Name: Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H2 oxidatie aangetoond door een Hydrogenase connectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer de PFIRE-techniek voor het bestuderen van redox-eiwitten zoals nikkel-ijzerhydrogenase. Deze methode combineert elektrochemische controle met infraroodspectroscopie voor inzicht in katalytische mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk van K.A.V. en P.A.A. werd gesteund door de European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), de Engineering and Physical Sciences Research Raad IB katalysator award EP/N013514/1, en de biotechnologie en de biologische onderzoek van Wetenschappen Raad (BB/L009722/1 en BB/N006321/1). R.H. werd gesteund door Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, en Lincoln College, Oxford. De auteurs erkennen Mr. Charlie Jones, Mr Charlie Evans en personeel van de mechanische Workshop (Department of Chemistry) voor hulp bij het ontwerp en de vervaardiging van spectroelectrochemical cellen die worden gebruikt in dit werk.

1. het herscheppen van het compartiment van de interne monster van een Spectrometer FTIR binnen een anaërobe, droge Glovebox en experimentele Algemeneeisen
<ol><li>Gebruik een commerciële FTIR-spectrometer, uitgerust met een externe kwik cadmium telluride (MCT) detector en ATR accessoire. Zuiveren van het lichaam van de spectrometer met droge lucht of dinitrogen, of alternatief gebruiken een spectrometer met een geëvacueerd optische bank.</li>
	<li>Plaats de spectrometer op een stabiele, trillingsvrij tafel op dezelfde hoogte als een anaërobe (< 1 ppm O2), drogen (dauwpunt <-75 ° C) ' glovebox '. Doorschakelen van de IR-straal van de spectrometer liggen in de ' glovebox ', via een IR transparant venster dat is groot genoeg voor de intreepupil-straal. Opmerking: Het is belangrijk dat de ruimte tussen de ' glovebox ' en een spectrometer ook gezuiverd of geëvacueerd, vooral als een hygroscopisch venster materiaal, zoals NaCl of KBr bijvoorbeeld wordt gebruikt.</li>
	<li>
De interne monster compartiment van de spectrometer liggen binnen de ' glovebox ' repliceren.
	<ol>
<li>Direct de lichtbundel binnen de ' glovebox ' op een off-axis ellipsvormige spiegel, liefst met de dezelfde brandpuntsafstand als de interne focus spiegel van de spectrometer. Opmerking: Het is nuttig te beschikken over twee extra vliegtuig spiegels geplaatst voordat deze focus spiegel, zodat zowel de hoogte en de richting van de IR-straal worden aangepast binnen de ' glovebox '; Dit zal eventuele onjuistheden in de eerste plaatsing van de spectrometer gecompenseerd.</li>
		<li>Plaats een externe MCT-detector, compleet met een geschikt, zoals voor het repliceren van de afmetingen van het interne monster gericht optiek (zoals een korte brandpuntsafstand ZnSe lens, of off-axis parabolische spiegel, met een korte brandpuntsafstand) binnen de ' glovebox ', geplaatst compartiment van de spectrometer.</li>
		<li>Pas de 'focus' van de IR-straal te zijn ongeveer gelijke afstanden tussen de focus spiegel en de MCT-detector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koel de dewar van de externe MCT-detector met vloeibare stikstof.</li>
	<li>Monteer de ATR-accessoire in de glovebox monster compartiment. De input en output gericht optica en ATR accessoire om maximale doorvoer naar de MCT-detector uitlijnen Gebruik indien nodig een diafragma of andere geschikte demping (zoals een draad rooster) om te voorkomen dat overbelichtingseffecten van het signaal van de detector. Opmerking: voor de hier gepresenteerde gegevens, een vijf-reflectie ATR accessoire met alle reflecterende optica en een verwijderbare trapeziumvormige Si interne reflectie element (IRE) wordt gebruikt (Crystal GmbH, afmetingen ca 5 × 8 × 1 mm3, face hoek 39,5 °). Het IRE is gemonteerd in een verwijderbare basisplaat gefreesd uit polyether ether keton (PEEK).</li>
	<li>Gebruik van een handschoenenkast naar het huis van de nieuwe monster compartiment met geschikte feedthroughs om verbinding met een extern gehuisvest potentiostaat (strakke BNC gasnetverbindingen nuttig zijn voor dit doel), gas access en kabel overbrengen van het signaal van de MCT detector. Het is belangrijk te behouden een afscherming van de kabel van de detector te vermijden introductie ruis- of interferentieniveau naar de maten.</li>
	<li>Plaats een peristaltische pomp, staat debiet meer dan 60 mL/min binnen de ' glovebox '. Een schematische weergave van de spectrometer, ATR accessoire, peristaltische pomp en potentiostaat setup is afgebeeld in Figuur 1.</li>
	<li>Bouw een spectroelectrochemical cel, als schematisch afgebeeld in Figuur 2, dat de zeehonden op de ATR accessoire. De cel moet bevatten een hoge oppervlakte teller elektrode (Pt draad of gaas), een aansluiting voor de werkende elektrode (carbon staaf) en een miniatuur referentie-elektrode. De cel moet ten minste twee verdere poorten als inlaat en uitlaat voor snelle stroom van oplossingen via de cel bevatten. Opmerking: Een miniatuur verzadigde kalomel referentie-elektrode is ideaal voor dit doel. 36
</li>
</ol>2. voorbereiding van de roet deeltjes bewerkt met E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>In een 'natte' anaërobe ' glovebox ', meng 20 mg hoge oppervlakte roet deeltjes (> 1000 m3/g) met 1 mL met zuiver water (soortelijke weerstand > 18 MΩ cm) in een microcentrifuge buis. Verspreiden van de deeltjes met het ultrasoonapparaat spaarstand (< 100 W) gedurende ten minste 15 minuten, of totdat de spreiding is uniform en niet sediment binnen 1 uur, niet geven een roet-dispersie met een lading van ongeveer 20 mg/mL.</li>
	<li>
Neem een aliquoot gedeelte van E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ongeveer 50 µL, bereid volgens een gepubliceerde procedure55) met een concentratie van ~ 7 mg eiwit/mL en ruilen in een lage Ionische sterkte buffer met een pH dicht bij het elektrisch punt (voor in het volgende voorbeeld kalium fosfaat, 15 mM, pH 5,8, geen extra zout). Beste resultaten, gebruik een enzympreparaat die zo actief mogelijk is. Het uitvoeren van de uitwisseling van de buffer door concentratie en verdunning, in een centrifugaal filter-apparaat met een passende molecuulgewicht cutoff (50 kDa werkt goed voor Hyd1).
	<ol>
<li>De Hyd1 toevoegen aan de filter-apparaat.</li>
		<li>Verdun met ongeveer 450 µL van exchange buffer.</li>
		<li>Reconcentrate met een volume van 50 µL met milde centrifugeren (< ~ 2700 × g) om te voorkomen dat onherstelbare neerslag.</li>
		<li>Herhaal de stappen 2.2.2 en 2.2.3 om buffer exchange is voltooid (meestal binnen ~ 5 cycli).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meng een deel van de 5 µL van 20 mg/mL roet dispersie (bereid in 2.1) met de 50 µL hoeveelheid Hyd1 buffer-uitgewisseld. Sla het enzym-deeltje mengsel in een ijskast (bij 0 ° C) 's nachts zodat het enzym te adsorberen. Mogelijk moet schud het mengsel af en toe om ervoor te zorgen dat de deeltjes blijven verspreid.</li>
	<li>De Hyd1 gemodificeerde deeltjes met lage Ionische sterkte buffer (kalium, fosfaat, 15 mM, pH 5,8, geen extra zout) wassen door opeenvolgende cycli van sedimentatie en opnieuw dispersie in een microcentrifuge (~ 2700 × g). Herhaal dit proces 3 - 5 keer voor het verwijderen van niet-geadsorbeerde enzym. Opmerking: Voordat u de eerste was het supernatant moet vrijwel kleurloos, die goede adsorptie van enzym aangeeft.</li>
	<li>Het concentreren van de deeltjes tot een eindvolume van ~ 5 µL, het geven van een definitieve laden van ~ 20 mg/mL van enzym gemodificeerde deeltjes. Opmerking: De Hyd1 gemodificeerde deeltjes kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal twee weken als ze gehydrateerd blijven; Dit is het best bereikt door te slaan deeltjes verdund met ~ 50 µL van met zuiver water.</li>
</ol>3. voorbereiding van de PFIRE metingen op E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>Het IRE Si schoon met het lage-aangedreven ultrasoonapparaat (< 100 W), eerst in H2dus4 (< 90% w/w) voor ~ 15 min en vervolgens in HNO3 (70% w/w) voor maximaal 1 uur. Deze schoonmaak procedure moet leiden tot een hydrofiele IRE oppervlak. Als verdere reiniging vereist is het IRE in piranha-oplossing kan worden geplaatst (een verhouding 1:3 H2O2: H2SO4) om te oxideren van eender welk resterende organisch materiaal. Opmerking: Harde zure reinigingsmethoden wellicht niet geschikt voor gebruik met alle materialen van het IRE. Piranha-oplossing is zeer corrosief en een sterke oxidator, oppervlakken moet redelijk schoon voordat gebruik van piranha-oplossing en zorg moet worden genomen tijdens de bereiding en het gebruik van piranha-oplossing het exotherme karakter van het proces - altijd toevoegen H2O 2 langzaam aan H2SO4 en verwijzen naar de juiste veiligheidsprocedures voor voorbereiding, gebruik en verwijdering.</li>
