele hippocampus, van WT en transgene muizen, samen met recente verbeteringen in methodologieën en toepassingen voor de studie van theta-oscillaties. Een simpele karakterisering van het geïsoleerde hippocampale preparaat wordt gepresenteerd waarbij de relatie tussen interne hippocampale theta-oscillators samen met de activiteit van pyramidale cellen en GABAergische interneuronen van de cornu ammonis-1 (CA1) en subiculum (SUB) gebieden wordt onderzocht. In het algemeen tonen we aan dat de geïsoleerde hippocampus in vitro intrinsieke theta-oscillaties kan opwekken en dat ritmiciteit die in de hippocampus wordt gegenereerd, nauwkeurig gemanipuleerd kan worden door optogenetische stimulatie van parvalbumine-positieve (PV) interneuronen. De in vitro geïsoleerde hippocampale voorbereiding biedt een unieke kans om gelijktijdige veld- en intracellulaire patch-klemopnamen te gebruiken van visueel geïdentificeerd neuRons om de mechanismen van de theta ritme generatie beter te begrijpen.

<html> Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen door het bestuderen van theta-oscillaties in de muis geïsoleerde hippocampale preparaat in vitro . De dissectieprocedure voor het extraheren van de geïsoleerde hippocampus is geïllustreerd in figuur 1 . Met behulp van dit preparaat kunnen intrinsieke theta-oscillaties worden onderzocht tijdens het plaatsen van meerdere veldelektroden, waarbij de algemene activiteit...

Hier presenteren wij een protocol voor het opnemen van ritmische neuronale netwerk theta en gamma oscillaties vanuit een geïsoleerde hele hippocampale voorbereiding. We beschrijven de experimentele stappen van extractie van de hippocampus naar details van veld-, eenheids- en hele-cel patch-klemopnamen, evenals optogenetische stimulatie van het theta ritme.

