Name: Nieuwe methoden voor het bestuderen van Gustatorische codering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Ontdek nieuwe methoden voor gustatorische codering in de mot Manduca sexta met extracellular tetrode-opnames en een smaakstofafgiftesysteem. Deze technieken helpen onderzoekers smaakinformatie in vivo te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een intramurale subsidie ​​van NIH-NICHD naar MS. Wij bedanken G. Dold en T. Talbot van de NIH-NIMH Instrumentation Core Facility voor hulp bij het ontwerpen van het smaakleveringssysteem.

<ol><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gustotopic+Map+of+Taste+Qualities+in+the+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain.</a> Science. 333 (6047), (2011).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Sense+about+Taste%3A+From+Mammals+to+Insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common Sense about Taste: From Mammals to Insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li>
<li>Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+coding+logic+for+bitter+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and coding logic for bitter taste.</a> Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).</li>
<li>Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+for+mammalian+sweet+and+umami+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The receptors for mammalian sweet and umami taste.</a> Cell. 115 (3), 255-266 (2003).</li>
<li>Huang, A. L., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+logic+for+mammalian+sour+taste+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and logic for mammalian sour taste detection.</a> Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).</li>
<li>Pfaffmann, C., Carl, <a target="_blank" href="http://psycnet.apa.org/journals/amp/14/5/226/">The afferent code for sensory quality.</a> Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).</li>
<li>Lemon, C. H., Katz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1995451/">The neural processing of taste.</a> BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Coding+of+Individual+Chemicals+by+the+Gustatory+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System.</a> J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).</li>
<li>Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+Taste+Stimuli+Induce+Differential+Neural+Codes+in+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain.</a> PLoS ONE. 7 (7), e41597(2012).</li>
<li>Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+different+taste+cells+and+signaling+pathways+to+the+discrimination+of+%22bitter%22+taste+stimuli+by+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).</li>
<li>Kay, L. M., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+in+the+olfactory+systems+of+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).</li>
<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(14)00153-6">Peripheral Coding of Taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+in+the+Mammalian+Gustatory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coding in the Mammalian Gustatory System.</a> Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).</li>
<li>Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+chemosensory+system+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+rewiew%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew.</a> Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).</li>
<li>Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+structures+involved+in+insect+gustation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central structures involved in insect gustation.</a> Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).</li>
<li>Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1051500206/abstract">Labellar taste organs of Drosophila melanogaster.</a> J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).</li>
<li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J Vis Exp. (84), e51355(2014).</li>
<li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila).</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li>
<li>Descoins, C., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+responses+of+gustatory+sensilla+of+Mamestra+brassicae+%28Lepidoptera%2C+Noctuidae%29+larvae+to+three+ecdysteroids%3A+ecdysone%2C+20-hydroxyecdysone+and+ponasterone%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone.</a> A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).</li>
<li>Popescu, A., Couton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+central+projections+of+gustatory+receptor+neurons+on+the+antenna+of+the+noctuid+moth+Spodoptera+littoralis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis.</a> J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).</li>
<li>Morita, H., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generator+potential+of+insect+chemoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generator potential of insect chemoreceptor.</a> Science. 130 (3380), 922(1959).</li>
<li>Davis, N. T., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomy+of+the+sucking+pump+of+the+moth%2C+Manduca+sexta+%28Sphingidae%2C+Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera).</a> Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).</li>
<li>Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00298032">The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly.</a> Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).</li>
<li>Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).</li>
<li>Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-specific%2C+sex+pheromone-selective+projection+neurons+in+the+antennal+lobes+of+the+moth+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta.</a> J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).</li>
<li>Reiter, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReiter%2C+S+%22Gustatory+Information+Processing%22">Gustatory Information Processing</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true">https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true</a> (2014).</li>
<li>Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-unit+Recording+Methods+to+Characterize+Neural+Activity+in+the+Locust+%28Schistocerca+Americana%29+Olfactory+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+noise+signature+to+optimize+spike-sorting+and+to+assess+neuronal+classification+quality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality.</a> J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).</li>
<li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Metrics+to+Accompany+Spike+Sorting+of+Extracellular+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals.</a> J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li>
<li>Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+sorting+of+multiple+unit+neuronal+signals+in+the+presence+of+anisotropic+and+non-Gaussian+variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability.</a> J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).</li>