	<li>Spoel de schone IRE in met zuiver water en drogen onder een stroom van droog stikstofgas. Verrichten alle prisma behandeling met behulp van schone pincet om verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Het IRE zegel in de ATR accessoire basisplaat met behulp van een dunne strook van elektrische-grade silicone sealant. Zorg voor het beperken van het afdichtmiddel aan de randen van het IRE. Laat het afdichtmiddel volledig drogen.</li>
	<li>De ATR accessoire basisplaat overbrengen in de spectrometer ' glovebox ' en dit op de ATR-accessoire koppelen. Maatregel een referentiespectrum (achtergrond) tussen 4000-1000 cm-1 op 4 cm-1 resolutie, met behulp van de standaard snelle scan modus van de spectrometer en 1024 gemiddelde interferograms (meting tijd ~ 3-5 min). Gebruik dit spectrum als input voor berekening van de extinctie spectra verderop in het experiment. Opmerking: Als gevolg van de kleine extinctie verwacht voor de Hyd1 actieve site is het noodzakelijk om te verzamelen van spectra met hoog signaal ruis verhouding.</li>
	<li>De ATR accessoire basisplaat overbrengen in de 'natte' glovebox waarin de vooraf bereid Hyd1 gemodificeerde deeltje dispersie (sectie 2). Drop-cast een hoeveelheid van 1 µL van de spreiding van de deeltjes op het grote gezicht van het IRE, en ze gelijkmatig over het oppervlak. Opmerking: De deeltjes worden volledig droog op het IRE niet toegestaan.</li>
	<li>Knip een stukje van carbonpapier, zoals die gebruikt als gas verspreiding laag materiaal in brandstofcellen, naar een grootte ~0.1 mm kleiner dan de oppervlakte afmetingen van het IRE (d.w.z. ca. 8.2 × 4.9 mm2). De oppervlakte van het carbon papier moet groot genoeg zijn ter dekking van de drop-cast Hyd1 gemodificeerde deeltjes, maar niet zo groot over overlappen de siliconen-sealant gebruikt voor het beveiligen van het IRE. Geniet van het carbon papier in water en zachtjes plaats deze over de bovenkant van de deeltjes film. Het carbon papier levert een goede elektrische verbinding over de hele deeltje film. Opmerking: Het is gunstig voor het bereiden van verschillende soorten carbonpapier op voorhand en sla ze vooraf gedrenkt in met zuiver water binnen de 'natte' anaërobe ' glovebox '.</li>
	<li>Monteren van de cel van de spectroelectrochemical (beschreven in 1.7 en schematisch afgebeeld in Figuur 2) over het IRE, veilig in de basisplaat met schroeven. Voeg ~ 200 µL van de experimentele buffer te houden van het enzym gehydrateerd. Een gemengde buffersysteem, dat kan bufferen over een breed pH-bereik, is handig voor studies over connectoren hydrogenases:56 Natriumacetaat, 2-[N'-morfolino] ethaan-Sulfonzure zuur (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine -N' -[2-ethaan-Sulfonzure zuur] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] methyl-3-amino-propaan-Sulfonzure zuur (kranen), en 2-[N'-cyclohexylamino] ethaan-Sulfonzure zuur (CHES), met elk onderdeel op een eindconcentratie van 15 mM en 0,1 M met NaCl als ondersteunend elektrolyt, met pH aangepast aan de pH 6 met behulp van geconcentreerd NaOH en HCl. Opmerking: De elektrode werkende verbinding moet iets uitsteken onder het vlak van de spectroelectrochemical cel top (~0.1 mm) om goede elektronische verbinding met het carbonpapier (Figuur 2).</li>
	<li>De oplossing inlaat en uitlaat van de cel van de spectroelectrochemical verbinden met een stroomsysteem met peristaltische pomp slang en een flesje van de experimentele buffer. De samengestelde cel overbrengen in de 'droge' glovebox met de spectrometer.</li>
	<li>Monteer het spectroelectrochemical cel op de ATR-accessoire. Sluit de werken, de teller en de referentie-elektroden aan de potentiostaat. Sluit de peristaltische pomp slang aan de pomp.</li>
	<li>Een extinctie spectrum met 1024 gemiddeld interferograms bij 4 cm-1 resolutie opnemen over een spectrale serie van 4.000-1000 cm-1, met behulp van het spectrum verzameld in 3.4 als een referentie/achtergrond. Op dit punt het spectrum moet bevatten belangrijke (> 100 mO.D.) amide II banden op ~ 1,540 cm-1 en actieve site bands van Hyd1 moeten blijken in de spectrale regio 1.850-2,150 cm-1, grotendeels in geoxideerde, inactieve staten (Figuur 3 ).</li>
</ol>4. de activering van E. coli Hydrogenase 1 en testen van de Spectroelectrochemical-cel
<ol><li>Een reducerend potentieel (−0.8 V vs SCE) van toepassing op de film Hyd1 gemodificeerde deeltje. Verzadigen de experimentele buffer met H2 en stroom buffer langzaam door de spectroelectrochemical-cel. Laat het monster overnachting volledig activeren de Hyd1. Opmerking: Het is belangrijk te gebruiken anaërobe H2, N2 enz., en dus alle anaërobe gassen moeten worden doorgegeven door een O2 filter.</li>
	<li>Record een spectrum van de extinctie van het monster na activering. Een verdeling van verminderde, 'actief' Staten moeten nu worden weergegeven door de νCO en vCN bands voor de actieve site. Dit wordt meest gemakkelijk waargenomen door het gebruik van het spectrum van een verschil, ten opzichte van het spectrum opgenomen in 3.10 (Figuur 4).</li>
	<li>Test de elektrische verbinding van de cel spectroelectrochemical. Om dit te doen, door de experimentele buffer te verzadigen met N2 gas. Toepassen van een reeks oxiderende (0 V vs SCE) en vermindering van de (−0.8 V vs SCE) mogelijkheden (van ca 30 min duur) voor de film Hyd1 gemodificeerde deeltje en neem een spectrum van de extinctie bij elk programma. De Hyd1 moet worden snel geoxideerd verminderd en als de film deeltje goed verbonden is 100% van het monster moeten reageren op de toegepaste potentieel.</li>
	<li>Het instellen van een juiste debiet van de experimentele buffer. Om dit te doen, een reducerend potentieel (−0.8 V vs SCE) van toepassing op het monster en de experimentele buffer te verzadigen met H2. Opnemen van een serie van cyclische voltammograms tussen-0.707 - 0.039 V vs SCE op een scansnelheid van 10 mV/s. Verhoog geleidelijk het debiet van H2-verzadigde buffer tussen voltammograms tot de katalytische waveshape op die op een vlakke roterende lijkt disc elektrode55 en de maximale stroom is onafhankelijk van debiet (Figuur 5). Opmerking: De oplosbaarheidsgrens van H2 in water is ~0.8 mM bij 293 K en 1 bar.</li>
	<li>Als het monster nu klaar voor PFIRE metingen is, verzamelen spectra op een scala aan mogelijkheden, onder een aantal voorwaarden van de oplossing (pH, temperatuur, H2 concentratie enz.). Alle elektrochemische gegevens met behulp van de software van de potentiostaat, want het is belangrijk om het correleren van spectroscopische en elektrochemische gegevens, met name bij de studie van electrocatalytic processen zoals H2 oxidatie door Hyd1 te kunnen opnemen.</li>
</ol>5. spectroscopische gegevens behandeling
<ol><li>Bevestigen dat de actieve site niet permanent veranderd in de loop van de metingen door het opnemen van spectra op 0 V en −0.8 V vs SCE aan het einde van het experiment. Deze moeten identiek zijn aan de spectra opgenomen in 4.3, en geen verlies van actieve site moet worden waargenomen tijdens de meting (Figuur 6).</li>
	<li>Absolute extinctie spectra van de spectrometer software in een geschikt formaat exporteren (.csv, ASCII, 'matlab", Jcamp etc.) voor verwerking met behulp van software zoals oorsprong of Matlab.</li>
	<li>
Basislijn corrigeren de gegevens, met behulp van het proces geïllustreerd in Figuur 7.
	<ol>
<li>Het bereik 1.800-2,150 cm-1, de tweede afgeleide van elk extinctie spectrum deelnemen teneinde kleine (< 1 mO.D.) actieve site bands tegen de achtergrond van zeer-gebogen water.</li>
		<li>Basislijn marker punten plaats op het oorspronkelijke extinctie spectrum en stel de punten ' snap ' tot de experimentele spectrum.</li>
		<li>Past een basislijn door de punten met behulp van een geïnterpoleerde kubieke spline functie of een polynomiale functie. Deze functie van de basislijn van de experimentele gegevens aftrekken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

