Nieuwe methoden voor het bestuderen van Gustatorische codering
June 29th, 2017
Wij presenteren drie nieuwe methoden om gustatorische codering te bestuderen . Met behulp van een simpel dier beschrijven de mot Manduca sexta ( Manduca ) een dissectieprotocol, het gebruik van extracellulaire tetrodes om de activiteit van meerdere gustatorreceptorneuronen op te nemen en een systeem voor het leveren en bewaken van nauwkeurig ingestelde pulsen van tastanten.
Het algemene doel van deze methoden is om gustatorische codering in een eenvoudig dier mandi-casecsta te bestuderen door de activiteit van meerdere receptorneuronen in vivo op te nemen, terwijl precies getimede pulsen van smaken worden afgeleverd en gemonitord. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over gustatie, zoals hoe smaken worden gecodeerd door populaties van gustatoire receptorneuronen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het in vivo opnames mogelijk maakt voor meerdere gustatoire neuronen vóór, tijdens en na precies geleverde smaakstofstimuli.
Mensen die nieuw zijn in deze methode kunnen het een uitdaging vinden omdat de dissectieprocedure ingewikkeld is. Hierdoor hopen we dat de visuele demonstratie van de methode nuttig zal zijn. Deze technieken zijn ontwikkeld door Sam Writer toen hij een afgestudeerde student was in mijn lab, samen met Alejandra, Kui Sun zal deze procedures demonstreren.
Drie dagen na het uitkomen, kies een mot van elk geslacht die er over het algemeen gezond uitziet. De vleugels moeten volledig uitgestrekt zijn en de proboscis en antennes moeten goed gevormd en intact zijn. Plaats de geselecteerde mot in een afzuigkap, in een begrenzende buis totdat de kop blootligt.
Immobiliseer vervolgens de mot door tissuepapier in het andere uiteinde van de buis te steken. Gebruik vervolgens geperste lucht vanuit een spuit om het haar van de blootliggende kop te verwijderen. Plaats vervolgens de buis op een kleiplato in een petrischaal.
Richt de kop met de dorsale kant omhoog. Bescherm vervolgens de antennes en de proboscis. Maak eerst covers voor elke structuur van 200 microliter pipettentips gesneden in halve centimeter lengtes.
Om de proboscis te manipuleren, bereid een haak voor van een stuk draad. Steek de proboscis in een van de covers tot het meest proximale deel van de proboscis beschermd is. Bevestig de buis aan het dorsale deel van de kopcapsule met stevige batikwas.
Bescherm vervolgens zorgvuldig de antennes en bevestig de buizen met batikwas. Stabiliseer nu de hersenen door de gespcompressor spier door te snijden. Gebruik onder de dissectiemicroscoop microdissectiegereedschappen om de kopcapsule te openen door een kleine snede te maken net onder de proboscis.
Om te bevestigen dat de spier is doorgesneden, bied suikeroplossing aan de distale tweederde van de proboscis en zorg ervoor dat de proboscis gedurende vijf minuten niet uitsteekt. Sluit vervolgens de kopcapsule met een laag gesmolten batikwas. Om de hersenen met zoutoplossing te perfunderen, bouw een wascup rond de ventrale kant van de kop.
Gebruik een elektrische waxer om een waxcup te bouwen langs de voorkant van de kop naar de achterkant. Houd de proboscis en antennebuizen binnen de cup. Bouw de cup verder naar buiten en omhoog tot het het niveau van de ogen bereikt.
Gebruik een pincet om de labial palps te nemen en bevestig ze aan de wascup met behulp van gesmolten was. Verzegeld vervolgens alle openingen in de wascup en buizen met een dunne laag binaire epoxy. Meng de epoxy met behulp van een tandenstoker.
Bedek eerst de buitenste en binnenste oppervlakken van de cup. Vul vervolgens het deel van de beperkende buis rond de nek zodat de kop steviger wordt vastgehouden. Controleer na 20 minuten de cup op lekken.
Om de hersenoperatie te beginnen, snijd eerst de labial palps af. Om de ventrale kant van de kopcapsule te openen, snijd de cuticula langs de achterkant en voorkant van de kop en rond de ogen. Snijd vervolgens langs de achterkant van de kop en maak meer sneden langs de voorkant van de kop in de buurt van de proboscis.
Til vervolgens voorzichtig het flapje cuticula met behulp van pincet om de hersenen bloot te leggen. Voer nu de meest cruciale stap uit, het blootleggen van de SEZ en de maxillaire zenuwen. Verwijder langzaam en voorzichtig vetweefsel en de trachea.
Spuit het brein regelmatig met verse zoutoplossing. Wees heel voorzichtig, omdat het heel gemakkelijk is om de maxillaire zenuwen te verpletteren. Wanneer de SEZ en de maxillaire zenuwen eindelijk zichtbaar zijn, zullen ze bedekt zijn door een dunne schede.
Om deze schede te verwijderen, tappen eventueel overtollig zoutoplossing en vervolgens verzwakken de schede door een 10% collagenase dispase oplossing aan te brengen. Na vijf minuten weken, spoel de oplossing meerdere keren met zoutoplossing. Vervolgens verwijder de schede voorzichtig met behulp van superfijne microdissectiepincet nadat er meerdere keren met zoutoplossing is gespoeld.
