Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen
July 11th, 2017
Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.
Het algemene doel van deze procedure is om herhaaldelijk en consistent ruggenmergneuronen te kunnen isoleren die kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid aan experimenten. Deze methode kan ons inzicht geven in de biologie van ruggenmergneuronen en hopelijk hun reactie op verschillende stressoren begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van een aanzienlijk aantal neuronen mogelijk maakt, waardoor die neuronen in een breed scala aan experimenten kunnen worden gebruikt.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de tritureringstap waarbij neuronen mechanisch van het weefsel worden geïsoleerd, enige tijd nodig heeft om onder de knie te krijgen, om een gezonde isolatie van neuronen te garanderen zonder ze te doden. Om deze procedure te beginnen, scheidt u het hoofd van de lichamen van de geëuthanaseerde muisjes, met behulp van een schaar. Stabiliseer vervolgens de staart en armen op de proceduretafel met de dorsale zijde naar boven.
Snij vervolgens de huid eraf met behulp van de gebogen irisschaar. Snijd daarna het ruggenmerg vanuit de lumbale regio, net boven de heupen en snijd vervolgens beide zijden van de thorax om het van het lichaam te scheiden. Was de monsters sequentieel in drie 10 centimeter petrischalen, elk met vijf milliliter gesteriliseerde PBS gedurende 10 seconden, om overtollig weefsel te verwijderen.
Vervolgens, breng een 22 gauge naald en spuit gevuld met vijf milliliter gesteriliseerde PBS in het caudale uiteinde van de wervelkolom en spoel craniaal, zodat het ruggenmerg in een vierde petrischaal terechtkomt. Breng het ruggenmerg over in een 15 milliliter buis met vijf milliliter HABG op ijs. Vermijd het verpletteren van het ruggenmerg en herhaal de procedures voor de rest van de muisjes.
Idealiter zou dit proces niet meer dan 30 minuten moeten duren voor één groep muisjes, om de isolatie van neuronen te garanderen. Om de dichtheidsgradiënt voor te bereiden, bereidt u elk van de vier lagen in vier 15 milliliter buizen. Voeg vervolgens één milliliter van elke laag toe aan een nieuwe 15 milliliter buis.
Begin met laag één aan de onderkant en voeg sequentieel toe tot u laag vier aan de bovenkant bereikt. Vermijd het verstoren van de lagen tijdens het toevoegen en alle krachtige bewegingen die kunnen leiden tot vermenging. Voeg vervolgens het verteringsmedium toe aan het vermalen weefsel.
Plaats het monster in een shaker in het waterbad op 30 graden Celsius. Vervolgens, verwijder het weefsel uit het waterbad en laat het een paar minuten bezinken. Om triturering uit te voeren, aspireer het overtollige verteringsmedium.
Suspendeer het weefsel in twee milliliter HABG, gebruik een smalle buis en tritureer 10 keer in 45 seconden en vermijd het binnenbrengen van lucht, omdat dit de levensvatbare opbrengst aanzienlijk zou verminderen. Triturering is een van de meest cruciale stappen van de procedure, het weefsel moet voorzichtig in en uit de met vuur gepolijste pijp worden getrokken, overtollig geweld vermijden wat kan leiden tot neuronale dood of te zacht, wat zou resulteren in een lage opbrengst. Hierna aspireert u de bovenste twee milliliter van de supernatant en brengt deze over in een nieuwe 15 milliliter buis met de aanduiding, verzamel.
Herhaal de verzamelprocedures nog twee keer, om zes milliliter supernatant te verkrijgen. Vervolgens, breng de inhoud van de verzamelbuis langzaam over in de eerder voorbereide gradiëntbuis. Vermijd de verstoring van de gradiënt.
Om de neuronen te zuiveren, centrifugeert u de gradiëntbuis gedurende 15 minuten bij 800 keer G, bij 22 graden Celsius. Verzamel de gewenste lagen en breng ze over in een nieuwe 15 milliliter buis. Voor de hoogste zuiverheid van neuronisolatie, verzamel laag drie.
Voor meer opbrengst met minder zuiverheid, verzamel lagen twee tot drie. Verdun vervolgens de dichtheidsgradiënt door vijf milliliter HABG toe te voegen aan de nieuw verzamelde lagen. Centrifugeer het bij 200 keer G gedurende twee minuten bij 22 graden Celsius.
Na twee minuten, gooit u de supernatant weg en suspendeert u de cellen in vijf milliliter HABG, door te tikken met de spatel. Centrifugeer vervolgens het monster weer bij 200 keer G gedurende twee minuten bij 22 graden Celsius. Gooi vervolgens de supernatant weg en suspendeer de cellen in drie milliliter neurobasaal medium, door te tikken met de spatel.
