Name: Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van ruggenmergneuronen uit neonatale muizen met mechanische en enzymatische methoden. Deze techniek biedt betrouwbare resultaten voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs hebben geen erkenningen.

De zorg en behandeling van dieren in deze procedure zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee aan de Universiteit van Colorado. 1. Oplossingen voorbereiden <ol><li> Bereid alle oplossingen op bij passende temperaturen, zoals weergegeven in tabel 1 . </li></ol> 2. Coating Wells en Slides OPMERKING: Neurons houden zich niet goed aan plastic of glasoppervlakken. <ol><li> Een dag voorafgaand aan de isolatie van de neuronen, bedek de putjes van een steriele kweekplaat met 24 putjes met 0,5 ml Poly-D-Lysine (PDL; Tabel 2 ) en laat het in een laminair stromende kap O / N. OPMERKING: De voorkeursmethode is om platen met 24 putjes te gebruiken en alleen de middelputten te bekleden, aangezien verdamping van de perifere putjes meestal versneld is en tot inconsistente resultaten leidt. Daarnaast kunnen glazen glijbanen in de putjes geplaatst wordenO coating. De neuronen hangen aan de gecoate glazen glijbanen en kunnen later worden verwijderd voor verdere microscopische afbeeldingen . </li><li> Verwijder de PDL van de putjes op de dag van isolatie. Wassen met steriel water voor een paar minuten voordat u nog resterend water verwijdert en laat het gedurende 1 uur drogen (zie hieronder). </li><li> Na het drogen, bedek de dia&#39;s met laminine ( tabel 2 ). OPMERKING: Ongeveer 10 μL laminine (10 μg / μl) is voldoende om elke put van een steriele 24-putjesplaat te bekleden. Dit wordt gemengd met 340 μL medium (totaal volume: 350 μl) om de hele put te bedekken. Laat dit gedurende 2 uur bij RT in een kweekkap zitten en daarna aspireren voordat u de cellen bekleedt. </li></ol> 3. Het oogsten van de wervelkolom OPMERKING: Alle instrumenten moeten voor steriliteit geautoclaveerd worden (135 ° C en 30 psi voor 4 x 7 min cycli). <ol><li> Euthanize 1-3 dag oude C57BL / 6 muispups in een kamer met isofluraan. Wacht30 s na het stoppen van de beweging en knijp het been om een ​​gebrek aan reactie te bevestigen. </li><li> Scheep het hoofd van het lichaam met behulp van een schaar, met een pup in de slechte positie. </li><li> Stabiliseer de achterpoten of staart en armen op de procedure tafel, met de rugzijde naar de gebruiker gericht. </li><li> Knip de huid af met behulp van gebogen iris schaar. </li><li> Knip het ruggenmerg van het lumbale gebied net boven de heupen en ga door om beide zijden van de thorax te snijden om het van het lichaam af te scheiden. OPMERKING: dit vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van viscerale organen om onopzettelijke schade aan andere organen te vermijden ( figuur 1a ). </li><li> Was achtereenvolgens gedurende 10 seconden in 3 x 10 cm Petri-schotels die 5 ml 0,2 μm filtergesteriliseerde Fosfaatbufferde Saline (PBS) bevatten om overtollig weefsel te verwijderen. </li><li> Plaats een 22 G-naald en een spuit gevuld met 5 ml met filtergesteriliseerde PBS in het caudale uiteinde van de wervelkolom en spoel craniaal, zodat het koord tO Uitgang in een vierde Petri schotel ( figuur 1b ). </li><li> Verzamel het ruggenmerg in een 15 ml buis met 5 ml HABG ( Tabel 1 ) op ijs. Wees voorzichtig om het ruggenmerg te vermijden. </li><li> Herhaal stap 3.1-3.8 voor elke pup in het nest. OPMERKING: Ideaal gezien dient dit proces minder dan 30 minuten per ruggenmerg te nemen om een ​​gezond neuronisolatie te waarborgen. </li></ol> 4. Isolerende Neuronen OPMERKING: De volgende stap moet uitgevoerd worden in een laminaire stroomkap. Bekendheid met basis steriele techniek wordt verwacht. <ol><li> Tissue Mincing <ol><li> Neem de buis die de wervelkolom bevat en schud licht om het weefsel op te schorten. </li><li> Giet weefsel uit de buis in een 60 mm glas Petri-schotel en dobbelstenen met een scheermesje om fijne stukjes van 0,5 mm te maken. </li><li> Breng het weefsel over met een brede boorpipet in een 15 ml buis die 5 ml HABG bevat. </li><li> Plaats het in een30 ° C waterbad gedurende 30 minuten om de cellen te kunnen evenwaren bij deze temperatuur. Houd de cellen op een shaker net genoeg om ze in de vloeistof te laten ophangen. OPMERKING: Deze stap is gedaan