Name: Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer het herstel van infectieus Zika-virus uit een tweedelige cDNA-kloon. Deze methode biedt inzicht in flavivirussen en kan worden toegepast op andere virale systemen die moeilijk te klonen zijn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic en Claudia Rückert bedanken voor hun hulp bij het karakteriseren van het kloon afgeleide virus. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, NIH onder subsidies AI114675 (BJG) en AI067380 (GDE).

1. Transformatie en herstel van infectieuze klonenplasmiden <ol><li> Transformeer beide plasmiden (afzonderlijk) met behulp van een commercieel transformatie protocol ( bijv . NEB 5 Minute Transformation Protocol) met enkele wijzigingen. Beide plasmiden bevatten een gen dat codeert voor ampicilline resistentie. Gebruik daarom ampicilline of carbenicilline voor selectie. Carbenicilline heeft de voorkeur, aangezien het stabieler is. <ol><li> Verwijder cellen (zie Materialetafel) van -80 ° C vriezer en doei op ijs gedurende 5-10 minuten. Prewarm lysogeny bouillon (LB) (bevattende 10 g / L NaCl en 25 μg / ml carbenicilline, genaamd LB-carb) platen en de bouillon met cataboliet-repressie (SOC (zonder antibiotica) - bij de cellen komen) bij 37 ° C. </li><li> Voeg tussen 100 pg-10 ng in 1 μl plasmide-DNA toe aan een buis die 50 μl bevoegde cellen bevat; Meng zachtjes door de buis te vlotten. </li><li> Incubeer buizen op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Warmte schokbuizen bij 42 ° C gedurende 30 sIn een waterbad. Ga 2 uren terug naar ijs onmiddellijk na warmteschok. </li><li> Pipet 950 μL kamertemperatuur SOC in elke buis en meng door pipettering. Spreid 100 μl van het bacteriemengsel op een LB-carboplaat en incubeer overnacht bij 37 ° C (ongeveer 12-14 uur). </li></ol></li><li> Verwijder platen uit 37 ° C incubator na 12-14 uur incubatie. Plaats platen in een donkere lade bij kamertemperatuur om de kolonies te laten groeien (ongeveer 8-9 uur). </li><li> Met 5 ml geweldige bouillon (TB, die 25 μg / ml carbenicilline, genaamd TB-carb) bevat, groeien 5-10 kleine kolonies voor elk plasmide &#39;s nachts bij 30 ° C in een bacteriële shaker (ongeveer 14-16 uur). OPMERKING: Kleine kolonies zijn een indicator dat het plasmide intact is; Kolonies met plasmiden die deleties, herrangschikkingen of mutaties bevatten (hierin genaamd instabiliteitsgebeurtenissen) zullen sneller groeien en dus groter zijn. Daarom moet men proberen om de kleinste kolonies op het bord te kiezen, specifiek neeT selecteren van de grootste kolonies die aanwezig zijn. Sommige middelgrote kolonies kunnen ook worden geselecteerd voor volledigheid. De lagere temperatuur gebruikt vermindert de kans dat de cellen zullen overwegen (OD 600 van meer dan 0,6-0,8). Aangezien de meeste onderzoekers overnacht groeien, zorgt het voor meer controle en verminderde kans op overgroei. </li><li> Controleer vloeibare culturen voor turbiditeit (ongeveer OD 600 van 0,6-0,8). Plaats een onbeweeglijke buis bij 4 ° C en laat andere buizen doorbroken worden door langer te groeien. OPMERKING: Bacteriën niet groeien op OD 600 waarden die groter zijn dan aanbevolen, aangezien de instabiliteitsgebeurtenissen van het plasmide kunnen optreden. </li><li> Extract plasmide DNA uit bacteriën met een commerciële plasmide miniprep kit (zie Material Table). Vervolgens in 15 μl voorverwarmde (tot 70 ° C in een verwarmingsblok) elutiebuffer. Laat de elutiebuffer 5 minuten voor de centrifugering op de kolom inkuberen. OPMERKING: Bewaar tenminste 1 ml van deze starterkweek bij 4 ° C voorVerder gebruik in de volgende stap. </li><li> Digest 10 μL van de herstelde plasmiden om te beoordelen of plasmid instabiliteitsgebeurtenissen tijdens de cultuur plaatsvonden. OPMERKING: Digest p1 met SalI / NheI en p2 met BamHI / HindIII bij 37 ° C gedurende 1 uur. Bevestig de aanwezigheid van de juiste banden na de spijsvertering ( Figuur 2a ) door gelelektroforese en ga verder met stap 2. Als u plasmide-DNA bereidt door middel van rollende cirkel amplificatie (RCA), reserveer een deel van het miniprep eluaat om als sjabloon te dienen. </li></ol> 2. Bereiding van Voldoende Plasmide DNA voor Ligation OPMERKING: Ligation en daaropvolgende elektroporatie vereisen een voldoende hoeveelheid plasmide-DNA dat gegenereerd moet worden via either maxiprep of RCA. Terwijl maxiprep de traditioneel gebruikte benadering is, biedt RCA het voordeel dat er geen bacteriën nodig zijn, waardoor het potentieel voor plasmide-geïnduceerde toxiciteit in bacteriën wordt verwijderd, die tot instabiliteitsgebeurtenissen kan leiden. <ol><li><stRong&gt; Voer de volgende maxiprep procedure uit. <ol><li> Voor elk plasmide dat het juiste restrictie-enzymverwerkingspatroon in het vorige gedeelte heeft aangetoond, voeg 500 μL starterkweek toe aan 1 liter TB-Carb (25 μg / ml carbenicilline) bouillon en schud overnacht bij 30 ° C (ongeveer 14-16 uur , Ongeveer OD 600 van 0,6-0,8). OPMERKING: laat de cultuur niet groeien over deze OD 600 waarde. Dit kan mogelijk leiden tot instabiliteitsgebeurtenissen binnen de plasmiden. </li><li> Oog de bacteriën op en voer maxiprepen per protocol van de fabrikant uit (zie materiaal tabel). </li></ol></li><li> Gebruik de opgeslagen miniprep uit stap 1.6, voer het volgende uit voor de RCA procedure. <ol><li> Plaats 