Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering
5 februari 2018
Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.
Het algemene doel van deze methodologie is om een modulaire chemo-enzymatische aanpak te ontwikkelen voor de synthese van N-glycanen door een nieuw glycan-microarray op een met aluminiumoxide gecoate glazen plaat te bouwen voor het detecteren van heteroglycan-binding van HIV-antilichamen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de glycobiologie voor de identificatie van celvirusspecifieke glycanen voor veel ontwikkeling. Het grote voordeel van deze methode is om zwakke bindingen te detecteren en een mengsel van suikers te identificeren die aan een eiwit binden, zoals een antilichaam van een HIV-patiënt.
De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot een diagnose van influenza-infecties omdat sialic catabolist op humane luchtweg-epitheelcellen wordt geëxpresseerd en problemen zijn gebruikelijk terwijl de symptomen aanwezig zijn. Glycoarray zal een ideaal hulpmiddel zijn om de specificiteit van wilde subtypen te bepalen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de glycan-specificiteit van HIV-antilichamen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de diagnose van verschillende kankers op basis van het bindingspatroon van humane serumantilichamen naar humane specifieke serumantigenen die op het oppervlak zijn afgedrukt.
Om deze procedure te beginnen, voegt u 2-5 micromol van eerder bereide glycanen en een vijf milliliter ronde bodemkolf toe. Voeg een magnetische roerder toe aan de kolf en sluit deze af met een rubberen septum. Voeg 400 microliter vers gedroogde DMF en 10-25 micromol van de fosfonzuurkoppeling toe aan de kolf.
Roer vervolgens het reactiemengsel gedurende vijf uur bij 800 rpm. Zodra de reactie voltooid is, verdampt u het oplosmiddel met behulp van een rotatie-verdamper bij een vacuümdruk van vijf tot 10 millibar en 40 graden Celsius. Hierna lost u het gedroogde reactiemengsel op en 0,5 milliliter water en laadt u het op een polyacrylamide-gelbed.
Elueer de producten met water en verzamel een tot twee milliliter fracties. Om de verzamelde fracties te controleren door TLC, plaatst u elke fractie op een TLC-plaat en dompelt u de plaat in 0,25 molair Cerium Ammonium Molybdaat. Verwarm de gekleurde plaat met een hot plate om het product zichtbaar te maken.
Na het combineren van de productfracties en het invriezen van de oplossing, biofoliseert u om het gewenste product als een wit poeder te verkrijgen. Los vervolgens het gedroogde product op in twee milliliter water en voeg Palladium Hydroxide toe. Bevestig een waterstofhoudende ballon aan de kolf en roer het reactiemengsel gedurende 15 uur bij 800 rpm onder waterstofsfeer.
Zodra de reactie voltooid is, filtert u het mengsel door een Celite-bed en wast u met twee milliliter methanol en twee milliliter gedestilleerd gedeïoniseerd water. Vervolgens verdampt u het oplosmiddel met behulp van een rotatie-verdamper bij een vacuümdruk van 300 millibar en 40 graden Celsius. Hierna lost u het crud-mengsel op in ongeveer een milliliter water en laadt u het op een polyacrylamide-gelbed.
Elueer het product met water en verzamel een tot twee milliliter fracties. Na het combineren van de productfracties en het invriezen van de oplossing, biofoliseert u om het gewenste product als een wit poeder te verkrijgen. Zodra het product droog is, karakteriseert u het door enimar en massaspectroscopie met behulp van Deuterium Oxide als oplosmiddel.
Voor oppervlakte-anodisatie stelt u een temperatuurgestuurde incubator in op vier graden Celsius. Breng vervolgens een eerder bereide 0,3 molaire waterige oxaalzuuroplossing over in een 500 milliliter beker met een magnetische roerder. Plaats een 10 centimeter lange platina-staaf als kathode in de oplossing.
Reep het oxaalzuur gedurende het anodisatieproces bij 300 rpm. Klik in de lab tracer-software op de setup-knop en klik vervolgens op functiekeuze Veegspanning. Stel de start- en stopspanning in op 25,8 volt.
Het aantal punten op 100, de naleving op één en de veegvertraging op 1200 milliseconden. Klik vervolgens op OK. Klem een met aluminium gecoate glazen plaat met de kant naar de kathode.
Klik op de knop test uitvoeren en observeer de stroommeting. Na oppervlakte-anodisatie, was de glazen plaat grondig met twee keer gedestilleerd water en droog hem af met stikstofgas. Bewaar de glazen plaat in een kamer met een relatieve luchtvochtigheid van 30% tot verder gebruik.
Voor fabricage, bereidt u 100 microliter oplossingen van alle monovalente glycanen in ethanolglycol bij een concentratie van 10 millimolar. Verdun de glycanoplosingen met printbuffer om oplossingen van 100 micromolar te maken. Voor de Heteroligand-studie, voegt u vijf microliter MAN-5 Glycan toe aan vijf microliter van elke glycanoplossing.
Breng de bereide glycanen over in de 384-wells microplaat voor de microarray-printstap. Nadat u een microplaat op de printerarray-tech hebt geplaatst, drukt u microarrays af met een robotpen door 0,6 nanoliter van de glycanoplosingen op elke met aluminium gecoate glazen plaat af te zetten. Bereid vervolgens 70 microliter primaire antilichaam PG-9 en PTSB-buffer met 3%BSA voor.