PFIRE is een breed toepasbare IR spectroscopische techniek voor de aanpak van redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten. In het bijzonder, kunnen electrocatalytic reacties van Redoxenzymen worden gesondeerd omstandigheden snel omzet. De PFIRE methode bouwt voort op de directe elektrochemische besturing geboden door de techniek van PFE, die geeft geen directe structurele informatie, en het koppelt aan IR spectroscopie op een koolstof-elektrode. De PFIRE benadering dus voegt chemische inzicht om de beschikbare informatie uit elektrochemie alleen en is zeer geschikt voor het bestuderen van redox eiwitten en enzymen betrokken bij klein molecuul bindende en activering. Bovendien bieden PFIRE informatie over potentieel-afhankelijke structurele veranderingen in de eiwitten in de afwezigheid van katalytische omzet. Dergelijke niet-omzet elektron overdracht gebeurtenissen zijn vaak moeilijk op te sporen met behulp van de 'standaard' toepassingen van PFE, hoewel de uitbreiding van PFE tot Fourier-getransformeerd AC voltammetrie is gebruikt met succes. 45 , 46
De PFIRE-methode is in principe geschikt voor de studie van elke redox-eiwit dat kan worden bestudeerd met behulp van PFE. Daarom, zoals bij PFE, eiwit adsorptie is een cruciale stap voor een succesvolle PFIRE experiment. In dit protocol beschrijven we een toepassing van de techniek van de PFIRE met behulp van E. coli Hyd1 als een case-studie. 36 , 43 echter we hebben ook toegepast de PFIRE-techniek op de cytoplasmatische regelgevende hydrogenase van R. eutropha,44 en flavine mononucleotide geadsorbeerde op carbon zwart. 40 in al deze gevallen biedt eenvoudige fysische adsorptie aan ongewijzigde hoge oppervlakte roet (zoals beschreven in dit Protocol) een oppervlak dekking van eiwit dat hoog genoeg is om goede kwaliteit IR spectra met een hoge signaal-/ ruisverhouding. In gevallen waarin dergelijke hoge mate van adsorptie kunnen niet worden bereikt kunnen moet het oppervlak van de koolstof deeltjes, bijvoorbeeld voor het toestaan van covalente gehechtheid van eiwitten aan het oppervlak van de elektrode te wijzigen. 60 , 61 , 62 het gebruik van een handschoenenkast voor metingen van de PFIRE is alleen strikt noodzakelijk als monstes dat anaëroob moet worden behandeld. Echter in de praktijk de zeer constante en lage (< 80 ° C dauwpunt) niveaus van waterdamp die worden geboden door de ' glovebox ' sfeer geven hoge signaal-ruis-waarmee de winning van zeer kleine verticaal absorptie. 44 in veel gevallen een anaëroob milieu, zoals dat verstrekt door de ' glovebox ', is ook wenselijk voor de elektrochemische meting (integraal deel uitmaakt van de PFIRE techniek) om te voorkomen dat de huidige vanwege O2 vermindering op de elektrode werken.
IR verticaal absorptie als gevolg van bulk water, experimentele buffers en de koolstof deeltjes waarop het monster is geadsorbeerd alle aanzienlijk bijdraagt aan de experimentele spectra en kunnen elkaar overlappen bands van belang, met name in het amide I, II en III-regio's van de spectrum. 63 de amide-regio bevat ook gegevens uit biologische soorten zoals flavins of cofactoren nicotinamide, evenals de substraten en producten van vele reacties van oxidatie en reductie. In het geval van connectoren hydrogenases, νCO en νCN bands van de actieve site vallen in een relatief duidelijk deel van het spectrum en zo de PFIRE-techniek is zeer goed geschikt voor de studie van deze enzymen. In andere gevallen echter kunnen verschil spectra in combinatie met isotopische etikettering benaderingen nodig zijn om isoleren van veranderingen als gevolg van de geïmmobiliseerdet proteïne. Soortgelijke benaderingen zijn gebruikt, bijvoorbeeld Protonering om veranderingen te identificeren, structurele herschikkingen en te bestuderen of Michaelis-Menten complexen met behulp van IR spectroscopie. 64 , 65 , 66 PFIRE is dan ook niet, beperkt tot de studie van hydrogenases maar kan worden toegepast op elke redox-eiwit dat bevat (of waarvan substraten, de producten of de remmers bevatten) groepen met diagnostische IR-actieve trillingen; koolmonoxide dehydrogeanses nitrogenases67 ,68,,14 flavoproteinen,40 en formate dehydrogenases, bijvoorbeeld.
De verwante techniek, SEIRA, is zeer goed geschikt voor de studie van membraan-geassocieerde eiwitten in een biomimetische omgeving. 32 SEIRA is een aanpassing van de IR spectroscopie, dat ook een ATR-IR-configuratie gebruikt, en maakt gebruik van een verhoging van de oppervlakte-effect dat de IR-absorptie van moleculen gelegen dicht bij (binnen een paar nm versterkt) van het oppervlak van het ATR-prisma (IRE). SEIRA is dan ook prachtig gevoelig voor spectrale veranderingen die zich voordoen binnen de geadsorbeerde eiwitten en membraan architectuur en is relatief vrij van concurrerende signalen van oplosmiddel en substraten/remmers presenteren in oplossing. Dit is enigszins in tegenstelling tot de techniek van de PFIRE die hier worden beschreven, die gebaseerd op een aanzienlijk grotere indringingsdiepte boven het oppervlak van het IRE is (~ 1 µm), wat betekent dat PFIRE gevoeliger voor substraten is, producten of remmers presenteren in oplossing. Deze verhoogde gevoeligheid voor 'bulk' oplosmiddel kan nuttig zijn; Als het substraat of product worden rechtstreeks door IR waargenomen kan, verslag PFIRE spectra over beide steady-state kinetiek van langlevende actieve soorten en bijbehorende productvorming tijdens electrocatalysis. 69 de mogelijkheid om te observeren steady-state concentratie van substraat en product zullen met name waardevol voor enzymen zoals koolmonoxide dehydrogenase (die katalyseert de omkeerbare oxidatie van CO-CO2, een sterke IR-absorber) of formate dehydrogenase (die katalyseert de omkeerbare oxidatie van formate CO2).
Op dit moment is de PFIRE beperkt tot steady-state kinetische studies van enzym electrocatalysis als gevolg van de macroscopische Koolelektroden gewend 'concentreren' het enzym op het oppervlak van een IRE voor het verzamelen van de gegevens in en ATR-IR geometrie. In dit opzicht zijn PFIRE studies van connectoren hydrogenases complementair aan het werk van Dyer en medewerkers,49,50 , die gebruik maken van licht-geactiveerd voorbijgaande absorptie IR spectroscopie te bestuderen sub omzet kinetiek. Er wordt gewerkt aan de spectroelectrochemical cel,40 miniaturize en met het gebruik van microelectrodes tijd resolutie over de volgorde van microseconden moet haalbaar zijn. Dit maakt studie van sub omzet kinetiek voor enzymen met omzet frequenties tot ca 100-500 s-1, en de studie van zowel reductieve en oxidatieve processen in staat zal stellen.
PFIRE is over het algemeen een spectroscopische techniek waarmee chemische karakterisering van electrocatalytic reacties van Redoxenzymen steady-state omstandigheden. De aanpak van de PFIRE maakt het mogelijk meerdere chemische en elektrochemische titraties worden uitgevoerd op hetzelfde enzym monster, zoals de hoge oppervlakte elektroden gebruikt een robuuste adsorptie van eiwit bieden en de geometrie van de ATR-IR mogelijk facile oplossing te wisselen maakt. De mogelijkheid voor het verzamelen van dergelijke structurele informatie in situ tijdens enzym functie is een waardevol instrument voor de bredere gemeenschap van de bioelectrochemistry.

