Nieuwe methoden voor het bestuderen van Gustatorische codering
29 juni 2017
Wij presenteren drie nieuwe methoden om gustatorische codering te bestuderen . Met behulp van een simpel dier beschrijven de mot Manduca sexta ( Manduca ) een dissectieprotocol, het gebruik van extracellulaire tetrodes om de activiteit van meerdere gustatorreceptorneuronen op te nemen en een systeem voor het leveren en bewaken van nauwkeurig ingestelde pulsen van tastanten.
Het algemene doel van deze methoden is om de gustatoire codering in een simpel dier, de mandi-casecsta, te bestuderen door de activiteit van meerdere receptorneuronen in vivo vast te leggen, terwijl nauwkeurig getimede pulsen van smaakstoffen worden toegediend en gemonitord. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over smaakwaarneming, zoals de manier waarop smaakstoffen worden gecodeerd door populaties van gustatoire receptorneuronen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in vivo opnames mogelijk maakt van meerdere gustatoire neuronen vóór, tijdens en na nauwkeurig toegediende stimuli van smaakstoffen.
Personen die nog niet bekend zijn met deze methode kunnen dit uitdagend vinden vanwege de complexe dissectieprocedure. Daarom hopen we dat de visuele demonstratie van de methode behulpzaam zal zijn. Deze technieken zijn ontwikkeld door Sam Writer toen hij promovendus was in mijn laboratorium, samen met Alejandra; Kui Sun zal deze procedures demonstreren.
Kies drie dagen na het uitkomen een mot van beide geslachten die een over het algemeen gezonde indruk maakt. De vleugels moeten volledig zijn uitgestrekt en de proboscis en antennes moeten goed gevormd en intact zijn. Plaats de geselecteerde mot in een zuurkast in een fixatiebuis totdat de kop is vrijgesteld.
Immobiliseer vervolgens de mot door vloeipapier in het andere uiteinde van de buis te plaatsen. Verwijder daarna de haren van de blootgestelde kop met behulp van onder druk gezette lucht die via een spuit wordt toegediend. Plaats de buis vervolgens op een kleirondje in een Petrischaal.
Plaats de kop met de dorsale zijde naar boven. Bescherm vervolgens de antennes en de proboscis. Maak hiervoor eerst kapjes voor elke structuur van 200 µL pipettepunten die in stukken van een halve centimeter zijn gesneden.
Om de proboscis te manipuleren, dient u een haakje te maken van een stukje ijzerdraad. Steek de proboscis in een van de afdekkingen tot het meest proximale deel van de proboscis is beschermd. Bevestig de buis aan het dorsale deel van de kopkapsel met stevige batikwas.
Scheet vervolgens voorzichtig de antennes en zet de buisjes vast met batikwas. Stabiliseer nu het brein door de buckle-compressorspier door te snijden. Gebruik onder de dissectiemicroscoop microdissectie-instrumenten om de kopcapsule te openen door een kleine incisie te maken net onder de proboscis.
Om te bevestigen dat de spier is doorgesneden, wordt er een sucroseoplossing aangeboden aan de distale twee derden van de proboscis; controleer gedurende vijf minuten of de proboscis niet uitstrekt. Sluit vervolgens de hoofdkapsel af met een laag gesmolten batikwas. Om het brein met saline te perfunderen, wordt er een wasbeker rond de ventrale zijde van de kop geconstrueerd.
Bouw met een elektrische waxer een wasbeker op langs de voorkant van de kop, bewegend richting de achterkant. Houd de buisjes van de proboscis en de antennes binnen de beker. Ga door met het uitbreiden van de beker naar buiten en naar boven tot deze het niveau van de ogen bereikt.
Pak de labiale palpen met een pincet en bevestig deze aan de wasbeker met behulp van gesmolten was. Seal vervolgens eventuele openingen in de wasbeker en buisjes met een dunne laag binaire epoxy. Meng de epoxy met een tandenstoker.
Bedek eerst de buiten- en binnenzijden van de cup. Vul vervolgens het deel van de fixatiebuis rond de nek op, zodat het hoofd steviger wordt vastgehouden. Controleer de cup na 20 minuten op lekken.