om de cellen niet te schokken bij overdracht van ijs naar het spijsverteringskanaal. Door de cellen bij 30 ° C te houden, wordt de dood van de cel geassocieerd met een verhoogde stofwisseling bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Bereid het verteringsmedium op ( Tabel 1 ). </li><li> Bereid de dichtheidsgradiënt op (Tabel 1). <ol><li> Bereid elk van de 4 lagen op in 4 aparte 15 ml buizen, zoals beschreven in tabel 1 . </li><li> Voeg 1 ml van elke laag in een nieuwe 15 ml buis. Begin met laag 1 onderaan en volg opeenvolgend totdat u laag 4 bovenaan bereikt. Vermijd storing van de lagen tijdens het toevoegen van. </li></ol></li><li> Was de PDL-beklede platen uit stap 2.2. Wassen met steriel water voor een paar minuten voordat u nog resterende water verwijdertWaardoor ze gedurende 1 uur drogen. </li><li> Breng het weefsel over naar het verteringsmedium. <ol><li> Verwijder de weefsel bevattende buis uit het waterbad van de shaker bij 30 ° C en laat het een paar minuten afspreken. </li><li> Verwijder de spijsverteringskanaalbuis uit het waterbad van 37 ° C en aspireer het in een leurslotspuit. </li><li> Aspiratie van de overmaat HABG uit de weefsel bevattende buis. </li><li> Gebruik een leur-lock 0.2 μm filter op de injectiespuit om het verteringsmedium aan de weefsel bevattende buis toe te voegen. </li><li> Plaats de buis gedurende 30 minuten in een 30 ° C waterbad. Houd de cellen net zo schudden dat ze in de vloeistof kunnen worden gesuspendeerd. OPMERKING: Het is belangrijk om de cellen niet te lang in het verteringsmedium te houden of de temperatuur te hoog te laten, wat kan leiden tot overmatige vertering en resulteren in het weefsel in een gelatinezuurmengsel worden gesuspendeerd. </li></ol></li><li> Over deze periode bedek de laminine zoals in stap 2.3. </li> &lt;Li&gt; Trituratie uitvoeren ( dwz scheiding van de cellen uit het weefsel). <ol><li> Verwijder de buis uit het schuddenbad van 30 ° C en laat het een paar minuten afspreken. </li><li> Aspireren overtollig digestiemiddel. </li><li> Schud het weefsel in 2 ml HABG op. </li><li> Gebruik een smalle boringpipet, 10 x voor 45 s. OPMERKING: Dit is waarschijnlijk de enige cruciale stap en kan de opbrengst aanzienlijk verminderen indien niet goed gedaan. <ol><li> Aspirateer het weefsel in het pipet en laat de inhoud onmiddellijk leeg. </li><li> Vermijd het introduceren van lucht, omdat het de levensvatbare opbrengst aanzienlijk zal afnemen. OPMERKING: De ideale pipet is een glazen pipet van 9 inch. Het uiteinde van de pipet moet met vuur gepolijst worden om ruwe oppervlakken glad te vegen. Vervolgens moet het siliconen worden door plaatsing in een 1:20 oplossing van dichloordimethylsilaan (DMDCS) in chloroform en links O / N. De pipet moet dan verwijderd worden en de lucht laten drogen. Vervolgens is het pipetjeMoet geautoclaveerd worden voor sterilisatie. Let op: DMDCS en chloroform zijn zeer ontvlambaar, en siliconen moet in een afzuigkap worden uitgevoerd. </li></ol></li><li> Aspireren de bovenste 2 ml supernatant en plaats het in een nieuwe 15 ml buis met de label &quot;collectie&quot;. </li><li> Herhaal stappen 4.7.3-4.7.5 nog twee keer (de cel verzamelt buis moet 6 ml aan het einde hebben). </li><li> Verplaats de inhoud van de collectiebuis langzaam in de gradiëntbuis die in stap 4.2 is voorbereid, om de verstoring van de gradiënt te vermijden. </li></ol></li><li> Op dit punt verwijder het eerder bereide neurobasale medium ( Tabel 1 ) uit de koelkast en laat het verwarmen in een bad van 37 ° C. </li><li> Zuiver de neuronen. <ol><li> Centrifugeer de gradiëntbuis gedurende 15 minuten bij 800 xg en 22 ° C. </li><li> Verzamel de gewenste laag (en) met een pipet ( Figuur 2 ) en plaats een nieuwe 15 ml buis. Voor de neuro met de hoogste zuiverheidN isolatie ( dwz &gt; 90%), verzamel laag 3. Voor meer opbrengst met minder zuiverheid ( dwz &gt; 70-80%), verzamel lagen 2 en 3. </li><li> Verdun de dichtheidsgradiënt uit door 5 ml HABG toe te voegen aan de nieuw verzamelde lagen. </li><li> Centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 min bij 22 ° C. </li><li> Gooi de supernatant weg, zet opnieuw op in 5 ml HABG en flip de pellet om de cellen op te schorten. </li><li> Centrifugeer gedurende 2 minuten 200 xg bij 22 ° C. </li><li> Verwijder de supernatant, resuspendeer