Een belangrijke uitdaging in de studie van eiwitfunctie heeft betrekking op de ontwikkeling van in situ methoden waarmee directe observatie van eiwitten verrichten hun fysiologische functies, in vivo of met behulp van geïsoleerd EiwitSteekproeven. Dit vereist de integratie van controle of triggering processen in experimentele procedures en het gebruik van gecombineerde technieken waarmee zowel de reactiviteit te worden beoordeeld, en afzonderlijke chemische stappen tijdens eiwitfunctie te worden gemeten, tegelijkertijd. In het geval van redox eiwitten is dit vaak gelijk aan het combineren van elektrochemische technieken, die juist controle van de toegepaste potentieel, maar bieden geen rechtstreekse chemische informatie, met spectroscopische technieken die gevoelig voor chemisch-specifieke zijn wijzigingen eiwitfunctie is gekoppeld. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry is een algemene term voor een aantal gekoppelde elektrochemische en spectroscopische methoden die een verscheidenheid van spectroscopische technieken en niveaus van elektrochemische controle omvatten. Veel eiwitten elektronen met kunstmatige, oplosbaar elektron donoren en Acceptanten kunnen uitwisselen en dit heeft benut in studies die gebruik maken van kleine molecules te bemiddelen elektron overdracht, met inbegrip van de koppeling met UV-zichtbaar,4,5 , 6 , 7 magnetische circulair dichroïsme8 en infrarood5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. In een beperkt aantal gevallen is het mogelijk om te exploiteren onbemiddelde, diffusie-gecontroleerde elektron uitwisseling tussen eiwitten en elektroden gebleken. 15 , 16
Voor katalytische reacties uitgevoerd door Redoxenzymen, oplossing elektrochemie benaderingen aanwezig een duidelijk nadeel. Elektron diffusie-gecontroleerde overdracht via redox bemiddelaars in oplossing dreigt te worden snelheidslimieten. Kinetische en mechanistische informatie over het enzym of kan worden verloren, op zijn minst moeilijk te deconvolute van diffusie artefacten die voortvloeien uit de experimentele methode. Directe, spontane elektrochemische controle is daarom een belangrijk instrument voor de studie van redox eiwitten en enzymen. De techniek van eiwit film elektrochemie (PFE) werkzaam redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten, op zodanige wijze dat de elektronen rechtstreeks naar of vanuit de redox cofactoren binnen de proteïne worden overgedragen zoals de elektrode is gepolariseerd op een reeks van mogelijkheden. 17 , 18 , 19 PFE is van bijzonder belang voor de studie van oxidatie of reductie reacties gekatalyseerd door Redoxenzymen, zoals Interfaciale elektronen overdracht kan worden bereikt op een zeer hoog tempo. Bijvoorbeeld, werd de Verwerkingsfrequentie van de electrocatalytic van de nikkel-ijzer ([connectoren]) hydrogenase van Allochromatium vinosum gemeten door PFE als ca 1.000-10.000 s−1 voor H2 oxidatie. 20 de potentiële elektrode fungeert als een trigger om katalyse 'aan' of 'uit', en de huidige verslagen van electrocatalytic over de enzymactiviteit te zetten. PFE is dus een waardevolle methode voor het analyseren van de reactiviteit van complexe enzymen die nauw afhankelijk zijn potentieel, zoals de reacties van de di-strijkijzer actieve site van [FeFe]-hydrogenases met CO en O2,21 of potentieel-geïnduceerde de reacties van de inactivatie van22 koolmonoxide dehydrogenase,23 , hydrogenases en andere complexe Redoxenzymen. 24
De belangrijkste belemmering voor spectroscopische technieken te combineren met de directe elektrochemische besturing geboden door PFE vloeit voort uit de lage oppervlakte dekking van Redoxenzymen, over de volgorde van 1-2 pmol cm-2 voor de [connectoren] hydrogenase van A. vinosum, 20 ten opzichte van de in situ oppervlaktekunde studies van klein molecuul adsorbates op bulk metalen elektroden. Dit vormt een uitdaging voor de gevoeligheid van de spectroscopische meting. Verschillende spectroelectrochemical methoden zijn gemeld voor het bestuderen van geïmmobiliseerd redox eiwitten op een aantal verschillende elektroden: UV-zichtbaar spectroscopie op transparante metaaloxide-elektroden; 25 , 26 , 27 Fluorescentiespectroscopie op gouden elektroden; 28 , 29 oppervlakte verbeterde infraroodabsorptie (SEIRA) spectroscopie op gouden elektroden; 30 , 31 , 32 , 33 en oppervlak verbeterd Raman spectroscopische technieken, hoofdzakelijk op zilveren elektroden. 34 , 35
Hier beschrijven we een methode voor het koppelen van PFE met IR spectroscopie, in een techniek die bekend staat als eiwit film infrarood elektrochemie (PFIRE). 36 de PFIRE methode bestudeert Redoxenzymen geïmmobiliseerd op een hoge oppervlakte koolstof werken elektrode in combinatie met een verzwakte totale reflectantie IR (ATR-IR) geometrie, benutting van het gemak van adsorptie van een reeks eiwitten op koolstof oppervlakken. IR spectroscopie is nuttig in studies van Redoxenzymen en eiwitten als vele kleine molecules, liganden en cofactoren diagnostische verticaal absorptie die kunnen worden gebruikt om bindende, remming, reactiviteit en redox toestand te beoordelen. Voorbeelden zijn bindend voor NO tot ijzer-zwavel centra,37 studie van flavoproteinen,38,39,40 klein molecuul te binden aan Heem centra enz. 41 de ATR-IR geometrie maakt de bouw van een geoptimaliseerde drie-elektrode (spectro) elektrochemische cel42 en daarom biedt uitstekende elektrochemische controle. Oplossing resistentie en mogelijke drift zijn geminimaliseerd door het plaatsen van een referentie-elektrode dicht bij de werken-elektrode. Hoge oppervlakte teller elektroden worden gebruikt die compatibel met hoge electrocatalytic stromingen geproduceerd door snelle enzym omzet op de elektrode werken zijn. Stroom van oplossing via de spectroelectrochemical cel biedt facile controle over de concentratie van substraten, inhibitors en pH. 36 , 43 , 44 de PFIRE methode kan daarom IR spectra te worden opgenomen in situ tijdens aanhoudende enzym electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE is ook geschikt voor het verstrekken van chemische informatie in de afwezigheid van katalytische huidige,43 in tegenstelling tot PFE waar het moeilijk is om informatie te extraheren uit niet-katalytische processen in Redoxenzymen kan zijn. 45 , 46
Wij hebben de methode van de PFIRE voor de studie van electrocatalytic H2 oxidatie aangetoond door [connectoren] hydrogenases, waarin intrinsieke CO en GN-liganden afgestemd op Fe op een bimetallic actieve site. 36 , 43 , 44 [connectoren] hydrogenases zijn dan ook bijzonder geschikt om te bestuderen door PFIRE. De methode PFIRE bevat informatie over de soorten die aanwezig tijdens steady-state omzet zijn, en biedt daarom cruciaal mechanistische inzicht naast de rijkdom van de literatuur op IR spectroscopie van hydrogenases zonder experimentele controle over omzet. 47 , 48 Dyer en collega's hebt gebruikt time-resolved IR methoden om te studeren van connectoren hydrogenases,49,50,51 met behulp van een licht trigger toe te passen of een kleine negatieve potentiële stap (via gebruik van oplossing bemiddelaars/mediators en de bron van een 'gekooide' elektron) of photolyse een afhankelijke hydride. Hoewel de PFIRE-methode kan niet, op dit moment tijd resolutie bieden aan deze metingen,40 doet het bestuderen van zowel reductieve en oxidatieve katalytische processen, geraadpleegd op een aantal duidelijk omlijnde potentieel toestaan en vrij van collectief vervoer beperkingen.
De methode PFIRE is verschillend van SEIRA studies van redox eiwitten, die ook de geometrie van een ATR-IR te gebruiken en een nanoschaal-geruwd metaalelektrode ter verbetering van de IR-absorptie van moleculen geadsorbeerd aan het oppervlak van de elektrode in dienst. 30 SEIRA is een uiterst waardevolle techniek voor het bestuderen van membraaneiwitten, in het bijzonder aan geadsorbeerde of binnen mimetische membraan platforms,32 maar de behoefte aan een metalen elektrode kunt beperken het toepassingsgebied van het substraat en remmer als gevolg van reactiviteit van het elektrode-steun ten behoeve van kleine molecules zoals CO, GN--, CO2 enz. Vermindering van de proton en desorptie van zelf geassembleerde enkelgelaagde kunnen worden op metalen oppervlakken op zeer negatieve potentieel problematisch, heeft1,52 hoewel enzym electrocatalysis op onbeschermde elektroden metalen gemeld. 53 , 54 een nadeel van PFIRE ten opzichte van SEIRA is de relatieve moeilijkheidsgraad van het opnemen van membraaneiwitten in native modus of mimetische membraan platforms. Echter, de relatieve chemische bestendigheid van de Koolelektroden concurrerende klein molecuul activering reacties maakt PFIRE een uitstekende techniek voor het bestuderen van enzym electrocatalysis, met name in het lage-potentieel domein relevant zijn voor biologische redox processen zoals proton vermindering door hydrogenases. 1 , 43
Het doel van dit artikel is om de methode van de PFIRE als een techniek voor het bestuderen van redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten, connectoren hydrogenase 1 (Hyd1) van Escherichia coli gebruiken als voorbeeld. Overwegingen voor de bereiding van de monsters, de behoefte goed substraat stroom en gegevensverwerking worden besproken. PFIRE is een breed toepasbare techniek, goed geschikt voor het bestuderen van eventuele redox-eiwit (met karakteristieke IR verticaal absorptie) dat kan worden geadsorbeerd op Koolelektroden, hetzij rechtstreeks of met behulp van oppervlakte modificatie, zodanig dat het elektronen met wisselen kan de elektrode.