<li>Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+memoir%3A+from+maps+to+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mushroom body memoir: from maps to models.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).</li>
<li>Naraghi, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+oscillations+in+the+mushroom+bodies+of+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust.</a> J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).</li>
<li>Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+representations+of+odors+in+an+olfactory+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal representations of odors in an olfactory network.</a> J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).</li>
<li>Perez-Orive, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+sparsening+of+odor+representations+in+the+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body.</a> Science. 297, 359-365 (2002).</li>
<li>Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(03)00535-X">Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system.</a> Neuron. 39, 991-1004 (2003).</li>
<li>Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+network+dynamics+and+the+coding+of+multidimensional+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Re+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals.</a> Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methoden maken het mogelijk om in vivo opnamen van een relatief eenvoudig dier, Manduca sexta , de activiteit van meerdere, willekeurig geselecteerde GRNs over lange duur (gedurende meer dan 2 uur) voor, tijdens en na de toevoer van de smaak te karakteriseren. Deze methoden staan ​​ook toe voor de snelle, opeenvolgende levering van meerdere tastant stimuli met nauwkeurige tijdelijke controle, voordelen die nuttig zijn voor het bestuderen van neurale mechanismen die onderliggende tastantrepresentatie liggen. Dit protocol is gebruikt om te bestuderen hoe de responsen van GRN&#39;s op proefpersonen worden getransformeerd wanneer ze worden overgedragen aan hun postsynaptische targetneuronen ( bijv. In de SEZ) tegelijkertijd met GRN&#39;s tegelijk met monosynaptisch verbonden interneuronen 10 worden gecontroleerd. Bovendien kunnen deze methoden worden aangepast aan de behoeften van de experimentator, waardoor de uitvoering van complexe paradigma&#39;s fundamentele aspecten van gustatorische codering kan bestuderen. Wanneer beginninG onze studies, een technisch probleem dat we soms moesten oplossen, was het onvermogen om spiking signalen te detecteren van de maxillaire zenuw met de tetrode draden. Mogelijke oorzaken hiervoor zijn uiteenlopend, aangezien het dissectieprotocol uitdagend is, en sommige oefening is nodig om een ​​goede voorbereiding te verkrijgen. Ten eerste zijn tijdens de motdissectie de maxillaire zenuwen gemakkelijk te beschadigen, vooral tijdens het verwijderen van de schede die het zenuwweefsel omringt. Ten tweede, als de schede niet volledig wordt verwijderd, kunnen de tetrode draden mogelijk niet toegang hebben tot de zenuw. In beide gevallen is het starten van een nieuwe voorbereiding vaak de makkelijkste manier om deze problemen op te lossen. Ten derde kan er een probleem zijn met de tetrode draden. Dit kan gecontroleerd worden door de impedantie van de draden te meten die ~ 1 kHz ~ 270 kΩ zouden moeten zijn. Als de impedantiewaarde hoger is dan ~ 300 kΩ, elektroden de draden met goud om de gewenste impedantie te bereiken (zie referentie 30 ). Ten vierde kan een stuk materiaal worden verbrokenOf verkeerd handelen. Een ander mogelijk probleem is dat spiking signalen worden opgenomen, maar de neuron (en) lijken niet te reageren op de smaakstoffen. Dit kan zijn omdat de opgenomen neuronen ongevoelig zijn voor de verzekerde reeks tastanten. Ook is belangrijk om in gedachten te houden dat naast de axonen van GRN&#39;s ook de maxillaire zenuw mechanische zenuwvezels draagt. Zo is het mogelijk om op te nemen van mechanosensorische neuronen in plaats van, of naast GRN&#39;s. Het tastingsleveringssysteem is echter ontworpen om een ​​constante mechanische invoer gedurende het experiment te leveren waardoor het onwaarschijnlijk is dat reacties op een proeverij zullen worden beschaamd door reacties op de mechanische component van de levering ervan. Neuronen die reageren op sommige maar niet andere smaken, of op verschillende manieren voor verschillende smaken, kunnen ondubbelzinnig worden ingedeeld als GRN&#39;s. Wij raden aan om verse verdunde smaakstoffen te gebruiken om variaties in de concentratie van de smaakstoffen of samenstelling te voorkomen als gevolg van samengestelde afbraak of verdampingVan het oplosmiddel. We raden u ook aan het systeem regelmatig te reinigen om te voorkomen dat de vervuiling van de buizen en / of belemmeringen voorkomt. Een ander mogelijk technisch probleem is een nadeel signaal-ruisverhouding. Dit probleem kan vaak opgelost worden door rechloriding of aanpassing van de positie van de badgrondelektrode. Andere oplossingen kunnen afscherming vereisen en de lengte van elke elektrische aansluiting in het apparaat minimaliseren. Tenslotte is het belangrijk om op te merken dat de juiste analyse van de gegevens die verkregen worden met behulp van tetrode-opnamen zorgvuldige spikesortering vereisen. We hebben geconstateerd dat volledig geautomatiseerde methoden over het algemeen onvoldoende zijn. Wij raden aan om vertrouwd te raken met de spik sorteerliteratuur voordat u tetrode data 10 , 29 , 31 , 32 , 33 analyseert. Alternatieven voor onze dissectie proTocol kan worden gebruikt. Hier beschrijven we een dissectie door het ventrale deel van de motkop, die toegang biedt tot de maxillaire zenuwen en SEZ, maar het is ook mogelijk om deze structuren te openen door middel van dissectie door de dorsale kant. We vonden dat de dorsale kantvoorbereiding niet optimaal is om opnamen te maken van deze gustatorische structuren door hun diepe locatie, maar dit preparaat biedt het voordeel om opnamen van hogere orde structuren te maken, zoals het paddestoel lichaam, een gebied dat is geassocieerd met multi -sensoriële integratie, associatief leren en geheugenverwerking 34 . We hebben zich geconcentreerd op het gebruik van tetrodeelektroden om vanaf de maxillaire zenuw te registreren, maar zoals geïllustreerd kunnen ook standaard intracellulaire scherpe elektroden voor dit doel worden gebruikt. Bovendien kunnen beide technieken gecombineerd worden om gelijktijdige opnamen uit meerdere hersengebieden 10 uit te voeren . De literatuur van de neurowetenschappen biedt veel voorbeelden van iNvertebrate modellen die bewezen zijn krachtige hulpmiddelen voor het onthullen van fundamentele principes van sensorische verwerking, zoals olfactorische codering, die van toepassing zijn op zowel insecten als gewervelde dieren 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Wij hopen dat onze methoden leiden tot fundamentele nieuwe inzichten over gustatory codering.