Tuning in de Hippocampal Theta Band<em&gt; In Vitro</em&gt;: Methodologieën voor opname uit het Geïsoleerde Knaagdier Septohippocampale Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Het algemene doel van dit protocol is het presenteren van procedures voor het extraheren van de volledige hippocampuspreparatie en het onderzoeken van de generatie van ritmische neuronale netwerken met behulp van veld-, unitair- en patch-clamp-registraties, evenals optogenetische stimulatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het neurowetenschappelijke vakgebied van leren en geheugen door de studie van cellulaire en synaptische mechanismen die ten grondslag liggen aan ritmische oscillaties in de hippocampus aanzienlijk te vergemakkelijken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van een geoptimaliseerde preparatie om de circuits in gedetailleerde oscillaties te onderzoeken, welke een cruciale rol spelen bij hippocampus-afhankelijke geheugeninformatie.Om deze procedure te starten, plaatst u de hersenen rechtop in de dissectieschaal, verwijdert u het cerebellum met een scheermesje, snijdt u de hersenen vervolgens in tweeën langs het midsagittale vlak en plaatst u de twee geïsoleerde hemisferen terug in de bewaardeschaal. Plaats vervolgens de enkelvoudige, gehalveerde hersenhelft rechtop in de dissectieschaal. Draai de schaal totdat de midsagittale structuren naar de experimentator zijn gericht en de ingebedde omtrek van het septale complex zichtbaar is als een dunne, peervormige weefsellayer binnenin de thalamus.Steek vervolgens een gecoate spatel onder het septum en beweeg de punt naar beneden tot het dissectieschaaltje is bereikt; doorsnij de vezels die het septale gebied cordiaal verbinden. Herhaal nu dezelfde handeling langs de anterieure rand van het septum en knip de vezels door die verbonden zijn met het frontale deel van de hersenen. Terwijl de spatel het binnenste deel van de cortex net boven de hippocampus lichtjes in een rechtopstaande positie houdt, gebruikt u de microspatel om de thalamische, hypothalamische en de resterende kernen van de hersenstam voorzichtig naar beneden te trekken.Gebruik vervolgens de spatel om het losgetrokken weefsel af te snijden en te verwijderen. Steek daarna de gecoate spatel in het laterale ventrikel onder het rostrale uiteinde van de dorsale hippocampus. Houd de spatel horizontaal, uitgelijnd met het midsagittale vlak van de hemisecteerde hersenen, en schuif deze door de gladde contour van de ventrikelwanden tot de punt cordiaal tevoorschijn komt.Houd de spatel onder de hippocampus en druk deze lichtjes aan op de verbindingsvezels langs de binnenlaag waar de hippocampus aansluit op de bovenliggende cortex; breng vervolgens de microspatel aan op de buitenzijde van deze laag en druk deze tegen de beklede spatel om door de verbindingsvezels te snijden. Om de extractie te voltooien, draait u de dissectieschaal en plaatst u de beklede spatel onder de ventrale hippocampus. Houd de hippocampus lichtjes vast met de spatel en snijd door de endocriene verbindingen met een snijbeweging tegen de spatel.Zodra de isolatie is voltooid, laat u de hippocampus op de schaal rusten en voegt u een druppel ijskoude sucroseoplossing toe om deze koel te houden. Trim voorzichtig eventuele resterende cortex en vezels weg en scheid de hippocampus van het septum door voorzichtig met een scheermesje op de fornix te drukken. Breng de preparaat daarna over naar een sucroseoplossing op kamertemperatuur en laat deze 15 tot 30 minuten herstellen voordat u deze overbrengt naar de registratiekamer.Stel in deze stap het zwaartekrachtgestuurde perfusiesysteem in om een continue, snelle instroom van oxygeneerden ACSF mogelijk te maken. Stop vervolgens de ACSF-stroom en breng de hippocampus over naar de registratiekamer met behulp van het brede uiteinde van een glazen pipet. Laat het sucrose-verzadigde preparaat zinken en bezinken op de bodem.Plaats het preparaat in het midden van de opnamekamer, met het gladde oppervlak van CA1 en het subiculum naar boven. Stabiliseer de hippocampus met kleine gewichtjes op de septale en temporale uiteinden en hervat de ACSF-stroom. Breng bij deze procedure de LFP-elektrode naar het oppervlak van de hippocampus.Voer de LFP-elektrode door de parameterlaag en observeer de toename in extracellulaire spiking-activiteit naarmate de ontlading van individuele eenheden van afzonderlijke neuronen wordt gedetecteerd. Verlaag de elektrode verder en merk op dat de spiking opnieuw begint af te nemen wanneer de punt het radiatum binnengaat. Observeer dat een duidelijk zichtbare netwerkoscillatie in het theta-frequentiebereik zichtbaar wordt en een maximale amplitude bereikt naarmate de registratielocatie door het radiatum wordt verlaagd.Om de ruimtelijke eigenschappen van spontane theta-oscillaties over de CA1-regio te testen, plaatst u een tweede LFP-elektrode op een CA1-locatie en stelt u vast dat CA1 theta-oscillaties over grote afstanden synchroniseren. Om de eigenschappen van theta-oscillaties over de hippocampale lagen te testen, laat u een referentie-LFP-elektrode op een CA1 radiatum-locatie staan. Begin