Om te beginnen met de hersenchirurgie, snij eerst de labiale palpen af. Om de ventrale zijde van de kopkapsel te openen, snijdt u de cuticula langs de achter- en voorkant van de kop en rondom de ogen. Snijd vervolgens langs de achterkant van de kop en maak extra sneden langs de voorkant van de kop nabij de proboscis.
Til vervolgens met een pincet voorzichtig de flap van de cuticula op om de hersenen bloot te leggen. Voer nu de meest kritische stap uit: het blootleggen van de SEZ en de maxillaire zenuwen. Verwijder langzaam en voorzichtig het vetweefsel en de trachea.
Spoel de hersenen regelmatig af met verse zoutoplossing. Wees zeer voorzichtig, omdat de nervi maxillares gemakkelijk kunnen worden geplet. Wanneer de SEZ en de nervi maxillares uiteindelijk zichtbaar zijn, zullen ze bedekt zijn door een dun schede.
Om deze schede te verwijderen, laat u eventueel overtollig zoutoplossing weglopen en verzwakt u vervolgens de schede door een 10% collagenase dispase-oplossing aan te brengen. Na vijf minuten weken spoelt u de oplossing meerdere keren uit met zoutoplossing. Verwijder daarna, na verschillende spoelingen met zoutoplossing, de schede voorzichtig met superfijne microdissectiepincetten.
Ten slotte bevestigt u een zoutoplossingsinfuus in de perfusiebeker. In dit gedeelte wordt beschreven hoe u een toedieningssysteem voor taststoffen bouwt en gebruikt. Het systeem bestaat uit een testbuis met meerdere openingen.
De openingen bieden toegang voor de proboscis van het dier, de diverse smaakstoffen, een kleurensensor, en ze maken de doorstroming van water mogelijk. Om dit systeem te bouwen, bereid eerst een testbuis voor de proboscis voor. Maak met een soldeerbout een gat ter grootte van de proboscis.
Bouw vervolgens een afge schermd gedeelte in de buis om de proboscis op zijn plaats te houden. Snijd vijf millimeter boven het gat, plaats daar het gaas met was en verbind de buizen opnieuw met was en epoxy. Gebruik een onder druk staand perfusiesysteem om de smaakstoffen toe te dienen.
Koppel zoveel smaakstofbuisjes als nodig aan een manifold. Om de uitgaande smaakstofbuis aan te sluiten, maakt u een gat van ongeveer één centimeter boven het gaas en bevestigt u vervolgens de uitgaande buis hiermee met epoxy. Voeg aan elke smaakstof een kunstmatige kleurstof toe die door een colorsensor gedetecteerd kan worden.
Bevestig een kleurensensor aan de apparatuur in een gat op een halve centimeter afstand van het gaas en zet deze daar vast met epoxy. Gebruik een peristaltische pomp om gedestilleerd water via siliconen slangjes in het systeem te brengen. Verzamel het afvalwater in een grote container.
Gebruik een pneumatische pomp om de smaakstoffen met luchtstoten toe te dienen. Begin nu met het pompen van schoon water door de slang en dien pulsen van de smaakstof toe om de kleurensensor te testen. Plaats nu het distale tweederde deel van de proboscis van de mot in de testbuis.
Trek de proboscis met een pincet uit en duw deze voorzichtig in het gat. Zet de proboscis vervolgens vast met zachte tandheelkundige was en een laag epoxy. Sluit nu de zoutoplossing-perfusielijn aan en stel de perfusiedebiet in.
Dompel vervolgens de ground-elektrode van de getwiste draad-tetrode onder in het zoutbad. Positioneer de tetrode vervolgens met behulp van een micromanipulator naast de nervus maxillaris en voer deze langzaam in de zenuw in. Nadat er spiking-signalen zijn gedetecteerd, laat u de preparatie ten minste 10 minuten stabiliseren voordat u met de opnames begint.
Opnames werden gemaakt van gustatoire receptorneuronen vóór, tijdens en na de toediening van smaakstoffen met behulp van het beschreven protocol. Het begin en einde van een puls van één seconde van elke smaakstof werd gemonitord door de kleurensensor. De smaakstoffen riepen spikes op die door elk van de vier kanalen werden gedetecteerd.
Binnen de spike-treinen konden individuele actiepotentialen worden waargenomen. Spike-sorting software werd gebruikt om deze spikes toe te wijzen aan unieke neuronen. De respons van drie verschillende gustatoire receptorneuronen op zes opeenvolgend toegediende tastanten onthult verschillende niveaus van baseline-activiteit en selectiviteit voor de tastanten.