De damp- en olfactorische systemen genereren interne representaties van chemicaliën in het milieu, waardoor respectievelijk opvattingen van smaken en geuren ontstaan. Deze chemische zintuigen zijn essentieel voor het uitlokken van tal van gedragingen die kritisch zijn voor het overleven van het organisme, variërend van het vinden van vrienden en maaltijden om roofdieren en toxinen te vermijden. Het proces begint wanneer milieuchemische stoffen interactie hebben met receptoren in de plasmamembranen van sensorische receptorcellen; Deze cellen, direct of door middel van interacties met neuronen, transformeren informatie over de identiteit en concentratie van chemicaliën in elektrische signalen. Deze signalen worden dan overgebracht naar hogere orde neuronen en naar andere hersenstructuren. Naarmate deze stappen vooruitgang ondergaan, ondergaat het oorspronkelijke signaal altijd veranderingen die het vermogen van het organisme om de sensorische informatie te detecteren, discrimineren, classificeren, vergelijken en op te slaan bevorderen en een passende actie selecteren. Begrijpen hoe de behaIn transformeert informatie over milieukemikalieën om het beste uit te voeren op verschillende taken een fundamentele vraag in de neurowetenschappen. Vloeibare codering is relatief simpel gedacht: in het algemeen is het van mening dat elk chemisch molecuul dat een smaak ontstaat (een &quot;smaakstof&quot;) natuurlijk behoort tot een van de ongeveer vijf of zo fundamentele smaakkwaliteit ( dwz zoet, bitter, zure , Zout en umami) 1 . In deze &#39;basis smaak&#39;-weergave is het werk van het rookstelsel om te bepalen welke van deze basis smaken aanwezig zijn. Verder zijn de neurale mechanismen die basale smaakvoorstelling in het zenuwstelsel baseren, onduidelijk, en men vindt dat ze door een &quot;gelabelde lijn&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 of een &quot;overvezelpatroon&quot; 7 worden geregeerd </suP&gt; , 8 code. In een gelabelde lijncode reageert elke sensorische cel en elk van zijn neurale volgelingen op een enkele smaakkwaliteit, die samen een direct en onafhankelijk kanaal vormt voor hogere verwerkingscentra in het centrale zenuwstelsel dat gewijd is aan die smaak. In tegenstelling, in een cross fiber code, kan elke sensorische cel reageren op meerdere smaakkwaliteiten, zodat informatie over de smaakstof wordt weergegeven door de algemene respons van de populatie van sensorische neuronen. Het is onduidelijk of gustatory informatie wordt weergegeven door basis smaken, door middel van gelabelde lijnen of via een ander mechanisme, en is de nadruk op recent onderzoek 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Onze eigen recente werkzaamheden suggereren dat het gustatory systeem een ​​spatiotemporale populatiecode gebruikt om te genererenVertoningen van individuele smaken in plaats van basis smaak categorieën 10 . Hier bieden wij 3 nieuwe tools aan om te helpen bij het bestuderen van gustatorische codering. In de eerste plaats raden wij aan het gebruik van de hawkmoth Manduca sexta als een relatief eenvoudig model organisme dat geschikt is voor elektrofysiologische studie van smaak en beschrijft een dissectie procedure. Ten tweede stellen wij voor het gebruik van extracellulaire &quot;tetrodes&quot; om de activiteit van individuele GRN&#39;s op te nemen. En ten derde stellen wij voor een nieuw apparaat voor het leveren en bewaken van nauwkeurig geplande pulsen van smaakstof aan het dier. Deze instrumenten werden aangepast aan technieken die ons laboratorium en anderen hebben gebruikt om het olfactorische systeem te bestuderen. Insecten zoals de vruchtvlieg Drosophila melanogaster , de sprinkhaan Schistocerca americana , evenals de mot Manduca sexta, hebben al decennia krachtige bronnen geleverd om basisprincipes over de ner te begrijpenVous systeem, inclusief sensorische codering ( bijv. Olfaction 13 ). Bij zoogdieren zijn smaakreceptoren gespecialiseerde cellen die communiceren met neuronen via complexe second-messenger pathways 1 , 14 . Het is eenvoudiger in insecten: hun smaakreceptoren zijn neuronen. Voorts zijn zoogdierproeven in de buurt van de periferie relatief complex, met meerdere parallelle neurale routes, en belangrijke componenten zijn uitdagend om toegang te krijgen, bevattend in kleine benige structuren 15 . Insecten smaken wegen lijken eenvoudiger te zijn. In insecten bevinden zich GRN&#39;s in gespecialiseerde structuren bekend als sensilla, gelegen in de antenne, monddelen, vleugels en benen 16 , 17 . De GRNs projecteren direct naar de subesofageale zone (SEZ), een structuur waarvan de rol vooral geacht is 17 , en die tweede orde bevatGustatorische neuronen 10 . Van daaruit reist de informatie naar het lichaam om reflexen te richten en naar hogere hersengebieden die geïntegreerd, opgeslagen worden en uiteindelijk gedragskeuzes uitvoeren 16 . Het is noodzakelijk om perifere smaakreacties te karakteriseren om te begrijpen hoe smaakinformatie wordt vermenigvuldigd en getransformeerd van punt tot punt door het zenuwstelsel. De meest gebruikte methode om de neurale activiteit van GRN&#39;s in insecten direct te controleren is de tip-opname techniek 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Dit houdt in dat een elektrode direct op een sensillum wordt geplaatst, waarvan veel relatief gemakkelijk toegankelijk zijn. De smaakstof is opgenomen in de elektrode, waardoor men kan activeren en extremenMeet neuronale responsen van GRN&#39;s in het sensillum racellulair. Maar omdat de smaakstof in de elektrode aanwezig is, is het niet mogelijk om GRN-activiteit te meten voordat de proefpersoon wordt afgeleverd of nadat deze is verwijderd of om de smaakstoffen uit te wisselen zonder de elektrode 20 te vervangen. Een andere methode, de &quot;zijwand&quot; opname techniek, is ook gebruikt om de GRNs activiteit op te nemen. Hier wordt een opnamelektrode in de basis van een smaak sensillum 24 ingevoegd en tastanten worden geleverd via een aparte glazen capillaire op de punt van het sensillum. Beide technieken beperken opname van GRN&#39;s naar een bepaald sensillum. Hier stellen wij een nieuwe techniek voor: opnemen van willekeurig geselecteerde GRN-axons uit verschillende sensilla&#39;s, terwijl u afzonderlijk sequenties van tastants levert aan de proboscis. Axon opnames worden bereikt door het plaatsen van scherpe glaselektroden of extracellulaire elektrodebundels (tetrodes) in de zenuw die axonen draagt ​​vanGRNs in de proboscis naar de SEZ 10 . In Manduca passeren deze axonen de maxillaire zenuw, die bekend is dat ze zuiver afferent zijn, waardoor de ondubbelzinnige opname van sensorische reacties 25 mogelijk wordt . Deze methode van opname van axonen zorgt voor meer dan twee uur stabiele meting van GRN-reacties voor, tijdens en na een reeks tastante presentaties. Hier beschrijven we een dissectie procedure voor het blootstellen van de maxillaire zenuwen samen met de SEZ, waarmee men tegelijkertijd de responsen van meerdere GRN&#39;s en neuronen in de SEZ 10 opneemt. We beschrijven ook het gebruik van extracellulaire opnames van GRN&#39;s met behulp van een op maat gemaakte 4-kanaals gedraaide draadtetrode die in combinatie met een spikesorteringsmethode de analyse van meerdere (in onze handen tot zes) GRN&#39;s tegelijkertijd toelaat. We vergelijken verder opnamen gemaakt met tetrodes op opnames gemaakt met scherpe intracellulaireelektroden. Tenslotte beschrijven we een nieuw apparaat voor het leveren van tastant stimuli. Aangepast aan apparatuur die veel onderzoekers gebruikt om geurstoffen te leveren in oliveringsstudies, biedt ons nieuwe apparaat voordelen voor het bestuderen van vergassingen. Verbetering op eerdere multichannel afleveringssysteem, zoals die ontwikkeld door Stürckow en collega&#39;s (zie referenties 26 , 27 ), bereikt ons apparaat precies Controle over het tijdstip van de levering van de smaak, terwijl u deze tijdsindicatie geeft; En het laat de snelle, opeenvolgende levering van meerdere tastant stimuli 10 toe . Het apparaat badt de proboscis in een constante stroom van schoon water in welke gecontroleerde pulsen van smaakstof kunnen worden afgeleverd. Elke smaakpuls gaat over de proboscis en wordt dan weggewassen. Tastants bevatten een kleine hoeveelheid smakeloos voedselkleuren, waardoor een kleuren sensor met precieze timing, de passage van de smakende ovIs de proboscis.