net boven het stratum oriens en breng een tweede elektrode naar beneden in de piramidale cellaag en door het radiatum.Observeer een geleidelijke inversie van het LFP-signaal over de parameterlaag. Om gamma-oscillaties en theta-gamma-koppeling in de intacte hippocampus te testen, plaatst u een veldelektrode bij de grens tussen CA1 en het subiculum en laat u deze zakken tot deze zich op de interface tussen de parameter- en moleculaire lagen bevindt. Op dit niveau kan een veldpotentiaal worden geregistreerd die duidelijke gamma-oscillaties vertoont met veranderingen in amplitude die fase-gelockt zijn aan het lokale thetaritmiek.Pas vervolgens de schaling aan om de trage tijdschaal van theta-gamma-koppeling te observeren. Let op dat gamma-bursts voorkomen in twee verschillende frequentiebanden die onthuld kunnen worden door bandfiltering van het lopende LFP-signaal, in het trage en snelle gamma-bereik. Gebruik voor whole-cell patchclamp-registraties tijdens in vitro hippocampale theta-oscillaties fluorescentie-videomicroscopie met lage en hoge vergroting om tdTomato-positieve interneuronen te visualiseren die zich nabij het oppervlak van een hippocampale preparaat van een PV tom-muis bevinden.Plaats bij een lage vergroting van de hippocampus een LFP-elektrode in het CA1-subiculum om theta-oscillaties te monitoren terwijl u zich voorbereidt op patchclamp-experimenten. Schakel vervolgens over naar een 40x vergroting en dompel het objectief over het doelgebied. Laat het zakken tot de bovenste lagen zichtbaar worden; selecteer onder fluorescentiemicroscopie de fluorescerende PV-tom-cel en nader deze met een patchpipet gevuld met standaard intercellulaire oplossing.Zodra de hele-celconfiguratie is bereikt, worden de fysiologische eigenschappen van de geïdentificeerde PV-cel onderzocht tijdens spontane hippocampale oscillaties. Observeer de registratie van het intracellulaire membraanpotentiaal van PV-cellen die worden gekenmerkt door fast-spiking gedrag en bursts van actiepotentialen die gesynchroniseerd zijn met het lopende theta-ritme van het CA1-subiculum. Plaats bij deze procedure een LFP-elektrode in het CA1-subiculum gebied en patch een nabijgelegen parametercel in de geïsoleerde hippocampus van een muis die het blauw lichtgevoelige excitatoire opsine, CHR2, tot expressie brengt in PV-interneuronen.Plaats een optische vezellichtgeleider boven de hippocampale preparatie en centreer deze op het geregistreerde gebied. Gebruik blauw licht van een LED-bron voor optogenetische stimulatie, bestaande uit lichtpulsen van 10 tot 20 milliseconden of sinusgolf-spanningscommando's die worden afgegeven bij thetafrequenties. Karakteriseer in current clamp de activiteit van de geregistreerde cel tijdens spontane theta-oscillaties.Start vervolgens het stimuleringsprotocol en registreer de lichtresponsen. Merk op dat veldoscillaties en synaptische activiteit van het geregistreerde neuron steeds meer gesynchroniseerd raken tijdens optogenetische stimulatie en dat ritmische pacing van PV-cellen resulteert in een robuuste controle over zowel de frequentie als de amplitude van theta-oscillaties. Hier wordt de elektrofysiologische activiteit getoond die is geregistreerd van een parametercel tijdens theta-oscillaties.Current clamp-registraties tonen spontane, maar niet ritmische vuring in rust en inhiberende postsynaptische potentialen die niet duidelijk gesynchroniseerd waren met de langzaam opkomende LFP-oscillatie. Voltage clamp-metingen laten zien dat de overeenkomstige inhiberende postsynaptische stromen een omkeerpotentiaal hebben van rond de minus 70 millivolts. En hier is de elektrofysiologische activiteit die is geregistreerd van een fast-spiking fluorescerend PV-interneuron tijdens theta-oscillaties.In de current clamp-modus vuurde deze cel spontaan in rust en werd deze sterk aangestuurd door ritmische excitatoire postsynaptische potentialen die fase-gelockt waren met de stabiele LFP-oscillatie. Bij voltage clamp-registraties lag het omkeerpotentiaal van de excitatoire postsynaptische stroom op ongeveer nul millivolt. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in twee tot drie uur worden uitgevoerd; bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de oplossing krachtig moet worden oxygenéerd en dat er een perfusiesysteem moet worden gebruikt dat een hoge, maar gestage stroom van warme ACSF over het preparaat mogelijk maakt tijdens de elektrofysiologische registraties.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals optogenetische stimulatie of het uitschakelen van specifieke celtypepopulaties, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het identificeren van de cellulaire subtypen die theta-oscillatoren vormen in de hippocampus. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om de dynamiek van theta-oscillaties over de septotemporale as van de hippocampus in vitro systematisch te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een volledige hippocampuspreparaat extraheert om de functie van ritmische neuronale netwerken te onderzoeken met behulp van field, unit en patch-clamp opnames, alsook optogenetische stimulatie.