1 μl plasmide-DNA over op een buis die 50 μl monsterbuffer bevat. </li><li> Verhit het monster bij 95 ° C gedurende 3 minuten en incubeer vervolgens bij 4 ° C tot het klaar is voor gebruik. </li><li> Bereid de commerciële versterking voorPremix (zie materiaal tabel ). Combineer 50 μl reactiebuffer met 2 μl enzymmix in een buis op ijs. OPMERKING: De versterkingspremix moet op ijs worden gehouden tot het klaar is voor gebruik. Het is handig om een ​​master mix te bereiden door voldoende reagentia te combineren voor het vereiste aantal amplificatie reacties. Eventuele ongebruikte premix moet weggegooid worden. </li><li> Vervolgens 50 μl bereide amplificatie premix aan het gedenatureerde monster. </li><li> Incubeer de reactiebuizen bij 30 ° C gedurende 18 uur. </li><li> Incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 10 minuten om de ø29 DNA polymerase te inactiveren. </li><li> Bewaar de reactiebuisjes bij 4 ° C of -20 ° C tot het klaar is voor gebruik. OPMERKING: op dit moment moet plasmide DNA bereid via beide methoden worden gekwantificeerd (met behulp van absorptie bij 260 nm) en het ZIKV genoom moet Sanger sequenced volledig zijn om te bevestigen dat er geen instabiliteitsgebeurtenissen (deleties en herrangschikkingen) zijn ontstaan ​​tijdens de voorbereiding. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Primer Naam </td><td> Sequentie (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1Voor. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 632For. </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 1201 Voor. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 1663 Voor. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 2008For. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Geconserveerd 2605 Voor. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Geconserveerd 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Geconserveerd 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV Geconserveerd 4132For. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 4665 Voor. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 5219For. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 6119For. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 6769For. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Geconserveerd 7343For. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 8243 Voor. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV behield 9133 Voor. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV Geconserveerd 9686For. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserveerde 10455For. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV Geconserveerd 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Primers voor sequentiebepaling van cDNA-klonen. Plasmiden kunnen volledig worden gehersequentieerd met de genoemde primers. Primers gemarkeerd als &quot;geconserveerd&quot; indiCate dat ze waarschijnlijk alle genotypes van ZIKV kunnen sequenteren / versterken. Primers gemerkt als &quot;PRVABC59&quot; zijn specifiek voor deze stam, maar kunnen ook werken voor andere Aziatische genotype stammen en mogelijk ook andere genotypen. 3. Bereiding van in vitro getranscribeerde RNA <ol><li> Opzetten van de spijsverteringsreactie van hetzij maxiprep of RCA-bereid DNA. <ol><li> Voor p1 digestie meng 10 μL 10x reactiebuffer, 3 μL ApaLI, 3 μl BamHI-HF, 3 μL rSAP of CIP en 3,3 μg p1 DNA. Voeg ddH20 toe aan 100 μl. </li><li> Voor p2 digestie meng 10 μL 10x reactiebuffer, 3 μL ApaLI, 3 μL EcoRI-HF en 13,3 μg p2 DNA. Voeg ddH20 toe aan 100 μl. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur. </li><li> Zuiveren met behulp van een commerciele gel- en PCR-opruimingsset (zie materiaaltabel). Eluten in 30 μl elutiebuffer die vooraf wordt verhit tot 70 ° C in een verwarmingsblok (incubate theKolom gedurende 5 minuten voor het spinnen). OPMERKING: Houd 1 μL om later op een gel te lopen. </li></ol></li><li> Bereid ligatie reactie op. <ol><li> Combineer 10 μl 10x T4 DNA-ligatie-reactiebuffer, 3 μl T4 DNA-ligase (400 U / μl), 29 μl gezuiverd p1 en 29 μl gezuiverd p2. Voeg ddH20 toe aan 100 μl. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of 16 ° C overnacht. </li><li> Zuiveren met behulp van een commerciele gel- en PCR-opruimingsset (zie materiaaltabel). Vervolgens in 10 μl elutiebuffer vooraf verwarmd tot 70 ° C in een verwarmingsblok (incubate kolom gedurende 5 minuten voor het spinnen). OPMERKING: Houd 1 μL om later op een gel te lopen. </li></ol></li><li> Run onontgiste plasmiden, verteerde plasmiden en ligatie op een agarosegel. Het ligatieproduct zou een band met een hoger molecuulgewicht hebben (ongeveer 11 kb) dan alleen gedigereerde plasmide, die aangeeft dat de ligatie succesvol was ( Figuur 2b ).