<table><tbody><tr><td>Dissectie en preparatie van specimens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen buis, 15 mL Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Naald, Korte schuine snede, 19 G x 1 - 1/2"&nbsp;</td><td>&nbsp;MONOJET</td><td>888200144</td><td>Voor het aanbrengen van lucht om het haar van de mot te verwijderen.</td></tr><tr><td>Modelleerklei-Van Aken Plastalina&nbsp;</td><td>DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal -100 x 15 mm&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>Pipettip (1 - 200 &micro;L)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsmes</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG standaard aansluitdraad</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>Voor het inbrengen van de proboscis in de pipettip.</td></tr><tr><td>Batikwas</td><td>Jacquard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>Elektrische waxer</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Myscroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #1 tang (grof)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500335</td><td>Voor het verwijderen van vet en niet-zenuwweefsel.</td></tr><tr><td>Dumont #5 titanium tang (fijn)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14096</td><td>Voor het verwijderen van vet en niet-zenuwweefsel.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF tang (superfijn)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500085</td><td>Voor het verwijderen van de zenuwweefselschede.</td></tr><tr><td>Vannas schaar (fijn)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td>Voor het verwijderen van de cuticula.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Saline perfusiesysteem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verlengset met snelheidsregelaar</td><td>&nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>IV-toedieningsset met Y-injectieplaats</td><td>&nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Tastant-leveringssysteem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Witte doorschijnende nylon buis OD 1/4", ID 1/8"</td><td>Small Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>Rigide buis die de vier hoofdelementen van het systeem verbindt.</td></tr><tr><td>Loodgietersijzer</td><td>Circuit Specialists</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>Roterend gereedschap-Dremel</td><td>Dremel</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen gaas, gatmaat (gaatje van 0,1 x 0,13 cm)&nbsp;</td><td>Industrial Netting</td><td>XN5170</td><td>Om ervoor te zorgen dat de proboscis van verschillende dieren op dezelfde locatie worden geplaatst.</td></tr><tr><td>Onder druk staand 16-kanaals perfusiesysteem&nbsp;</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-16H</td><td>Voor tastant-levering. Dit systeem omvat pinc valves, slangen, manifold, oplossingscylinders, kleppencontroller en fittingtoebehoren.</td></tr><tr><td>Polypropyleen buis, ID 0,034", ID 0,050"</td><td>Becton, Dickinson &amp; Co</td><td>427421</td><td>Uitvoerbuis van het perfusiesysteem.</td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Voor het regelen van de uitvoerkanaal van het perfusiesysteem.&nbsp;</td></tr><tr><td>Data-acquisitiesoftwaresysteem, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ-kaart</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>Om de pico-pomp voor tastant-levering te bedienen en om de signalen van de kleursensor op te nemen.</td></tr><tr><td>Compulab 3 Manostat peristaltiekpomp</td><td>Sigma</td><td>P1366</td><td>Voor het verpompen van water.</td></tr><tr><td>Siliconen buis, ID 1/16" OD 1/8"</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>Om de waterbron te verbinden met de slang van de peristaltiekpomp, en de uitlaatbuis van de pomp met de stijve buis van het leveringssysteem.</td></tr><tr><td>Kleursensor-digitale vezel optische sensor</td><td>Keyence</td><td>&nbsp;FS-V31M</td><td>Voor het bewaken van tastant-levering.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleursensor-reflecterende vezeleenheid</td><td>Keyence</td><td>FU35-FZ</td><td>Om de kleursensor-apparaat aan te sluiten.</td></tr><tr><td>Tandheelkundig randwas</td><td>Henry-Schein Dental</td><td>6652151</td><td>Om de proboscis in de stijve buis vast te zetten.</td></tr><tr><td>Twee 3,7 L containers</td><td></td><td></td><td>Om water aan het systeem te leveren en om het afvalwater te verzamelen.</td></tr><tr><td>Fast green FCF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Dressingtang 25,5 cm</td><td>WPI</td><td>500364</td><td>Om de proboscis van de mot in de proboscisgat in de stijve buis te introduceren.</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Elektrofysiologisch apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.C. versterker</td><td>Brown-Lee</td><td>440</td><td></td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Schott</td><td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>Manuele micromanipulator</td><td>Leica</td><td>micromanipulator</td><td>Om de tetrodes nauwkeurig in de hersenen van het dier te plaatsen. De manipulator moet fijne en grove bewegingen in x, y en z-as toestaan.</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Vibratie-isolatietafel (MICRO-g labtafel)</td><td>TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscoop</td><td>Tektronix&nbsp;</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>16-kanaals voorversterker en versterker</td><td>16 Channel MA-800 Ver