<table><tbody><tr><td>Spectrometer</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>met een externe MCT-detector</td></tr><tr><td>ATR-accessoire</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>Aangepast voor gebruik met een 5-reflectie Si IRE</td></tr><tr><td>Handschoenenkast</td><td>Glove Box Technology Ltd.</td><td>N/A</td><td>Op maat ontworpen 'nat' en 'droog' kast voor anaërobe monsterbehandeling en meting</td></tr><tr><td>KBr-venster</td><td>Crystran</td><td>Aangepast</td><td>Om koppeling van de handschoenenkast met de externe straal van de FTIR-spectrometer mogelijk te maken</td></tr><tr><td>Aanvullende optiek</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>Componenten van een PM-IRRAS-accessoire</td></tr><tr><td>Silicium IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>Aangepast</td><td>Trapezium: 8,4 mm x 5 mm (grote zijde), 1 mm dikte, ca 39 graden gezichtshoek</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Software voor het besturen van de potentiostat</td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Pt-draad</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99,95% Zuiver platinadraad, 0,014 inch diameter</td></tr><tr><td>Koolstofstaaf</td><td>WH Smith</td><td>30729209</td><td>0,7 mm HB potloodspits</td></tr><tr><td>Rutskool</td><td>Cabot Corporation</td><td>Black Pearls 2000</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon bad</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>Centrifugeerfilter</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW-afsnijding</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>MiniSpin</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>S/9240/PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher</td><td>N/2300/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Siliconenkit</td><td>Cow Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>Koolstofpapier</td><td>Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2-gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2-gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Gegevensanalyse/grafieksoftware</td></tr><tr><td>Resolutions Pro 4.0</td><td>Varian</td><td></td><td>Software voor het besturen van FTIR-spectrometer</td></tr></tbody></table>