</li><li> Stel T7 in vitro transcriptiereactie op. <ol><li> Combineer 10 μL 2x ARCA / NTP Mix, 2 μl T7 RNA polymerase mix en 8 μl gezuiverde ligatie reactie voor een eindvolume van 20 μl. OPMERKING: De ARCA die in de mix is ​​opgenomen, is een dop analoog dat uitsluitend in de juiste oriëntatie is opgenomen. Standaard cap analogen kunnen resulteren in slechts ~ 50% van de transcripten hebben een pet in de juiste oriëntatie. </li><li> Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. </li><li> Meet RNA-concentratie via een UV-spectrofotometer. Optioneel, gebruik een denaturerende agarosegel om de lengte van het RNA-transcript te bevestigen. </li></ol></li></ol> 4. Redding van besmettelijk virus door elektroporatie <ol><li> Dagen voorafgaand aan elektroporatie, bereiden 1 T182-fles van Vero-cellen (tussen T150 en T182 is aanvaardbaar, gegroeid in DMEM + 10% foetaal bovenserum (FBS)) per construct dat wordt hersteld. Inclusief 1 T182 als een mock transfectie controle. CeLls moet gebruikt worden bij 70-80% samenvloeiing. </li><li> Wanneer cellen klaar zijn, plaats 12 mL / reactie van DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in een waterbad dat verwarmd is tot 37 ° C. </li><li> Verwijder cellen door trypsinisatie met een standaard protocol, en herstel cellen in media met 10% FBS om trypsine te inactiveren; Centrifugeer cellen bij 150 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Wascellen in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pelleteringscellen bij 150 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap tweemaal voor een totaal van drie wasingen. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 μl RPMI 1640 + 10 mM HEPES (steriel) per # monsters. Breng 200 μL cel suspensie over naar een steriele buis. Cellen moeten ~ 0,5 x 107 cellen / ml zijn. </li><li> Voeg 20 μl water (mock neg. Control) of 20 μL RNA (bij voorkeur 5-10 μg) in stap 3.4 aan elke reeks cellen toe. Meng het voorzichtig door de buis te vlotten en de inhoud van de buis over te brengen naar een 2 mm-gaten electroporation cuvette. </li><li> Stel een elektrOporator tot 170 V LV, omega (weerstand) bij 0 en 950 μF (ongeveer 625 V / cm en 20 ms tijdskonstante voor andere machines). Stel weerstand tegen de laagste beschikbare instelling, of 0 of ∞ indien beschikbaar. </li><li> Pulse voegt onmiddellijk 600 μL DMEM +15% FBS +10 mM HEPES toe die in stap 4.2 werd verwarmd. Spoel de binnenkant van de cuvette grondig door om alle cellen te verwijderen. Voeg cellen toe aan een T75 weefselkweekkolf die 10 ml voorverwarmde media bevat. Verwijder extra media uit cuvette door gebruik te maken van de dropper die bij de cuvette is opgenomen. Wees voorzichtig om steriliteit te behouden. </li><li> Wervelkolf om media en cellen te mengen en in een incubator van 37 ° C te plaatsen. </li><li> Controleer de volgende dag voor cellevendigheid, en doe dit elke dag tot 50-75% celsterfte waargenomen. Celdood wordt waargenomen door te vergelijken met de bespotse elektroporate controle. OPMERKING: Het cytopathische effect van het ZIKV (CPE) is nogal uitgesproken in Vero-cellen, wat resulteert in afgeronde cellen die losmaken en drijven in het kweekmedium. We hebbenWaargenomen een bereik van 8-10 dagen als ideaal voor oogst. </li><li> Harvest supernatant in een conische buis en centrifuge om cellulaire rommel bij&gt; 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te verwijderen. </li><li> Verwijder verduidelijkt supernatant naar een nieuwe buis en aanvul met een uiteindelijke concentratie van 20% FBS (uit 100% voorraad). Voeg ook steriele HEPES toe bij een uiteindelijke concentratie van 10 mM als buffermiddel om virusinfectiviteit te behouden, terwijl bevroren (uit een 1 M steriele voorraad). </li><li> Meng virus door vortexing en aliquot in schroefdopflessen. Bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ol> 5. Titratie van hersteld virus <ol><li> Zet het passende aantal 6- of 12-putjes platen van Vero-cellen de dag voor de titratie. </li><li> Verwijder virus uit de vriezer en maak serieuze 10-voudige verdunningen in DMEM + 2% FBS in buizen of 96-putjes platen. OPMERKING: De verwachte titer uit herstelde klonen ligt tussen 1 x 106 en 5 x 107 PFU / ml. </li><li> Voeg 200 oR 400 μl van elke verdunning in tweevoud aan respectievelijk een putje van respectievelijk een 12- of 6-putjesplaat. </li><li> Plaats platen in een 37 ° C incubator en steek elke 15 minuten, gedurende een totale 1-1,5 uur adsorptieperiode. </li><li> Verwijder virale inoculum en voeg 1 ml (12-putjes) of 2 ml (6-putjes) DMEM-Tragacanth overlay aan elke put toe. OPMERKING: Het is mogelijk om hier agarose, agar, methylcellulose of andere overlay media te gebruiken. </li><li> Incubeer cellen in 37 ° C incubator gedurende 5 dagen. De tijd voor de juiste plaatvorming zal variëren afhankelijk van de gebruikte overlay. </li><li> Om cellen op te lossen, verwijder platen van incubator en dek de overlay voorzichtig in desinfectiemiddel. </li><li> Voeg voldoende 20% ethanol / 0,1% kristalviolet (CV) toe aan elke put om te bedekken en wervelen om te mengen. OPMERKING: Veel andere fixatiemiddelen bestaan ​​en kunnen hier gebruikt worden. Bovendien, als u een agarose- of agaroverlay gebruikt, kan een tweede overlay gebruikt worden in combinatie met neutraal rood om plakken zonder fixatie te visualiseren. 20% ethanol blijkt te zijnEffectief bij het inactiveren van omhulde virussen in eerdere studies; Gebruik dit bedrag niet voor niet-omhulde virussen, aangezien deze niet worden geactiveerd 19 . </li><li> Incubeer platen gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur (in een klasse II bioveiligheidskast); Verwijder CV (per plaatselijke regelgeving) en wasplaten met kraanwater. </li><li> Laat de borden drogen en plak plakkers handmatig. OPMERKING: Referentie 20 kan worden gebruikt als aanvullende referentie voor het uitvoeren van plaque assays. </li></ol>