nieuwe methoden voor het bestuderen van gustatorische codering

New Methods to Study Gustatory Coding 

Het smaakgevende gevoel laat dieren toe om chemicaliën in het milieu op te sporen, waardoor gedragsmatige kritieken voor overleving ontstaan. Wanneer GAST-receptoren Neuronen (GRN&#39;s) proefmoleculen detecteren, coderen ze informatie over de identiteit en de concentratie van de smaakstof als patronen van elektrische activiteit die vervolgens voortplanten om neurons in de hersenen te volgen. Deze patronen vormen interne representaties van de smaker, die het dier dan toelaat om acties te selecteren en herinneringen te vormen. Het gebruik van relatief eenvoudige diermodellen is een krachtig instrument om fundamentele principes in sensorische codering te bestuderen. Hier stellen wij drie nieuwe methoden voor om de gustatorische codering te bestuderen met behulp van de mot Manduca sexta . Ten eerste presenteren we een dissectieprocedure voor het blootstellen van de maxillaire zenuwen en de subesofageale zone (SEZ), waardoor de activiteit van GRN&#39;s van hun axonen kan worden geregistreerd. Ten tweede beschrijven we het gebruik van extracellulaire elektroden om de activiteit van meerdere GRN&#39;s op te nemen door te plaatsenDraaddraden rechtstreeks in de maxillaire zenuw. Ten derde presenteren we een nieuw systeem voor het leveren en bewaken, met hoge temporale precisie, pulsen van verschillende smaken. Deze methoden laten de karakterisering van neuronale responsen in vivo direct uit GRN&#39;s toe, tijdens en na het leveren van proefpersonen. We geven voorbeelden van spanningspores die zijn opgenomen uit meerdere GRN&#39;s, en presenteren een voorbeeld van hoe een spikesorteringstechniek op de gegevens kan worden toegepast om de responsen van individuele neuronen te identificeren. Tenslotte, om onze opname-aanpak te valideren, vergelijken we extracellulaire opnames verkregen van GRN&#39;s met tetrodes op intracellulaire opnames verkregen met scherpe glaselektroden.