Bepaal daarna de celdichtheid met behulp van een celteller en verdun vervolgens de suspensie tot 300.000 cellen per één milliliter neurobasaal medium. Schud voorzichtig om de cellen en oplossing te verdelen en voeg één milliliter van het monster toe aan elke put in de gecodeerde 24-putten platen. Hier is de tijdsverloop van de neuronen in cultuur te zien, na het zaaien op de putten.
De cellen zullen zich meestal binnen de eerste paar uur aan het oppervlak hechten. Axonen zullen binnen de eerste 24 tot 48 uur beginnen te ontkiemen, verbindingen tussen verschillende neuronen en cultuur, bereiken meestal volwassenheid na zeven dagen, waarna experimenten meestal op de neuronen worden uitgevoerd. In deze figuur wordt nucleaire kleuring weergegeven in blauw, met cytoplasmatische kleuring in groen en hier wordt het neurologische cytoskeletal-eiwit microtubulaire geassocieerde eiwit twee gekleurd, waardoor de contouren en axonprojecties van de neuronen na een week in cultuur worden weergegeven.
De samengevoegde afbeeldingen tonen de relatieve abundantie van de neuronen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie tot vier uur worden uitgevoerd, als het goed wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling van deze techniek, baant het de weg voor onderzoekers die de fysiologie en pathologie van het ruggenmerg bestuderen, om het gedrag van ruggenmergneuronen onder normale omstandigheden en als reactie op farmacologische middelen of stressoren zoals zuurstof- en glucosedeprivatie te onderzoeken, waardoor onze chirurgische procedures worden nagebootst.
Wanneer u deze procedure uitvoert, is het belangrijk om het vertragen of verlengen van een van de stappen te vermijden om de isolatie
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen uit WT neonatale muizen, met focus op de dissectie van het ruggenmerg en de scheiding van neuronen door mechanische en enzymatische methoden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurobiologische technieken
Achtergrond
- De isolatie van ruggenmergneuronen is cruciaal voor verschillende experimentele toepassingen.
- Begrip van neuronbiologie kan inzichten bieden in hun reacties op stressoren.
- Beheersing van de trituratiestap is essentieel voor gezonde neuronisolatie.
- Visuele demonstraties verbeteren het leren van deze complexe techniek.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van ruggenmergneuronen.
- Om experimenten te vergemakkelijken die neuronbiologie onderzoeken.
- Om het begrip van neuronale reacties op verschillende stressoren te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van het ruggenmerg van neonatale muizen.
- Mechanische en enzymatische splitsing om neuronen te scheiden.
- Zorgvuldige behandeling om neuronlevensvatbaarheid te waarborgen.
- Visuele hulpmiddelen om het trituratieproces te demonstreren.
Belangrijkste resultaten
- Een aanzienlijk aantal neuronen kan worden geïsoleerd met behulp van deze techniek.
- De methode maakt consistente en herhaalbare isolatie van neuronen mogelijk.
- Gezonde neuronen kunnen worden verkregen voor verschillende experimentele toepassingen.
- Visuele demonstraties helpen bij het beheersen van de techniek.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek is effectief voor het isoleren van ruggenmergneuronen.
- Het biedt een basis voor verder onderzoek naar neuronbiologie.
- Beheersing van de methode kan leiden tot verbeterde experimentele resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and culture of spinal cord neurons from neonatal mice enables high-fidelity in vitro models for early neurobiology discovery and mechanistic de-risking. This capability supports predictive confidence in target validation and functional screening for neurodegenerative and neuroregenerative research portfolios. Consistent neuron yield and viability underpin scalable assay development and translational continuity across preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal response to pharmacological agents and stressors in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary neuron cultures for pathway analysis.
- Facilitates functional target validation through reproducible neuron isolation and culture.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-yield neuron preparations for quantitative assay development.
- Ensures reproducibility and scalability for compound screening and phenotypic analysis.
- Delivers validated neuronal systems suitable for downstream high-content or functional assays.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of disease-relevant neuronal responses to injury or deprivation in vitro.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo preclinical models for translational biomarker exploration.
- Reduces biological risk by providing continuity from discovery through preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
This neuron isolation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuronal pathways and stress responses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Enables measurement of neuronal viability, maturation, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights with in vivo preclinical models when aligned with disease context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurobiology and pharmacology studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible neuron preparations for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in neonatal dissection and trituration for optimal neuron viability.
- Needs access to sterile instrumentation, density gradient materials, and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of isolation and culture steps for reproducibility.
- Adaptation may be necessary for different mouse strains or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to timing and handling, impacting downstream assay reliability.