<ol><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%3A+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%2C+December+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveill. 19 (9), (2014).</li>
<li>Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cryptic+prokaryotic+promoter+within+the+cDNA+encoding+the+5%27+end+of+dengue+virus+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome.</a> PLoS One. 6 (3), e18197(2011).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+propagate+flavivirus+infectious+cDNA+clones+in+bacteria+by+introducing+tandem+repeat+sequences+upstream+of+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome.</a> J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+propagation+of+flavivirus+infectious+cDNAs+by+a+novel+method+to+reduce+the+cryptic+bacterial+promoter+activity+of+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes.</a> J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).</li>
<li>Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+infectious+yellow+fever+RNA+from+full-length+cDNA+templates+produced+by+in+vitro+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.</a> New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).</li>
<li>Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+reverse+genetics+system+for+Japanese+encephalitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.</a> J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).</li>
<li>Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+major+determinant+of+mouse+neurovirulence+of+dengue+virus+type+2+using+stably+cloned+genomic-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA.</a> J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).</li>
<li>Johansen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+insertion+facilitates+amplification+of+cloned+virus+cDNA+in+Escherichia+coli+while+biological+activity+is+reestablished+after+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).</li>
<li>Shan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+to+Study+Viral+Virulence%2C+Mosquito+Transmission%2C+and+Antiviral+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+1947+Zika+Virus+Prototype+Strain+with+a+Cytomegalovirus+Promoter-Driven+cDNA+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone.</a> mSphere. 1 (5), (2016).</li>
<li>Tsetsarkin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Full-Length+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+from+the+2015+Epidemic+in+Brazil+as+a+Genetic+Platform+for+Studies+of+Virus-Host+Interactions+and+Vaccine+Development%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Gadea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+the+rapid+generation+of+recombinant+Zika+virus+expressing+the+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene.</a> Virology. 497, 157-162 (2016).</li>
<li>Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+an+infectious+dengue+virus+type-2+RNA+genome+%28New+Guinea+C+strain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain).</a> Gene. 162 (2), 175-180 (1995).</li>
<li>Messer, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reverse+genetic+system+for+studying+dengue+virus+serotype+3+strain+variation+and+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486(2012).</li>
<li>Kinney, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+virulence+and+thermostable+replication+of+the+North+American+strain+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).</li>
<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
<li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een methode voor de herstel van een bipartiet infectieus cDNA-kloonsysteem voor ZIKV. Eerder beschreven klonen voor ZIKV lijden aan verminderde virulentie of vereisen de toevoeging van introns, waardoor plasmiden groter worden en redding in insectencellen worden voorkomen. Infectieus virus kan worden hersteld met behulp van het twee-plasmide kloonsysteem in zowel zoogdier- als insectencellen (gegevens niet getoond). Bovendien gedraagt het virus dat uit dit systeem is hersteld zich vergelijkbaar met wi...

Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) is een muskietgedragen flavivirus die in 2013-14 in Brazilië is aangekomen en vervolgens geassocieerd werd met een massale uitbraak van febriele ziekte die zich verspreidde over heel Amerika 1 . Daarnaast is ZIKV verbonden met ernstige ziekte-uitkomsten, zoals Guillain-Barré syndroom bij volwassenen en microcefalie bij foetussen en neonaten 2 . Weinig was bekend over ZIKV voor zijn snelle verspreiding in het westelijk halfrond. Dit omvatte een gebrek aan moleculaire hulpmiddelen, waardoor mechanistisch onderzoek werd belemmerd. Moleculaire hulpmiddelen voor virussen, zoals infectieuze cDNA-klonen, vergemakkelijken vaccin- en antivirale therapeutische ontwikkeling, en staan ​​voor de beoordeling van virale genetische factoren die verband houden met differentiële virale pathogenese, immuunrespons en virale evolutie. Flavivirus-infectieuze klonen zijn bekend als zeer instabiele bacteriën door crYptische prokaryotische promotors aanwezig in hun genen 3 . Verschillende benaderingen zijn gebruikt om dit probleem te verbeteren; Inclusief het inbrengen van tandemherhalen stroomopwaarts van virale sequenties 4 , mutatie van vermoedelijke prokaryotische promotorsekvensen 5 , het splitsen van het genoom in meerdere plasmiden 6 , vectoren met lage kopieën (inclusief bacteriële kunstmatige chromosomen) 7 , 8 en het inbrengen van intromen in het virale genoom 9 . Een volledige lengte systeem zonder wijzigingen is beschreven voor ZIKV; Deze kloon bleek echter te worden verzwakt in celkweek en in muizen 10 . Andere groepen hebben introns in het ZIKV genoom ingezet, waardoor verstoringen van onstabiele sequenties in bacteriën kunnen worden uitgesplitst die in vitro kunnen worden uitgesplitst in zoogdiercellen voor het produceren van infectieus virus 11, 12 . Bovendien is een PCR-based systeem getiteld Infectious-Subgenomic-Amplicons succesvol gebruikt om de prototype MR766-stam van ZIKV 13 te redden. De hier beschreven werkwijze vereist geen vreemde sequenties, maar versteur het genoom in het gebied van hoge instabiliteit door gebruik te maken van meerdere plasmiden, die eerder succesvol is gebruikt met gele koorts 6 , dengue 14 , 15 en West-Nile virussen 16 . Bovendien vergemakkelijkt de toevoeging van de hepatitis D-ribozymsequentie bij de virale genomische termini de creatie van een authentiek 3&#39;-einde zonder de noodzaak van de toevoeging van een linearisatieplaats. Bovendien worden beide plasmiden geconstrueerd in een vector met lage kopieën (pACYC177, ~ 15 kopieën per cel) om eventuele resterende toxiciteit 17 te verzachten. Het herstelde virus toont een groeiprofiel dat vergelijkbaar is metOuderlijk virus in in vitro groeikrommen in 8 cellijnen die een verscheidenheid van celletypes afkomstig zijn van zowel zoogdieren als insecten, en heeft identieke pathogene profielen in muizen en infectie-, verspreiding- en overdrachtssnelheden in muggen 18 tentoongesteld. Hierin beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe de infectieuze kloonplasmiden worden ontwikkeld, in vitro volledige virale RNA (het virale genoom) genereren en infectieus virus in celcultuur herstellen. Ten eerste beschrijven we de voortplanting van plasmiden in bacteriën of bacteriënvrije amplificatie met behulp van rollende cirkel amplificatie (RCA). Vervolgens laten we zien hoe de twee plasmiden worden verteerd en daarna gelijktijdig geligeerd worden om full-length virus te genereren. Tenslotte beschrijven we de productie van getranscribeerde RNA en de daaropvolgende elektroporatie in Vero-cellen, gevolgd door titratie van hersteld virus ( Figuur 1 ). De beschreven benadering is snel, waardoor foHet herstel van besmettelijke virusvoorraad in 1-2 weken.