De activiteit van GRN&#39;s kan worden geregistreerd met behulp van een extracellulaire tetrode-elektrode voor, tijdens en na de levering van de smaak ( Figuur 6A en 6C ). Figuur 6A (midden- en onderpanelen) toont gefilterde (300-6000 Hz) spanningssporen opgenomen door elk van de vier draden die in de maxillaire zenuw zijn geplaatst, waaraan signalen van verschillende amplituden die de actiepotentiaal (pijlen) weerspiegelen kunnen worden waargenomen. Een 1 s puls van tastant (1 M sucrose) werd 2s na het begin van het experiment afgeleverd; De aanvang en compensatie van de stimulus werd gecontroleerd door de kleurenensor ( Figuur 6A , bovenste paneel). De tastgeïnduceerde spikes die in elk van de vier kanalen waargenomen kunnen worden ( Figuur 6A , middenpaneel). GRN&#39;s kunnen worden geïdentificeerd en onderscheiden van mechanische sensoren (geen hier weergegeven) wanneer ze reageren op sommige tastanten en niet anderen Om enkele neuronresponsen uit de tetrode-opnamen te identificeren en te isoleren, hebben we off-line spikesortering uitgevoerd met behulp van een reeks aanpasbare functies op basis van Pouzat&#39;s 31 en Kleinfeld&#39;s 32 , 33 methoden (deze methoden zijn beschreven in deze citaten: 10 , 29 ). Figuur 6B toont een voorbeeld van spikesortering toegepast op de gegevens die zijn getoond in figuur 6A , waarin drie goed geïsoleerde eenheden werden gevonden. Raster plots van Figuur 6C tonen reacties van de drie geïsoleerde eenheden in Figuur 6B aan zes verschillende tastanten (1 M sucrose, maltose en NaCl, 100 mM cafeïne en 10 mM berberine en lobeline) afgeleverd in volgorde (4 trialS / tastant worden getoond). Zoals getoond in Figuur 6C , hebben de opgenomen GRN&#39;s verschillende niveaus van basislijnactiviteit, variërend van stil (GRNs 1) tot laag of matig (GRN 2 en 3). Na tastende aanvang tonen GRNs diverse activiteitspatronen en tonen verschillende selectiviteit aan de smaakstoffen. Bijvoorbeeld, GRN 1 reageerde alleen op sucrose, terwijl GRN 2 reageerde op maltose en NaCl met spitsbrekers en lobeline met alleen spiking bij het begin van de stimulus. Daarnaast worden sommige reacties afgesloten met de timing van de stimulus ( bijv. GRN 1-respons op sucrose), terwijl andere responsen de duur van de stimulus overschrijden ( bijv. GRN 3-respons op berberine) of beide excitatoire en remmende componenten bevatten ( bijv. Figuur 7 GRN 2 reacties op NaCl en sucrose). Voor meer informatie over de diverse gevoeligheden en activiteitenpatronen van GRN&#39;s zie referentie 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Voor het valideren van het gebruik van de tetrode- en spikesorteringstechnieken om GRN&#39;s van de maxillaire zenuw op te nemen, hebben we intracellulaire opnames van GRN-axons in andere dieren uitgevoerd door gebruik te maken van conventionele scherpe glaselektroden (weerstand van 80-120 MΩ). We vonden dat de activiteit patronen verkregen met behulp van intracellulaire opnames vergelijkbaar waren met reacties waargenomen door gebruik te maken van de tetrode techniek ( Figuur 7 ). De spanningsporen in de groene doos in Paneel A werden intracellulair geregistreerd van GRN 1 gedurende 5 opeenvolgende proeven van sucrose presentatie, en dezelfde reacties worden weergegeven als raster plots in paneel B. (Merk op dat dit soort reactie overeenkomt met dat verkregen met tetrodes en Getoond in figuur 6C .) GRN 2, opgenomen met scherpe intracellulaire elektroden, toont een bredere responspatroon. <img alt="Figuur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Figuur 6: Representatieve resultaten van maxillaire zenuwopnamen met extracellulaire tetroden. ( A ) Gefilterde (300-6000 Hz) spanningssporen opgenomen door elk van de vier draden bij de maxillaire zenuw worden getoond (middenpaneel). Een 1 s puls van de smaakstof werd toegepast gedurende de door de rode schaduw aangegeven periode in het middenpaneel. De aanvang en compensatie van de stimulus werd gecontroleerd door de kleurensensor zoals aangegeven door het rode spanningsspoor op het bovenpaneel en wordt aangeduid op het middenpaneel door het roodgekleurde gebied. De gestippelde horizontale lijnen wijzen op +50 (boven), 0 (midden) en -50 (onder) μV. Een vergroting van de rasspanningsporen die overeenkomt met het gebied in de verticale stippellijnen wordt getoond (onderpaneel). Voorbeelden van spikes worden aangegeven door de pijlen. ( B ) Een voorbeeld van spikesortering toegepast op de gegevens in paneel A. De golfvormen die zijn opgenomen bij elk van de vier extracellulaire draden (1-4) arE geïdentificeerd met drie verschillende GRNs (eenheden 1-3) die bijdragen aan de opgenomen signalen. Individuele gebeurtenissen (gekleurde dunne lijnen) en de gemiddelde (dikke zwarte lijn) worden getoond voor de drie eenheden. Een aantal statistische criteria moet worden beschouwd om onafhankelijke eenheden op betrouwbare wijze te identificeren met behulp van de spikesorteringsmethode (zie referenties 10 , 29 ). ( C ) Raster plots die reacties van de drie geïsoleerde eenheden vertegenwoordigen aan een reeks van zes verschillende tastanten (4 proeven / smaakstoffen worden getoond). De tijdsperiode van de levering van smaakstoffen (1 s) wordt aangegeven door het roodgekleurde gebied. De concentraties van tastanten waren ofwel 1 M (sucrose, maltose, NaCl), 100 mM (cafeïne) en 10 mM (berberine en lobeline). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Figuur 7 : Intracellulaire opnamen van GRN Axons. ( A , groen doospaneel) Spanningssporen opgenomen uit een GRN met scherpe glas intracellulaire elektroden (weerstand van 80 - 120 MΩ) geplaatst in de maxillaire zenuw, opgewekt door 5 opeenvolgende stimulaties met 1 M sucrose (Suc). ( B ) Rasterbeelden van de reacties van twee GRN&#39;s, inclusief reacties in paneel A (groen vakpaneel), naar twee verschillende tastanten in volgorde (100 mM grijze lettertype kleur; 1 M zwarte lettertype kleur) opgenomen met scherpe glas intracellulaire elektroden Geplaatst in de maxillaire zenuw (7 proeven / tastant en 3 proeven / water worden getoond). Tastant levertijd wordt aangegeven door roodglazen gebieden in beide panelen. De aanvang en compensatie van de stimulus werd gecontroleerd door de kleurenensor, zoals aangegeven door de rode spanningssporen aan de onderkant van elk paneel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Wij presenteren drie nieuwe methoden om gustatorische codering te bestuderen . Met behulp van een simpel dier beschrijven de mot Manduca sexta ( Manduca ) een dissectieprotocol, het gebruik van extracellulaire tetrodes om de activiteit van meerdere gustatorreceptorneuronen op te nemen en een systeem voor het leveren en bewaken van nauwkeurig ingestelde pulsen van tastanten.