Bereid vervolgens 120 microliter secundair fluorescerend tag-antilichaam Donkey en Anti-Human Immunoglobulin G en PBST-buffer met 3%BSA in het donker voor. Meng PG9 en het secundaire fluorescerende tag-antilichaam in een verhouding van 1:1. Bewaar vervolgens de voorgemengde antilichamen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Na incubatie, laadt u een met aluminium gecoate glazen plaat in de incubatiekamer voor glazen platen, die is verdeeld in 16 putjes. Breng 100 microliter van de voorgemengde antilichamen aan op de glycan-array. Nadat u 16 uur bij vier graden Celsius hebt geïncubeerd, verwijdert u de voorgemengde antilichamen van de glycan-array met een pipet en verwijdert u vervolgens de incubatiekamer voor glazen platen.
Was de glazen plaat in PBST-buffer en gedeïoniseerd water. Draai vervolgens de glazen plaat bij 2000 maal zwa
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een modulair chemo-enzymatische aanpak voor het synthetiseren van N-glycanen op met aluminiumoxide beklede glazen slides, wat glycan-microarray-toepassingen mogelijk maakt. De methodologie wordt gedemonstreerd door het profileren van een HIV-breed neutraliserend antilichaam, waarbij het potentieel in glycobiologie wordt aangetoond.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Glycobiologie
- Immunologie
- Microarray-technologie
Achtergrond
- N-glycanen spelen een cruciale rol in cel-virusinteracties.
- Het begrijpen van glycan-bindpatronen kan helpen bij het diagnosticeren van virale infecties.
- Huidige methoden detecteren mogelijk niet effectief zwakke bindinginteracties.
- Glycan-microarrays kunnen inzichten bieden in antilichaamspecificiteit.
Doel van het onderzoek
- Om een nieuwe methode te ontwikkelen voor het synthetiseren van N-glycanen.
- Om een glycan-microarray te maken voor het detecteren van HIV-antilichaaminteracties.
- Om de implicaties te verkennen voor het diagnosticeren van andere virale infecties en kankers.
Gebruikte methoden
- Chemo-enzymatische synthese van N-glycanen.
- Constructie van glycan-microarrays op ACG-slides.
- Profilering van HIV-breed neutraliserende antilichamen.
- Analyse van glycan-bindpatronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese van N-glycanen voor microarray-toepassingen.
- Gedemonstreerde detectie van zwakke bindinginteracties.
- Geïdentificeerde specifieke glycan-patronen geassocieerd met HIV-antilichamen.
- Mogelijke toepassingen voor het diagnosticeren van influenza en kankers.
Conclusies
- De modulaire aanpak verbetert de synthese van N-glycanen.
- Deze techniek kan de begrip van glycanspecificiteit verbeteren.
- Het belooft brede toepassingen in diagnostica.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This chemo-enzymatic N-glycan synthesis method enables rapid generation of diverse glycan libraries for microarray-based antibody profiling, addressing a critical gap in detecting weak and heterogeneous glycan-protein interactions relevant to HIV vaccine design. By facilitating the analysis of hetero-ligand binding behaviors of broadly neutralizing antibodies like PG9, the approach supports mechanistic de-risking in early immunogen discovery and improves predictive confidence in antigen selection. The modular strategy provides a scalable, reusable platform for epitope mapping and target validation across infectious disease and oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping glycan-specific antibody interactions that inform target relevance and mechanism of action.
- Operational Value: Supports biological de-risking through systematic profiling of hetero-ligand binding patterns on defined glycan arrays.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying glycan motifs associated with potent neutralizing activity, guiding immunogen design decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces covalently attached, structurally diverse N-glycans on aluminum oxide-coated glass slides, creating standardized microarrays for reliable compound and antibody screening.
- Quantitative Output: Enables detection of weak binding interactions through fluorescent readouts, providing measurable affinity and specificity data for hit validation.
- Platform Reuse: The modular synthesis strategy allows rapid regeneration of glycan libraries, supporting iterative screening campaigns and cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly supports translational biomarker discovery by linking specific glycan structures (e.g., Man5GlcNAc2 and di-sialylated bi-antennary N-glycans) to HIV antibody binding phenotypes.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a defined glycan system to assess antibody efficacy and specificity prior to in vivo testing.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing off-target or weak-binding glycan interactions that may indicate reduced therapeutic potential or safety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early target validation through lead identification, enabling glycan-dependent antibody characterization that informs downstream preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining glycan epitopes recognized by HIV broadly neutralizing antibodies, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers assay-ready glycan microarrays with high reproducibility and quantitative readouts, enabling reliable evaluation of antibody-glycan interactions across large libraries.
- Analytics: Generates binding signal data (e.g., fluorescence intensity) that allows comparative analysis of homo- and hetero-glycan binding, facilitating structure-activity relationship mapping.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying glycan-specific antibody profiles that can be correlated with functional neutralization and used to guide immunogen optimization.
- Enterprise Reuse: The chemo-enzymatic modular approach is adaptable across targets, allowing reuse of the synthesis and array fabrication workflow for multiple antibody discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycan-dependent antibody recognition.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through covalent glycan attachment and controlled array fabrication on ACG slides.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid glycan library generation and reducing reliance on external synthesis or fragmented screening efforts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-binding phenotypes linked to potent neutralization, informing advancement decisions in vaccine and therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate chemistry, enzymatic synthesis, and microarray handling to ensure proper glycan modification and array quality.
- Depends on instrumentation for rotary evaporation, polyacrylamide gel electrophoresis, and array scanning with specific wavelength and PMT settings.
- Necessitates cross-team standardization of glycan solution preparation, printing concentrations, and antibody incubation protocols to maintain inter-assay consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different glycan targets or antibody classes, particularly in linker chemistry and surface immobilization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for freshly anodized slides and careful handling of toxic reagents during phosphonate linker coupling and hydrogenation steps.