Daarnaast vertoonden de responsen een verschillende timing. Sommige zijn gekoppeld aan de duur van de stimulus, terwijl andere langer aanhouden dan de stimulus. Intracellulaire registraties konden ook worden uitgevoerd bij axonen van gustatoire receptoren met behulp van conventionele scherpe glaselektroden.
De intracellulaire registraties waren zeer vergelijkbaar met de responsen die werden waargenomen met de beschreven tetrode-techniek, maar de tetrode-registraties waren eenvoudiger uit te voeren, hielden langer aan en waren robuuster. Na het bekijken van deze video moet u in staat zijn om de maxillaire zenuwen en de sub-oesofageale zone bij mandi-casecsta bloot te leggen, en een systeem voor de toediening van tastant te bouwen met nauwkeurige temporele controle. Draag tijdens het uitvoeren van dit protocol laboratoriumveiligheidshandschoenen en een mondmasker, omdat het fijne poederachtige schubmateriaal dat door mandi-casecsta wordt afgestoten allergeen kan zijn.
Zodra deze procedure onder de knie is, kan deze in drie en een half uur worden voltooid. Na uitvoering van deze procedure kunnen er ook gelijktijdige opnames uit meerdere hersengebieden worden verricht om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop responsen van gustatoire receptorneuronen op smaakstoffen worden getransformeerd wanneer zij worden overgedragen aan de postsynaptische doelneuronen.
Overzicht
Dit artikel presenteert drie nieuwe methoden voor het bestuderen van gustatoire codering bij de mot Manduca sexta. De technieken omvatten een dissectieprotocol, extracellulaire tetrode-registraties van gustatoire receptorneuronen en een systeem voor het toedienen en monitoren van smaakstimuli.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de gustatoire codering is cruciaal voor inzichten in de sensorische verwerking.
- De mot Manduca sexta dient als een eenvoudig modelorganisme voor deze studies.
- Het registreren van meerdere gustatoire receptorneuronen kan verduidelijken hoe smaakinformatie wordt gecodeerd.
- Een nauwkeurige toediening van smaakstoffen is essentieel voor precieze experimentele resultaten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van methoden voor in vivo registraties van gustatoire neuronen.
- Het onderzoeken van hoe smaakstoffen worden gecodeerd door populaties van gustatoire receptorneuronen.
- Het bieden van een visuele demonstratie van de dissectie- en registratietechnieken.
Gebruikte methoden
- Dissectieprotocol voor het prepareren van de mot voor neurale registraties.
- Gebruik van extracellulaire tetrodes om neuronale activiteit te registreren.
- Systeem voor het toedienen en monitoren van getimede pulsen van smaakstoffen.
- Visuele hulpmiddelen om nieuwe onderzoekers te ondersteunen bij het complexe dissectieproces.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle in vivo registraties van meerdere gustatoire receptorneuronen.
- Aantoonde de effectiviteit van het systeem voor de toediening van smaakstoffen.
- Bood inzichten in de codering van gustatoire informatie.
- Benadrukte de uitdagingen en oplossingen in het dissectieproces.
Conclusies
- De ontwikkelde methoden zijn waardevol voor het bestuderen van gustatoire codering.