Nieuwe methoden voor het bestuderen van Gustatorische codering

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Het algemene doel van deze methoden is om de gustatoire codering in een simpel dier, de mandi-casecsta, te bestuderen door de activiteit van meerdere receptorneuronen in vivo vast te leggen, terwijl nauwkeurig getimede pulsen van smaakstoffen worden toegediend en gemonitord. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over smaakwaarneming, zoals de manier waarop smaakstoffen worden gecodeerd door populaties van gustatoire receptorneuronen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in vivo opnames mogelijk maakt van meerdere gustatoire neuronen vóór, tijdens en na nauwkeurig toegediende stimuli van smaakstoffen.Personen die nog niet bekend zijn met deze methode kunnen dit uitdagend vinden vanwege de complexe dissectieprocedure. Daarom hopen we dat de visuele demonstratie van de methode behulpzaam zal zijn. Deze technieken zijn ontwikkeld door Sam Writer toen hij promovendus was in mijn laboratorium, samen met Alejandra; Kui Sun zal deze procedures demonstreren.Kies drie dagen na het uitkomen een mot van beide geslachten die een over het algemeen gezonde indruk maakt. De vleugels moeten volledig zijn uitgestrekt en de proboscis en antennes moeten goed gevormd en intact zijn. Plaats de geselecteerde mot in een zuurkast in een fixatiebuis totdat de kop is vrijgesteld.Immobiliseer vervolgens de mot door vloeipapier in het andere uiteinde van de buis te plaatsen. Verwijder daarna de haren van de blootgestelde kop met behulp van onder druk gezette lucht die via een spuit wordt toegediend. Plaats de buis vervolgens op een kleirondje in een Petrischaal.Plaats de kop met de dorsale zijde naar boven. Bescherm vervolgens de antennes en de proboscis. Maak hiervoor eerst kapjes voor elke structuur van 200 µL pipettepunten die in stukken van een halve centimeter zijn gesneden.Om de proboscis te manipuleren, dient u een haakje te maken van een stukje ijzerdraad. Steek de proboscis in een van de afdekkingen tot het meest proximale deel van de proboscis is beschermd. Bevestig de buis aan het dorsale deel van de kopkapsel met stevige batikwas.Scheet vervolgens voorzichtig de antennes en zet de buisjes vast met batikwas. Stabiliseer nu het brein door de buckle-compressorspier door te snijden. Gebruik onder de dissectiemicroscoop microdissectie-instrumenten om de kopcapsule te openen door een kleine incisie te maken net onder de proboscis.Om te bevestigen dat de spier is doorgesneden, wordt er een sucroseoplossing aangeboden aan de distale twee derden van de proboscis; controleer gedurende vijf minuten of de proboscis niet uitstrekt. Sluit vervolgens de hoofdkapsel af met een laag gesmolten batikwas. Om het brein met saline te perfunderen, wordt er een wasbeker rond de ventrale zijde van de kop geconstrueerd.Bouw met een elektrische waxer een wasbeker op langs de voorkant van de kop, bewegend richting de achterkant. Houd de buisjes van de proboscis en de antennes binnen de beker. Ga door met het uitbreiden van de beker naar buiten en naar boven tot deze het niveau van de ogen bereikt.Pak de labiale palpen met een pincet en bevestig deze aan de wasbeker met behulp van gesmolten was. Seal vervolgens eventuele openingen in de wasbeker en buisjes met een dunne laag binaire epoxy. Meng de epoxy met een tandenstoker.Bedek eerst de buiten- en binnenzijden van de cup. Vul vervolgens het deel van de fixatiebuis rond de nek op, zodat het hoofd steviger wordt vastgehouden. Controleer de cup na 20 minuten op lekken.Om te beginnen met de hersenchirurgie, snij eerst de labiale palpen af. Om de ventrale zijde van de kopkapsel te openen, snijdt u de cuticula langs de achter- en voorkant van de kop en rondom de ogen. Snijd vervolgens langs de achterkant van de kop en maak extra sneden langs de voorkant van de kop nabij de proboscis.Til vervolgens met een pincet voorzichtig de flap van de cuticula op om de hersenen bloot te leggen. Voer nu de meest kritische stap uit: het blootleggen van de SEZ en de maxillaire zenuwen. Verwijder langzaam en voorzichtig het vetweefsel en de trachea.Spoel de hersenen regelmatig af met verse zoutoplossing. Wees zeer voorzichtig, omdat de nervi maxillares gemakkelijk kunnen worden geplet. Wanneer de SEZ en de nervi maxillares uiteindelijk zichtbaar zijn, zullen ze bedekt zijn door een dun schede.Om deze schede te verwijderen, laat u eventueel overtollig zoutoplossing weglopen en verzwakt u vervolgens de schede door een 10% collagenase dispase-oplossing aan te brengen. Na vijf minuten weken spoelt u de oplossing meerdere keren uit met zoutoplossing. Verwijder daarna, na verschillende spoelingen met zoutoplossing, de schede voorzichtig met superfijne microdissectiepincetten.Ten slotte bevestigt u een zoutoplossingsinfuus in de perfusiebeker. In dit gedeelte wordt beschreven hoe u een toedieningssysteem voor taststoffen bouwt en gebruikt. Het systeem bestaat uit een testbuis met meerdere openingen.De openingen bieden toegang voor de proboscis van het dier, de diverse smaakstoffen, een kleurensensor, en ze maken de doorstroming van water mogelijk. Om dit systeem te bouwen, bereid eerst een testbuis voor de proboscis voor. Maak met een soldeerbout een gat ter grootte van de proboscis.Bouw vervolgens een afge schermd gedeelte in de buis om de proboscis op zijn plaats te houden. Snijd vijf millimeter boven het gat, plaats daar het gaas met was en verbind de buizen opnieuw met was en epoxy. Gebruik een onder druk staand perfusiesysteem om de smaakstoffen toe te dienen.Koppel zoveel smaakstofbuisjes als nodig aan een manifold. Om de uitgaande smaakstofbuis aan te sluiten, maakt u een gat van ongeveer één centimeter boven het gaas en bevestigt u vervolgens de uitgaande buis hiermee met epoxy. Voeg aan elke smaakstof een kunstmatige kleurstof toe die door een colorsensor gedetecteerd kan worden.Bevestig een kleurensensor aan de apparatuur in een gat op een halve centimeter afstand van het gaas en zet deze daar vast met epoxy. Gebruik een peristaltische pomp om gedestilleerd water via siliconen slangjes in het systeem te brengen. Verzamel het afvalwater in een grote container.Gebruik een pneumatische pomp om de smaakstoffen met luchtstoten toe te dienen. Begin nu met het pompen van schoon water door de slang en dien pulsen van de smaakstof toe om de kleurensensor te testen. Plaats nu het distale tweederde deel van de proboscis van de mot in de testbuis.Trek de proboscis met een pincet uit en duw deze voorzichtig in het gat. Zet de proboscis vervolgens vast met zachte tandheelkundige was en een laag epoxy. Sluit nu de zoutoplossing-perfusielijn aan en stel de perfusiedebiet in.Dompel vervolgens de ground-elektrode van de getwiste draad-tetrode onder in het zoutbad. Positioneer de tetrode vervolgens met behulp van een micromanipulator naast de nervus maxillaris en voer deze langzaam in de zenuw in. Nadat er spiking-signalen zijn gedetecteerd, laat u de preparatie ten minste 10 minuten stabiliseren voordat u met de opnames begint.Opnames werden gemaakt van gustatoire receptorneuronen vóór, tijdens en na de toediening van smaakstoffen met behulp van het beschreven protocol. Het begin en einde van een puls van één seconde van elke smaakstof werd gemonitord door de kleurensensor. De smaakstoffen riepen spikes op die door elk van de vier kanalen werden gedetecteerd.Binnen de spike-treinen konden individuele actiepotentialen worden waargenomen. Spike-sorting software werd gebruikt om deze spikes toe te wijzen aan unieke neuronen. De respons van drie verschillende gustatoire receptorneuronen op zes opeenvolgend toegediende tastanten onthult verschillende niveaus van baseline-activiteit en selectiviteit voor de tastanten.Daarnaast vertoonden de responsen een verschillende timing. Sommige zijn gekoppeld aan de duur van de stimulus, terwijl andere langer aanhouden dan de stimulus. Intracellulaire registraties konden ook worden uitgevoerd bij axonen van gustatoire receptoren met behulp van conventionele scherpe glaselektroden.De intracellulaire registraties waren zeer vergelijkbaar met de responsen die werden waargenomen met de beschreven tetrode-techniek, maar de tetrode-registraties waren eenvoudiger uit te voeren, hielden langer aan en waren robuuster. Na het bekijken van deze video moet u in staat zijn om de maxillaire zenuwen en de sub-oesofageale zone bij mandi-casecsta bloot te leggen, en een systeem voor de toediening van tastant te bouwen met nauwkeurige temporele controle. Draag tijdens het uitvoeren van dit protocol laboratoriumveiligheidshandschoenen en een mondmasker, omdat het fijne poederachtige schubmateriaal dat door mandi-casecsta wordt afgestoten allergeen kan zijn.Zodra deze procedure onder de knie is, kan deze in drie en een half uur worden voltooid. Na uitvoering van deze procedure kunnen er ook gelijktijdige opnames uit meerdere hersengebieden worden verricht om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop responsen van gustatoire receptorneuronen op smaakstoffen worden getransformeerd wanneer zij worden overgedragen aan de postsynaptische doelneuronen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen smaak transductie heeft onlangs genoten van belangrijke vooruitgang, vooral door het gebruik van dierlijke modellen. Echter, de grote verscheidenheid in smaak sensitiviteit en specificiteit bij zoogdieren garandeert studies in menselijk weefsel. Beschrijven we een biopsie techniek om levende cellen te verzamelen smaak van de papillen op de menselijke tong.