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin, Disodium Salt</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Amplification Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400.000 eenheden/mL</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 High Throughput Electroporation System</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>Andere machines zijn acceptabel.</td></tr><tr><td>LB Broth with agar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>Kan ook zelfgemaakt worden.</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>Kan ook zelfgemaakt worden.</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>Culture Tubes</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 flasks</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Powder</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Denatured</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Oligos</td><td>IDT</td><td>zie tabel 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>andere methoden zijn acceptabel.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>andere methoden zijn acceptabel.</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>andere methoden zijn acceptabel.</td></tr><tr><td>Class II Biosafety Cabinet</td><td>Varies</td><td>N/A</td><td>Dit is noodzakelijk voor werk met levend virus.</td></tr></tbody></table>

redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de zika virus

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectieuze cDNA-klonen zorgen voor genetische manipulatie van een virus, waardoor werk wordt vergemakkelijkt bij vaccins, pathogenese, replicatie, transmissie en virale evolutie. Hier beschrijven we de constructie van een besmettelijke kloon voor Zika virus (ZIKV), die momenteel een explosief uitbraak in Amerika veroorzaakt. Om toxiciteit te voorkomen voor bacteriën die gewoonlijk worden waargenomen met flavivirus-afgeleide plasmiden, gaven we een tweedimplantsysteem op dat het genoom bij het NS1-gen scheidt en stabieler is dan volledige constructies die niet succesvol zouden kunnen worden hersteld zonder mutaties. Na spijsvertering en ligatie om de twee fragmenten aan te sluiten kan full-length virale RNA gegenereerd worden door in vitro transcriptie met T7 RNA polymerase. Na elektroporatie van getranscribeerde RNA in cellen werd virus hersteld die respectievelijk dezelfde in vitro groei kinetiek en in vivo virulentie en infectie fenotypen vertoonde in respectievelijk muizen en muggen.