eiwit film infrarood elektrochemie voor studie van h2 oxidatie aangetoond door een hydrogenase [connectoren]

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Inzicht in de chemie van redox eiwitten eisen methoden waarmee nauwkeurige controle over redox centra binnen de proteïne. De techniek van eiwit film elektrochemie, die een eiwit op het oppervlak van een elektrode is geïmmobiliseerd, zodanig dat de elektrode fysiologische elektron donors of acceptanten vervangt, heeft verstrekt functionele inzicht in de redoxreacties van een aantal verschillende eiwitten. Volledige chemische inzicht vereist elektrochemische control worden gecombineerd met andere technieken die extra structurele en mechanistische inzicht kunnen toevoegen. Hier tonen we een techniek, eiwit film infrarood elektrochemie, die eiwit film elektrochemie met infrarood spectroscopische bemonstering van redox eiwitten combineert. De techniek maakt gebruik van een multiple-reflectie verzwakte totale reflectantie geometrie sonde een redox-eiwit geïmmobiliseerd op een hoge oppervlakte roet elektrode. Opneming van deze elektrode in een flow-cel kan pH van de oplossing of opgeloste concentraties worden gewijzigd tijdens de metingen. Dit is bijzonder krachtig bij de aanpak van Redoxenzymen, waar snelle katalytische omzet kan worden ondersteund en gecontroleerd op de elektrode spectroscopische waarnemingen van langlevende tussenliggende soorten in de katalytische mechanisme toe te staan. We laten zien dat de techniek met experimenten op E. coli hydrogenase 1 niet-omzet onder omzet (H2 oxidatie).