Techniek om Fungiform (smaak) papillen verzamelen van Human Tongue

Dit protocol beschrijft extracellulaire van de actiepotentiaal reacties afgevuurd door labellar smaak neuronen in Drosophila.

Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Proef sensilla

De voorpoten en slurf van Drosophila bevatten een rijk repertoire van gustatoire sensorische neuronen. Hier presenteren we een methode met behulp van calciumbeeldvorming om fysiologische reacties van sensorische neuronen in de voorpoot en slurf van levende vliegen te meten na exogeen aanbrengen van een gustatoir feromoon.

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

Smaak is een belangrijk sensorisch proces dat de aantrekking tot heilzame stoffen en het vermijden van giftige stoffen vergemakkelijkt. Dit protocol beschrijft een eenvoudige innametest voor het bepalen van de Drosophila smaakpreferentie voor een bepaalde chemische verbinding.

Taste Voorkeur Assay voor Volwassenenonderwijs<em&gt; Drosophila</em

Dit protocol meet menselijke smaak reacties en omvat een korte anatomische beoordeling, een korte smaaktest en een validatiemethode wordt gebruikt die met behulp van de certificaathouder gerapporteerde sensatie en smaak receptor genotype.

Smaak examen: Een korte en gevalideerde Test

Dit artikel beschrijft methoden voor weefselvoorbereiding, kleuring en analyse van hele fungiforme, circumvallaat- en gehemelte-smaakpapillen die consequent hele en intacte smaakpapillen opleveren (inclusief de zenuwvezels die ze innerveren) en de relaties tussen structuren in smaakpapillen en de omliggende papilla onderhouden.

Whole-Mount kleuring, visualisatie en analyse van fungiforme, circumvallaat en gehemelte smaakpapillen

Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

Het artikel introduceert het μTongue (microfluidics-on-a-tongue) apparaat voor functionele smaakcelbeeldvorming in vivo door microfluïdica te integreren in een intravitaal beeldvormingsvenster op de tong.

μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo

Een zelden gebruikte methode van elektrofysiologische registratie, basisregistratie, maakt analyse mogelijk van kenmerken van smaakcodering die niet kunnen worden onderzocht met conventionele registratiemethoden. Basisregistratie maakt ook de analyse mogelijk van smaakreacties op hydrofobe stimuli die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van traditionele elektrofysiologische methoden.

Basisopname: een techniek voor het analyseren van reacties van smaakneuronen in Drosophila

Een calciumbeeldvormingsbenadering maakt het mogelijk om smaakgeïnduceerde reacties in de hersenen van wakkere vliegen vast te leggen terwijl een oplossing op het labellum wordt aangebracht. Primaire smaakresponsen in Drosophila melanogaster worden als voorbeeld gebruikt, maar dit protocol kan worden aangepast om stroomafwaartse neuronen of andere soorten te bestuderen.

In vivo Calciumbeeldvorming van smaakgeïnduceerde neurale reacties bij volwassen Drosophila

Ontdek nieuwe methoden voor gustatorische codering in de mot Manduca sexta met extracellular tetrode-opnames en een smaakstofafgiftesysteem. Deze technieken helpen onderzoekers smaakinformatie in vivo te bestuderen.

Nieuwe methoden voor het bestuderen van Gustatorische codering

Meer video's verkennen