Het hier beschreven protocol zorgt voor het herstel van infectieus kloon afgeleid Zika virus. Het manipuleren van het infectieuze kloonsysteem met twee plasmiden is rechtdoor wanneer het met zorg wordt uitgevoerd, in vergelijking met volledige lengteversies die zeer instabiel zijn (data niet getoond). Na spijsvertering en ligatie van de twee afzonderlijke stukken wordt afgedekt RNA geproduceerd onder toepassing van in vitro transcriptie met T7-polymerase, dat vervolgens in Vero-...

Dit protocol beschrijft het herstel van infectief Zika-virus uit een infectieuze cDNA-kloon met twee plasmiden.

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Het algemene doel van deze procedure is het terugwinnen van infectieus virus uit een tweetalig Zika-virus Z-DNA-kloon. Deze methode kan belangrijke vragen in het veld van de flavivirologie beantwoorden, zoals vaccinatiestrategieën, pathogenese, transmissie en virusevolutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tweetalige systeem stabieler is dan benaderingen met volledige lengte.Hoewel deze methode inzicht kan geven in het Zika-virus, kan deze ook worden toegepast op andere virale systemen die moeilijk te kloneren zijn gebleken vanwege plasmidinstabiliteit. De procedure zal worden gedemonstreerd door James Weger, een post-doc uit mijn laboratorium. Begin met het opzetten van digestiereacties voor beide plasmiden die het Zika-virusgenoom coderen, P1 en P2. Digereer 3,3 µg P1 met ApaL1 en BamH1 High Fidelity in aanwezigheid van een competent fosfatase in een eindvolume van 100 µL.Voor P2 wordt 13,3 µg P2-DNA gedigesteerd met ApaL1 en EcoR1 High Fidelity in een eindvolume van 100 µL. Incubeer beide reacties gedurende 1,2 uur bij 37 °C. Nadat de gedigesteerde plasmiden zijn gezuiverd met een commerciële gel- en PCR-opreinigingskit, wordt 30 µL elutiebuffer, voorverwarmd tot 70 °C, aan de kolom toegevoegd en vijf minuten geïncubeerd.Nadat de gezuiverde, gedigesteerde plasmiden zijn gecentrifugeerd, wordt de ligatiereactie voorbereid door 29 µL gezuiverd P1 en 29 µL gezuiverd P2 te combineren met T4 DNA ligatiereactiebuffer en T4 DNA ligase in dubbel gedestilleerd water tot een eindvolume van 100 µL. Incubeer de ligatiereactie gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Zuiver na incubatie het geligeerde plasmide op dezelfde wijze als voorheen.Gebruik dit keer 10 µL voorverwarmde elutiebuffer. Voer vervolgens een agarosegelelektroforese uit voor de onverteerde plasmiden, de verteerde plasmiden en de ligatie. Een succesvolle ligatie moet leiden tot een ligatieproduct van ongeveer 11Kb.Nadat is bevestigd dat de plasmiden het juiste molecuulgewicht hebben, wordt een T7 in vitro transcriptie-reactie opgezet met acht µL van de gezuiverde ligatiereactie en vier uur geïncubeerd bij 37 °C. Na de incubatie wordt de RNA-concentratie gemeten via een UV-spectrofotometer. Eén of twee dagen voorafgaand aan de elektroporatie wordt per te herstellen construct één T182-fles Vero-cellen klaargezet.Voeg een T182-fles toe om als mock-electroporatiecontrole te dienen. Wanneer de cellen een confluentie van 70 tot 80% hebben bereikt, warm DMEM met 15% FBS en 10 millimolar HEPES op in een waterbad dat is verwarmd tot 37 °C. Detacheer de cellen door trypsinisatie volgens standaardmethoden en verzamel de cellen in medium met 10% FBS om de trypsine te inactiveren.Centrifugeer de cellen vervolgens bij 150 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Nadat de cellen drie keer zijn gewassen met PBS, suspenderen we elk celpellet in RPMI 1640 plus 10 mM HEPES tot een concentratie van ongeveer 0,5 × 10⁷ cellen per milliliter. Breng 200 µL van de celsuspensie over naar een steriele buis.Voeg vervolgens 20 microliters water toe als mock-controle of 20 microliters RNA aan elke set cellen. Meng de cellen voorzichtig door aan de buis te tikken en breng vervolgens de inhoud van de buis over naar een electroporatiecuvette met een gap van twee millimeter. Stel de electroporator in op 170 volts, nul Omega weerstand en 950 microfarads.Pulse de cellen één keer en voeg onmiddellijk 600 µL van het voorverwarmde medium toe. Voeg de cellen toe aan een T75 weefselkweekfles die 10 mL van het voorverwarmde medium bevat. Verwijder elk overgebleven medium uit de cuvette met behulp van de pipet die bij de cuvette is geleverd.Wervel de kolf om het medium en de cellen te mengen en plaats deze vervolgens in de incubator op 37 °C. Controleer de volgende dag en elke dag daarna de levensvatbaarheid van de cellen totdat er 50 tot 75% celdood wordt waargenomen ten opzichte van de mock-geëlectroporeerde controle. Wanneer 50 tot 75% celdood is waargenomen, wordt het supernatant geoogst in een conische buis en vervolgens gecentrifugeerd bij meer dan 3.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen.Breng na centrifugatie de geklaarde supernatant over naar een nieuwe buis en voeg FBS toe tot een eindconcentratie van 20%. Voeg daarnaast steriele HEPES toe tot een eindconcentratie van 10 millimolar als bufferingsmiddel om de infectiviteit van het virus tijdens het invriezen te behouden. Meng ten slotte het virus door vortexen en verdeel dit in aliquots in buisjes met schroefdop. Bewaar het virus bij min 80 graden celsius voor toekomstig gebruik.Deze afbeelding toont het vergelijkbare effect van wild-type PRVABC59 en Zika-virus afgeleid van een infectieuze kloon op de groeikinetiek van de niet-menselijke primate Vero-cellijn. Deze afbeelding toont het effect van beide virussen op menselijke placentacellen. Vergelijkbare groeikinetiek is waargenomen in een uit muggen afgeleide C6/36-lijn.Deze overlevingscurve toont gegevens verkregen van vier weken oude interferon alfa-, bèta- en gamma-receptor knockout-muizen die waren geïnoculeerd met 1 000 PFU van PRVABC59 of het uit een infectieus kloon afgeleide virus. Aedes aegypti werden gedissekeerd 14 dagen na een bloedmaaltijd met Zika-virus. Plaque-assays werden gebruikt om de infectie in mosquito-lichamen te beoordelen, in de poten om verspreiding te meten, of in speekselsecreties om de transmissie van het infectieuze virus te meten.Snelheden worden gepresenteerd als het percentage van het totaal aantal geteste muggen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het volledige virus te sequensen. Het is daarnaast belangrijk om het virus te oogsten bij 50 tot 75% CPE om virale replicatiecycli te minimaliseren.Deze techniek is belangrijk voor onderzoekers op het gebied van flavivirologie om vaccins, pathogenese en de evolutie van het Zika-virus te onderzoeken.