in 3 ml neurobasaal medium en flip de pellet om de cellen te resuspenderen. </li></ol></li><li> Tel de cellen. <ol><li> Neem 10 μL van de oplossing, nu met cellen in neurobasaal medium, en meng met 10 μL Trypan Blue. </li><li> Plaats 10 μl van dit mengsel in een glazen tellerkamer. </li><li> Tellen het aantal cellen in elk van de vier 4 x 4 kwadranten met behulp van een standaard glas teltkamer. Voeg alle cellen geteld (n), multi toeVerdubbelen met 2 (verdunningsfactor), verdeel met 4 (aantal kwadranten geteld), vermenigvuldigd met 3 (volume neurobasaal medium) en vermenigvuldigd met 10 4 om de concentratie van cellen in cellen / ml te verkrijgen. <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> Zaad de cellen op cultuurplaten <ol><li> Verdun de cel suspensie naar 300.000 cellen in 1 ml neurobasaal medium. OPMERKING: Op basis van de concentratie van cellen verkregen in de bovenstaande stappen wordt extra neurobasaal medium toegevoegd om een ​​uiteindelijke concentratie van 3 * 10 5 cellen / ml te verkrijgen. De vergelijking is C1V1 = C2V2, waarbij Ci de initiële concentratie van cellen is die uit de oogst zijn verkregen; V1 is 3 ml; En C2 is 3 * 10 5 cellen / ml, zoals hierboven besproken. De vergelijking is opgelost voor V 2 . Voeg het volume neurobasaal medium toe dat nodig is om het totale volume cellen in oplossing gelijk te makenV 2 . </li><li> Schud zachtjes om de cellen in oplossing te verdelen en voeg 1 ml toe aan elke put in de gecoate 24-putjesplaten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Qayumi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+investigation+of+spinal+cord+injury+caused+by+aortic+cross-clamping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping.</a> J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).</li>
<li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li>
<li>Taira, Y., Marsala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proximal+arterial+perfusion+pressure+on+function%2C+spinal+cord+blood+flow%2C+and+histopathologic+changes+after+increasing+intervals+of+aortic+occlusion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat.</a> Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+the+simultaneous+preparation+of+primary+neuronal+cultures+of+the+neocortex%2C+hippocampus+and+cerebellum+from+individual+newborn+%28P0.+5%29+C57Bl%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice.</a> J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Graber, D. J., Harris, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+culture+of+spinal+motor+neurons+from+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).</li>
<li>Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+motor+neurons+from+the+newborn+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Prot%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord.</a> Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).</li>
<li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li>
<li>Su, M., Zhong, W., Ren, S. <a target="_blank" href="https://www.ajol.info/index.php/tjpr/article/view/139098">Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats.</a> Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).</li>
<li>Haapanen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+ischemic+preconditioning+protects+the+spinal+cord+against+ischemic+insult%3A+An+experimental+study+in+a+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).</li>
<li>Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+complications+after+thoracic+aortic+surgery%3A+long-term+survival+and+functional+status+varies+with+deficit+severity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity.</a> J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Wong, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+spinal+cord+deficits+after+thoracoabdominal+aortic+aneurysm+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair.</a> Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).</li>
<li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-2+agonist+attenuates+ischemic+injury+in+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons.</a> J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+protection+via+alpha-2+agonist-mediated+increase+in+glial+cell-line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen bekendmakingen.