tuning-hippocampal-theta-band-vitro-methodologies-for-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a protocol to modulate theta oscillations in a genetically engineered mouse model with light-sensitive ion channels in its GABAergic medial septum neurons. By delivering light pulses to the hippocampus, the protocol aims to synchronize neuronal activity and generate theta oscillations, which are recorded as local field potentials.

Selective Manipulation of Theta Oscillations in a Mouse Model

This video demonstrates a method to record CA3-CA1 synaptic responses in a rat hippocampal slice. It outlines the steps involved in placing the stimulating and recording electrodes on the hippocampal slice and measuring the field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) to assess synaptic response strength.

Recording CA3-CA1 Synaptic Responses in a Rat Hippocampal Slice

This video demonstrates the stereotactic implantation of a wire electrode array and an optic fiber in the hippocampus of a mouse model.

Implanting an Electrode Array and Optic Fiber into the Mouse Hippocampus

This video demonstrates the recording of rhythmic neuronal network activity, also known as theta oscillations, in an isolated hippocampus. Electrodes are inserted into various layers and spatial positions to detect and analyze theta oscillations. This shows the unique neuronal compositions and the connectivity of the neuronal network across different layers of the hippocampus.

In Vitro Recording of Theta Oscillations in the Mouse Hippocampus

This video demonstrates the method to use optogenetics to modulate hippocampal network dynamics by activating genetically modified light-sensitive interneurons in a mouse brain slice, enhancing theta oscillation synchronization and studying neural circuit behavior.

Optogenetic Control of Hippocampal Network Dynamics

Theta-activiteit in de hippocampus is gerelateerd aan specifieke cognitieve en gedragsstadia. Hier beschrijven we een analytische methode om hoog georganiseerde theta-oscillaties binnen de hippocampus te detecteren met behulp van een tijd-frequentie ( d.w.z. golfjesanalyse) gebaseerde aanpak.

Automatische detectie van zeer georganiseerde theta-oscillaties in het Muizen EEG

We beschrijven het gebruik van optogenetics en elektrofysiologische opnames voor selectieve manipulaties van hippocampal theta oscillaties (5-10 Hz) in gedragend muizen. De werkzaamheid van de entrainment ritme wordt gecontroleerd met behulp van lokale veld potentieel. Een combinatie van opto- en Farmacogenetische inhibitie adressen de efferent uitlezing van hippocampal synchronisatie.

Optogenetic meevoeren van Hippocampal Theta oscillaties in het gedrag van muizen

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Dit protocol beschrijft de opname van het lokale veld potentieel met multi schacht lineaire silicon sondes. Conversie van de signalen met behulp van de huidige Bronanalyse dichtheid kan de wederopbouw van lokale elektrische activiteit in de hippocampus muis. Met deze techniek, kunnen ruimtelijk beperkte hersenen oscillaties in vrij bewegende muizen bestudeerd worden.

Opname ruimtelijk beperkte schommelingen in de Hippocampus gedragen muizen

We gebruikten opname-en stimulatie elektroden in longitudinale hippocampal hersen schijfjes en longitudinaal geplaatste opname-en stimulatie elektroden in de rugzijde Hippocampus in vivo om extracellulaire postsynaptische potentialen aan te roepen en te demonstreren op lange termijn synaptische plasticiteit langs de longitudinale interlamellar CA1.

Onderzoek op lange termijn synaptische plasticiteit in Interlamellar Hippocampus CA1 door elektrofysiologische veld opname

Dit protocol schetst het gebruik van een op maat ontworpen opnameapparaat en elektroden om lokale veldpotentialen vast te leggen en de informatiestroom in de hippocampus en prefrontale cortex van de muis te onderzoeken.

Dubbele extracellulaire opnames in de hippocampus en prefrontale cortex van de muis

Leer methoden voor het opnemen van theta-oscillaties in het hippocampus van knaagdieren met patch-clamp en optogenetische technieken. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar neurale netwerken en geheugen.

Tuning in de Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologieën voor opname uit het Geïsoleerde Knaagdier Septohippocampale Circuit (Video) | JoVE Journal

Tuning in de Hippocampal Theta Band

Meer video's verkennen