- In vivo registraties kunnen het begrip van de smaakverwerking verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze technieken om de gustatie verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het begrijpen van gustatoire coderingsmechanismen biedt fundamentele inzichten voor doelvalidatie bij de ontdekking van neurologische geneesmiddelen, met name voor verbindingen die het voedingsgedrag of metabole paden moduleren. Het vermogen om neuronale responsen op populatieniveau in vivo te registreren, ondersteunt mechanische risicoreductie door moleculaire interventies te koppelen aan functionele neurale outputs. Deze methoden maken voorspellend vertrouwen mogelijk in de vroege ontdekkingsfase door te kwantificeren hoe smaakstoffen worden gecodeerd in populaties van gustatoire receptorneuronen voordat de downstream signaalverwerking plaatsvindt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de identiteit en concentratie van smaakstoffen te koppelen aan specifieke patronen van elektrische activiteit over populaties van gustatoire receptorneuronen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van directe in vivo meting van neuronale responsen vóór, tijdens en na de toediening van stimuli, wat de target engagement in sensorische paden verduidelijkt.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de karakterisering van signaalpaden door te onthullen hoe individuele neuronen bijdragen aan codering op populatieniveau, wat helpt bij de selectie van targets voor het moduleren van voedingsgerelateerd gedrag.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op assay-standaardisatie door consistente extracellulaire registratie van meerdere gustatoire receptorneuronen mogelijk te maken met behulp van tetrode-arrays.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay door nauwkeurige temporele controle van de toediening van smaakstoffen en real-time monitoring via kleurensensor-feedback, waardoor de variabiliteit in de stimuluspresentatie wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt screening-gereedheid mogelijk door kwantificeerbare spike-train-outputs te genereren die gesorteerd kunnen worden om individuele neuronresponsen te identificeren, wat betrouwbare evaluatie van verbindingen in smaakmodulatiestudies ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt translationele continuïteit door in vivo activiteit van gustatoire receptorneuronen te koppelen aan stroomafwaartse hersenverwerking, waardoor kan worden beoordeeld hoe sensorische signalen worden getransformeerd bij postsynaptische targets.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door baseline-neuronale responsprofielen te verschaffen die kunnen worden gebruikt om door verbindingen veroorzaakte veranderingen in de coderingsgetrouwheid te detecteren.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op voorspellende risicoreductie door onderscheid te maken tussen stimulus-gekoppelde en aanhoudende neuronale responsen, wat helpt om directe sensorische effecten te differentiëren van secundaire netwerkadaptaties.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de vroege ontdekkingsfase tot lead-identificatie en preklinische validatie, in het bijzonder voor targets die betrokken zijn bij chemosensorische signalering en de regulatie van voedingsgedrag.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door onderzoekers in staat te stellen te bepalen hoe specifieke smaakstoffen worden gecodeerd door gedefinieerde populaties van gustatoire receptorneuronen, waardoor moleculaire receptieve bereiken worden verduidelijkt.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay door middel van stabiele tetrode-registraties die zorgen voor consistente spike-detectie over de kanalen, wat vergelijking van neuronale responsen onder verschillende condities mogelijk maakt.
- Analytics: Benadrukt spike sorting als een belangrijke analytische output die actiepotentialen toewijst aan unieke neuronen, waardoor de individuele bijdragen aan populatiecodering kunnen worden ontrafeld.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door aan te tonen hoe responsen van gustatoire receptorneuronen worden doorgegeven aan volgneuronen in de hersenen, wat bijdraagt aan de validatie van postsynaptische targets.
- Enterprise Reuse: Positioneert het op tetrodes gebaseerde registratiesysteem als een herbruikbaar platform voor longitudinale studies, aangezien registraties langer aanhouden en robuuster zijn dan methoden met intracellulaire scherpe elektroden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit te verminderen in de wijze waarop de identiteit en concentratie van smaakstoffen worden gerepresenteerd in neurale activiteitspatronen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door een perfuseerbare preparatie die herhaalde opnames en simultane monitoring van meerdere gebieden ondersteunt.
- Strategische waarde: Optimaliseert go/no-go-beslissingen door objectieve, kwantificeerbare neurale readouts te bieden die de toediening van smaakstoffen correleren met elektrofysiologische resultaten, waardoor de afhankelijkheid van uitsluitend gedragsmatige proxies wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering door verbindingen te identificeren die de getrouwheid van de gustatoire codering beïnvloeden, wat vroege detectie van off-target sensorische effecten mogelijk maakt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in insectdissectie, microchirurgie en elektrofysiologie om de maxillaire zenuwen en de suboesofageale zone succesvol bloot te leggen zonder delicate structuren te beschadigen.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder micromanipulatoren, tetrodes, perfusiesystemen en kleurensensoren voor de toediening en monitoring van smaakstoffen.
- Vereist standaardisatie van dissectie- en wasafdichtingsprotocollen tussen teams om een consistente preparatiekwaliteit over verschillende gebruikers en laboratoria te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het uitbreiden van de methode naar andere modelsystemen, aangezien de toegankelijkheid van de maxillaire zenuw en de technieken voor het verwijderen van de schede soortspecifiek zijn.
- Omvat praktische beperkingen, zoals het complexe dissectieproces en allergenen van de mot, waarvoor veiligheidsmaatregelen vereist zijn en die de doorvoer kunnen beperken.