Deze techniek zorgt voor de betrouwbare cultuur van de ruggengraat neuronen. Zodra de vaardigheid in de techniek is bereikt, duurt het ongeveer 3,5 uur om te voltooien. We hebben in ongeveer 4 uur de isolatie van neuronen uit 2 afzonderlijke nestjes (16 muizen totaal) kunnen uitvoeren. De belangrijkste stap in haalbaarheid is om de ruggengraatjes van de muizen op een goede manier te kunnen extraheren. De opbrengst zorgt voor het platen van meerdere putjes en voor het vermogen om de neuronen onder verschillende omstandig...

<html> Het begrijpen van ruggengraatpatologie vereist het gebruik van verschillende modellen, zowel op macroscopische als microscopische niveaus. Grote en kleine dierenmodellen 1 , 2 , 3 worden gebruikt voor in vivo onderzoeken naar ruggengraatziekte en letsel. Terwijl het bestuderen van deze problemen in vivo zijn voordelen heeft, is de analyse van het ruggenmerg beperkt tot het gehele ruggenmerghomogenaat of aan weefselafdelingen 4 . Dit zorgt voor een beetje dubbelzinnigheid bij het proberen om specifieke reacties en doelen in het ruggenmerg tussen zijn inwendige neuronen en omliggende glia te isoleren. De toenemende beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde muizen zorgt voor meer gedetailleerde onderzoeken van de biologie op cellulaire en moleculaire niveaus. Zo wordt hier een neonataal muismodel gebruikt, waarmee in vitro de unieke eigenschappen en biologie van ruggengraatneuronen kunnen worden onderzocht. Ent &quot;&gt; Het isoleren en onderhouden van neuronen in vitro is niet bijzonder eenvoudig. Er is een relatief groot aantal technieken voor neuronisolatie van het corticale weefsel van volwassen knaagdieren die lijken te leiden tot een aanzienlijk aantal geïsoleerde neuronen (dat wil zeggen miljoenen) 5 , 6 , 7. In tegenstelling is de opbrengst van neuronen van het ruggenmergweefsel lager 8 , 9 , 10 , mede door de kleinere massa weefsel. Verder is er bij muizen een relatief lage mate van technieken voor de isolatie van neonatale Ruggenmergneuronen, en bestaande methoden worden beperkt door lagere neuronopbrengsten ( dwz honderden) 9 of moeizame en resourcezware technieken die de isolatie van embryonale muizen vereisen 10 . In dit protocol, wijGebruik een techniek die het mogelijk maakt om een ​​kostbare en resource-effectieve isolatie van een aanzienlijk aantal neuronen uit de ruggenmergen van neonatale muizen mogelijk te maken. Zoals gebruikelijk bij eerder gepubliceerde technieken, gebruiken we papain als enzymatisch protease, waardoor neuronen uit het ruggengraatweefsel 5 , 6 vrijkomen. Daarnaast gebruiken we een dichtheidsgradiënt voor verfijnde celscheidingen, die eerder bleek effectief te zijn 6 , 10 . Terwijl het medium waarin de cellen geïncubeerd zijn, kunnen verschillen, in onze ervaring en zoals eerder gepubliceerd 11 , is de aanvulling met vers B27-kweekmedium supplement essentieel voor de lange levensduur van de neuron. De neuronen zijn meestal levensvatbaar voor maximaal 10 dagen, waardoor de behandeling kan worden uitgevoerd.

<table><tbody><tr><td>Hibernate A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr><tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 Supplement 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>Papain, Lyophilized - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobasal A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Mouse Laminin - 1 mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Trypan Blue - 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Glass Pippette - 9"</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Pipette bulb - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&amp;region=US&amp;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&reg;&nbsp;Petri dish, glass - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Sterile 24-Well Cell Culture Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td></tr><tr><td>NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>Na het fixeren in paraformaldehyde (PFA) en blokkeren met 5% BSA, werden cellen op een dekselglas van 12 mm gedurende 18 uur bij 4 &deg;C in de antistof verdund 1:200 geïncubeerd</td></tr><tr><td>MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>Na het fixeren in paraformaldehyde en blokkeren met 5% BSA, werden cellen op een dekselglas van 12 mm gedurende 18 uur bij 4 &deg;C in de antistof verdund 1:500 geïncubeerd</td></tr></tbody></table>