Hier beschrijven we een techniek, eiwit film infrarood elektrochemie, waarmee geïmmobiliseerdet redox eiwitten spectroscopically worden bestudeerd onder directe elektrochemische controle op een koolstof-elektrode. Infrarood spectra van een enkele eiwitSteekproef kunnen opgenomen worden op een scala van toegepaste potentieel en onder uiteenlopende omstandigheden van de oplossing.

Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H2 oxidatie aangetoond door een Hydrogenase [connectoren]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Het algemene doel van dit protocol is om de chemie van de actieve zijde van een nikkel-ijzer hydrogenase redoxenzym te onderzoeken onder zowel niet-omzettende als steady-state elektrokatalytische omzettingscondities met behulp van proteïnefilm infrarood-elektrochemie of PFIRE. Het belangrijkste voordeel van de PFIRE-techniek is dat het gelijktijdige precieze elektrochemische controle en infrarood spectroscopische bemonstering mogelijk maakt van redoxproteïnen die zijn geïmmobiliseerd op een koolstofelektrode. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biofysica en bioelektrochemie over welke toestanden van het redoxproteïne aanwezig zijn tijdens steady-state katalytische omzetting.Om de procedure te starten, suspendeer in een natte anaerobe glovebox 20 milligrams carbon black-deeltjes met een hoog specifiek oppervlak in één milliliter ultrapuur water. Sonicate de suspensie op een laag vermogen gedurende ten minste 15 minuten of totdat de deeltjes uniform zijn gedispergeerd en er binnen één uur rust geen sediment wordt gevormd. Laad vervolgens 15 microliters van een oplossing van E.Coli hydrogenase one met een concentratie van ongeveer zeven milligram per milliliter in een centrifugale filterunit van 50 kilodalton.Verdun de oplossing met 450 µL van een uitwisselingsbuffer met een lage ionsterkte en een pH die dicht bij het isoelektrisch punt van de hydrogenase ligt. Concentreer het mengsel tot 50 µL door centrifugatie bij 27.000 ×g. Herhaal dit concentratieproces nog vier keer om de bufferuitwisseling te voltooien.Combineer vervolgens 5 µL van de 20 mg/mL carbon black dispersie met de buffer-uitgewisselde hydrogenase. Bewaar het mengsel een nacht bij 0 °C om de hydrogenase te laten adsorberen aan de carbon black deeltjes. Controleer het mengsel periodiek om de deeltjesdispersie te behouden.Centrifugeer de gemodificeerde deeltjes bij 27,000 ×g en controleer of het supernatant vrijwel kleurloos is, wat duidt op een goede absorptie van de hydrogenase aan de deeltjes. Het bereiken van een hoog absorptieniveau is essentieel voor het slagen van het experiment. We optimaliseren de absorptiebuffer door uit te gaan van de buffer met lage ionsterkte bij een pH die dicht bij het isoelektrisch punt van het eiwit ligt.Was de deeltjes met drie tot vijf cycli van centrifugatie en resuspensie in verse uitwisselingsbuffer. Concentreer het deeltjesmengsel tot ongeveer 5 µL om een deeltjesbelading van 20 mg/mL te bereiken. Om de voorbereiding voor de PFIRE-metingen te starten, reinigt u een siliconen intern reflectie-element door middel van sonicatie met laag vermogen in zwavelzuur gedurende 15 minuten.Vervolgens wordt salpeterzuur gedurende één uur gebruikt. Spoel het element daarna af met ultrapuur water en droog het onder een stroom droog stikstofgas. Gebruik siliconenkit van elektrische kwaliteit om de IRE in de basisplaat van een ATR-accessoire met vijf reflecties te bevestigen, waarbij u er zorg voor draagt dat de kit beperkt blijft tot de randen van de IRE.Laat het afdichtmiddel volledig drogen. Plaats de basisplaat vervolgens in een droge anaerobe glovebox met een IR-transparant venster naast een FTIR-spectrofotometer. Monteer de basisplaat op het ATR-accessoire.Neem een achtergrondspectrum op in de rapid scan-modus. Verwijder vervolgens de basisplaat van het ATR-accessoire en breng deze over naar de natte anaerobe handschoenenkast. Breng één µL van de met enzymen gemodificeerde carbon black-deeltjes gelijkmatig aan via dropcasting op het IRE-oppervlak, zonder de deeltjes volledig te laten drogen.Het is belangrijk dat het mengsel van enzym-gemodificeerde deeltjes is geconcentreerd tot een belading die zo dicht mogelijk bij 20 mg/mL ligt. Anders kan het moeilijk zijn om een goed verbonden deeltjesfilm te verkrijgen bij het dropcasten van de deeltjes in deze stap. Plaats voorzichtig een stukje koolstofpapier dat is gedrenkt in ultrapuur water op het IRE-oppervlak, waarbij u ervoor zorgt dat de deeltjesfilm wordt bedekt zonder dat het papier in contact komt met de siliconenkit.Plaats een op maat gemaakte spectroelektrochemische cel over de IRE. Voeg 200 µL experimentele buffer toe via de vloeistofinlaat om het enzym gehydrateerd te houden tijdens de systeembereiding. Verbind de vloeistofinlaat en -uitlaat met een vial experimentele buffer via peristaltische pompslangen.Breng de geassembleerde cel vervolgens over naar de droge glovebox. Monteer de celassemblage op het ATR-accessoire en sluit de slang aan op de peristaltische pomp. Neem een absorptiespectrum op, waarbij het eerder verkregen spectrum als achtergrond wordt gebruikt.Verifieer dat de MI2-banden sterk zichtbaar zijn bij 1.540 reciproke centimeters en dat de pieken van het actieve centrum van de hydrogenase detecteerbaar zijn in de regio van 1.850 tot 2.150. Om het experiment voor te bereiden, wordt een reducerend potentiaal van -0,8 V ten opzichte van een verzadigde calomel-referentie-elektrode aangelegd op de partikelfilm. Verzadig de experimentele buffer met anaeroob waterstofgas.Laat vervolgens de buffer met een snelheid van ongeveer 12 milliliters per minuut door de spectro-elektrochemische cel stromen. Laat het monster een nacht lang onder de stroom van waterstofverzadigde experimentele buffer staan om de hydrogenase te activeren. Neem een absorptiespectrum van het geactiveerde monster op en verifieer dat de CO- en CN-banden van het actieve centrum meerdere gereduceerde toestanden vertonen.Verzadig vervolgens de experimentele buffer met anaëroob stikstofgas en laat de buffer door de cel stromen. Pas gedurende 30 minuten een oxiderend potentiaal van nul volt aan ten opzichte van een verzadigde calomel-referentie-elektrode en neem een absorptiespectrum op. Pas daarna gedurende 30 minuten een reducerend potentiaal toe en neem opnieuw een spectrum op.Verifieer of het enzym volledig is geoxideerd en vervolgens is gereduceerd. Controleer anders de elektrische verbindingen van de cel. Verkrijg met behulp van anaerobe, met waterstof verzadigde buffer een reeks cyclische voltammo-grammen bij toenemende stroomsnelheden om de optimale stroomsnelheid voor het experiment te bepalen.Verkrijg met deze stroomsnelheid spectra bij een reeks potentialen en oplossingscondities. PFIRE-metingen van E.coli hydrogenase one werden uitgevoerd bij verschillende potentialen in een inerte atmosfeer en in de aanwezigheid van waterstofgas. De spectra die onder een waterstofatmosfeer werden verkregen, representeerden de steady-state distributies van de actieve site-toestanden die aanwezig waren tijdens de katalytische waterstofoxidatie.De anaerobe oxidatie en activering van de hydrogenase via de vorming van de nikkel-B-toestand uit de nikkel-Si-toestand werd vervolgens onderzocht door spectra te verkrijgen op verschillende tijdstippen tijdens de potentiaaltoepassing en door verschillende spectra op te stellen ten opzichte van het eerste spectrum. De waargenomen geleidelijke omzetting van nikkel-Si naar nikkel-B was consistent met de monotone afname van de stroom. Er werden ook spectra verkregen over een reeks pH-waarden van de oplossing om de protonoverdrachtsstappen van de katalytische cyclus van de hydrogenase te onderzoeken.Bij een lage pH kwam de nikkel-C-toestand vaker voor, terwijl de nikkel-L-toestand vaker voorkwam bij een hoge pH. De pH-afhankelijkheid van de relatieve concentraties van nikkel-C en nikkel-L werd bepaald aan de hand van de maximale absorptiewaarden van de respectievelijke pieken bij elke pH die in het experiment werd geëvalueerd. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het vakgebied van de bioelektrochemie om de steady-state kinetiek van waterstofactivatie door hydrogenese te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van een typisch PFIRE-experiment. De techniek is geschikt voor elk redoxeiwit dat bestudeerd kan worden via proteïnefilm-elektrochemie en voegt direct chemisch inzicht toe aan de elektrochemische meting.