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

This video demonstrates a procedure to infect human fetal neural stem cells with Zika virus. The infected cells can be used for further studies.

Zika Virus Infection of Fetal Neural Stem Cells

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter...

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Hier beschrijven we een methode voor de vaststelling van een model voor Zika virus-geïnduceerde microcefalie in muis. Dit protocol bevat methoden voor embryonale, Neonatale en volwassene-fase intracerebrale inoculatie van de Zika-virus.

Tot vaststelling van Muismodellen voor Zika-Virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, Neonatale en volwassen

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

Beschrijven we een methode om te evalueren van het effect van reeds bestaande immuniteit tegen dengue virus op de Zika-virus-infectie met behulp van menselijk serum, primaire menselijke cellen en kwantificering van de infectie door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

De recente epidemie van het Zikavirus wijst op het belang van het opzetten van omgekeerde genetische benaderingen om vaccins en/of therapeutische strategieën te ontwikkelen. Hier beschrijven we het protocol om een infectieus recombinant Zikavirus te redden van een volledige cDNA-kloon, geassembleerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom onder controle van het humaan cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor.

Redding van recombinante Zika virus uit een bacteriële kunstmatige chromosoom cDNA kloon

Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.

Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie

Leer het herstel van infectieus Zika-virus uit een tweedelige cDNA-kloon. Deze methode biedt inzicht in flavivirussen en kan worden toegepast op andere virale systemen die moeilijk te klonen zijn.

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Meer video's verkennen