spinal cord neurons isolatie en cultuur van neonatale muizen

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Wij presenteren een protocol voor de isolatie en de cultuur van de ruggengraat neuronen. De neuronen worden verkregen uit neonatale C57BL / 6 muizen en zijn geïsoleerd op postnatale dag 1-3. Een muis rommel, meestal 4-10 pups geboren uit een fokpaar, is verzameld voor een experiment, en wervelkoorden worden individueel van elke muis verzameld na euthanasie met isofluraan. De wervelkolom wordt uitgescheiden en vervolgens wordt het ruggenmerg uit de kolom vrijgegeven. De ruggenmergen worden vervolgens gehakt om het oppervlaktegebied van een enzymatische protease te verhogen waardoor de neuronen en andere cellen uit het weefsel vrijkomen. Trituratie wordt dan gebruikt om de cellen in oplossing te laten lossen. Deze oplossing wordt vervolgens gefractioneerd in een dichtheidsgradiënt om de verschillende cellen in oplossing te scheiden, waardoor neuronen geïsoleerd worden. Ongeveer 1-2,5 x 10 6 neuronen kunnen geïsoleerd worden uit één nestgroep. De neuronen worden dan geplant op putjes die met lijm facto zijn bedektRs die zorgen voor een goede groei en rijping. De neuronen duurt ongeveer 7 dagen om volwassenheid te bereiken in het groei- en kweekmedium en kan daarna worden gebruikt voor behandeling en analyse.

Met behulp van deze techniek kan een enkel nest (4-10 pups) de isolatie van 1-2,5 10 6 neuronen die geschikt zijn voor het zaaien op cultuurplaten. Typisch worden 4-8 putjes geplant bij de hierboven genoemde concentratie ( dwz 300.000 cellen / ml). Figuur 3 toont het uiterlijk van neuronen bij deze concentratie na een week in de cultuur bij lage ( a ) en hoge ( b ) vergrotingslichtmicroscopie. We hebben e...

Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Het algemene doel van deze procedure is om herhaaldelijk en consistent ruggenmergneuronen te kunnen isoleren die in diverse experimenten kunnen worden gebruikt. Deze methode kan ons een beter inzicht verschaffen in de biologie van ruggenmergneuronen en hopelijk helpen bij het begrijpen van hun reactie op verschillende stressfactoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van een aanzienlijk aantal neuronen mogelijk maakt, waardoor deze neuronen in een breed scala aan experimenten kunnen worden ingezet.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de trituratiestap waarbij neuronen mechanisch uit het weefsel worden geïsoleerd, enige tijd vergt om onder de knie te krijgen, om zo de isolatie van gezonde neuronen te waarborgen zonder ze te doden. Om deze procedure te starten, scheidt u de kop van het lichaam van de geëuthanaseerde muizenpups met een schaar. Stabiliseer vervolgens de staart en de armen op de proceduretafel met de dorsale zijde naar boven.Verwijder vervolgens de huid met de gebogen irisschaar. Snijd daarna het ruggenmerg door in de lumbale regio, net boven de heupen, en snijd vervolgens aan beide zijden van de thorax om de

spinal-cord-neurons-isolation-and-culture-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een demonstratie van de isolatie van neonatale muis ruggenmerg voor elektrofysiologische studies.

Spinal Cord Elektrofysiologie

Een alternatieve manier van isoleren van muis embryonale motorneuronen van het ruggenmerg wordt beschreven. De methode houdt rekening met het feit dat de lectine kan binden aan de lage affiniteit zenuw groeifactor receptor p75NTR. Deze lectine-based preplating kan een zuivering vergelijkbaar met die met een specifiek antilichaam tegen de p75NTR.

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Source: Eldeiry, M. et al. Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (2017)In this video, we describe a step-by-step protocol for isolating spinal cord neurons from a neonatal mouse for in vitro studies.

Spinal Cord Neuron Isolation: A Density Gradient Procedure to Isolate Neonatal Spinal Cord Neurons for In Vitro Studies

The video demonstrates the isolation of oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons from a transgenic mouse embryo. The embryo expresses motor neurons labeled with a green fluorescent protein (GFP) for easy visualization and identification. The motor neurons are surgically isolated under a fluorescence microscope and maintained in a culture medium.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

This video demonstrates a technique for isolating and culturing primary mixed glial cells from adult mouse spinal cord tissue. The protocol involves enzymatic digestion of the tissue, followed by the removal of broken cell membranes and myelin debris to obtain a single-cell population. The cells are then cultured in media optimized for mixed glial cell growth.

Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Leer de isolatie en cultuur van ruggenmergneuronen uit neonatale muizen met mechanische en enzymatische methoden. Deze techniek biedt betrouwbare resultaten voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

Meer video's verkennen