protein-film-infrared-electrochemistry-demonstrated-for-study-h2

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit artikel beschrijft de procedure voor het synthetiseren een hydrofobisch gemodificeerd Nafion enzym immobilisatie membraan en hoe eiwitten en / of enzymen te immobiliseren in de membraan en testen hun specifieke activiteit.

Hydrofobe Salt gemodificeerde Nafion voor enzym immobilisatie en stabilisatie

We presenteren een uniek platform voor het karakteriseren van elektrode oppervlakken in vaste oxide brandstofcel (SOFC) die gelijktijdig uitvoeren van meerdere karakterisatietechnieken...

Indringende en in kaart brengen van elektrode-oppervlakken in Solid Oxide Fuel Cells

De studie toont de groei van iridium-oxide gereduceerd grafeen oxide (IrO 2 -RGO) nanohybride dunne films op onregelmatige en ruwe gezeefdrukt koolstof substraat door middel van een groene elektrochemische synthese, en de uitvoering ervan als een pH-sensor met een patroonpapier-vloeibare platform .

Iridium-Oxide gereduceerde Grafeen Oxide nanohybride Thin Film Modified Gezeefdrukt elektroden als Disposable elektrochemische Paper microfluïdische pH Sensoren

We illustreren de toepassing van 1 H (15 N, αγ) 12 C resonante nucleaire reactie analyse (NRA) de dichtheid van waterstofatomen op het oppervlak kwantitatief evalueren, het volume, en een tussenlaag van vaste stoffen. Het nabije oppervlak waterstof diepteprofilering van een Pd (110) monokristal en SiO2 / Si (100) stapels beschreven.

Kwantificering van waterstof concentraties in Functionele Lagen en Bulk Materials door middel van diepte- met Nuclear Reaction Analysis

Mitochondriën bevatten verschillende flavin-afhankelijke enzymen die van reactieve zuurstof soorten (ROS produceren kunnen). Controle van ROS is vrijlating uit afzonderlijke sites in mitochondriën uitdagend als gevolg van ongewenste kant reacties. We presenteren een gemakkelijke en goedkope methode voor directe beoordeling van inheemse tarieven voor ROS release met behulp van gezuiverde flavoenzymes en microplate fluorometry.

Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

Hier presenteren we een protocol voor de synthese en elektrochemische testen van overgangsmetalen enkele atomen gecoördineerd grafeen vacatures als actieve centra voor selectieve kooldioxide te beperken tot controle van de koolmonoxide in waterige oplossingen.

Synthese and Characterizations van de prestaties van overgangsmetalen enkel atoom katalysator voor elektrochemische CO2 reductie

Hier presenteren we een protocol voor photoelectron imaging anionogene soorten. Anionen gegenereerd onder vacuüm en gescheiden door massaspectrometrie zijn gesondeerd met behulp van snelheid toegewezen photoelectron imaging, het verstrekken van gegevens anion, neutrale energieniveaus, anion en neutrale structuur en het karakter van de elektronische staat van anion.

Photoelectron beeldvorming van anionen geïllustreerd door 310 Nm detachement van F−

Dit protocol toont een handige methode voor het vergelijken van de katalytische eigenschappen van ondersteunde platinakatalysatoren, gesynthetiseerd door afzetting van nanosized colloïden of door impregnatie. De hydrogenering van cyclohexeen dient als een modelreactie om de katalytische activiteit van de katalysatoren te bepalen.

Katalytische reacties bij amine-gestabiliseerde en ligandvrije platina nanodeeltjes ondersteund op Titania tijdens hydrogenering van alkenen en aldehyden

Dit protocol introduceert het ontwerp en de evaluatie van innovatieve driedimensionale elektroden voor waterstofperoxide-brandstofcellen, waarbij gebruik wordt gemaakt van Au-gegalvaniseerde koolstofvezeldoek en Ni-schuimelektroden. De onderzoeksresultaten benadrukken het potentieel van waterstofperoxide als een veelbelovende kandidaat voor duurzame energietechnologieën.

Membraanloze waterstofperoxide-brandstofcellen als veelbelovende schone energiebron

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Leer de PFIRE-techniek voor het bestuderen van redox-eiwitten zoals nikkel-ijzerhydrogenase. Deze methode combineert elektrochemische controle met infraroodspectroscopie voor inzicht in katalytische mechanismen.

Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H₂ oxidatie aangetoond door een Hydrogenase [connectoren]

Meer video's verkennen