Bevestig ten slotte een zoutoplossingsdruppelbuisje in de perfusiecup. Deze sectie beschrijft hoe je een smaakstofafleveringssysteem kunt bouwen en gebruiken. Het systeem bestaat uit een testbuis met meerdere openingen.
De openingen bieden toegang voor de proboscis van het dier, de smaakstof manifold, een kleursensor en ze laten het doorstromen van water toe. Om dit systeem te bouwen, bereid eerst een testbuis voor de proboscis voor. Maak een proboscisgroot gat met behulp van een soldeerbout.
Bouw vervolgens een gescreende sectie binnen de buis om de proboscis op zijn plaats te houden. Snijd vijf millimeter boven het gat, plaats het gaas daar met was en herverbind de buizen met behulp van was en epoxy. Gebruik een onder druk staand perfusiesysteem om de smaken af te leveren.
Verbind zoveel smaakstofbuizen als nodig is naar een manifold. Om de smaakstof uitlaatbuis aan te sluiten, maak een gat ongeveer een centimeter boven het gaas en bevestig de uitlaatbuis daarop met epoxy. Voeg in elke smaakstof een kunstmatige kleurstof toe die kan worden gedetecteerd door een kleursensor.
Bevestig een kleursensor aan de inrichting bij een gat een halve centimeter boven het gaas en bevestig deze daar met epoxy. Gebruik een peristaltiekpomp om gedestilleerd water in het systeem te brengen via siliconen slangen. Verzamel het afvalwater met een grote container.
Gebruik een pneu
Overzicht
Dit artikel presenteert drie nieuwe methoden voor het bestuderen van gustatorische codering bij de nachtvlinder Manduca sexta. De technieken omvatten een dissectieprotocol, extracellulaire tetrode-opnames van gustatorische receptorneuronen en een systeem voor het leveren en monitoren van smaakstoffen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Begrip van gustatorische codering is cruciaal voor inzichten in sensorische verwerking.
- De nachtvlinder Manduca sexta dient als een eenvoudig modelorganisme voor deze studies.
- Opname van meerdere gustatorische receptorneuronen kan duidelijk maken hoe smaakinformatie wordt gecodeerd.
- Precieze levering van smaakstoffen is essentieel voor nauwkeurige experimentele resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om methoden te ontwikkelen voor in vivo-opnames van gustatorische neuronen.
- Om te onderzoeken hoe smaakstoffen worden gecodeerd door populaties van gustatorische receptorneuronen.
- Om een visuele demonstratie te geven van de dissectie- en opnametechnieken.
Gebruikte methoden
- Dissectieprotocol voor het voorbereiden van de nachtvlinder voor neurale opnames.
- Gebruik van extracellulaire tetrodes om neuronale activiteit op te nemen.
- Systeem voor het leveren en monitoren van getimede pulsen van smaakstoffen.
- Visuele hulpmiddelen om nieuwe onderzoekers te assisteren in het ingewikkelde dissectieproces.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle in vivo-opnames van meerdere gustatorische receptorneuronen.
- Aangetoond de effectiviteit van het systeem voor levering van smaakstoffen.
- Gegeven inzichten in de codering van gustatorische informatie.
- Belicht de uitdagingen en oplossingen in het dissectieproces.
Conclusies
- De ontwikkelde methoden zijn waardevol voor het bestuderen van gustatorische codering.
- In vivo-opnames kunnen het begrip van smaakverwerking verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze technieken om het onderzoek naar smaak verder te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding gustatory coding mechanisms provides foundational insights for target validation in neuroscience drug discovery, particularly for compounds modulating feeding behavior or metabolic pathways. The ability to record population-level neuronal responses in vivo supports mechanistic de-risking by linking molecular interventions to functional neural outputs. These methods enable predictive confidence in early discovery by quantifying how tastants are encoded across gustatory receptor neuron populations before downstream signal processing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking tastant identity and concentration to specific patterns of electrical activity across gustatory receptor neuron populations.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct in vivo measurement of neuronal responses before, during, and after stimulus delivery, clarifying target engagement in sensory pathways.
- Scientific Value: Facilitates pathway characterization by revealing how individual neurons contribute to population-level coding, aiding in target selection for modulating feeding-related behaviors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by enabling consistent extracellular recording of multiple gustatory receptor neurons using tetrode arrays.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility through precise temporal control of tastant delivery and real-time monitoring via color sensor feedback, reducing variability in stimulus presentation.
- Scientific Value: Enables screening readiness by generating quantifiable spike train outputs that can be sorted to identify individual neuron responses, supporting reliable compound evaluation in taste-modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking in vivo gustatory receptor neuron activity to downstream brain processing, allowing assessment of how sensory signals are transformed at postsynaptic targets.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing baseline neuronal response profiles that can be used to detect compound-induced alterations in coding fidelity.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking by distinguishing between stimulus-locked and sustained neuronal responses, helping to differentiate direct sensory effects from secondary network adaptations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, particularly for targets involved in chemosensory signaling and feeding behavior regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling researchers to determine how specific tastants are encoded by defined populations of gustatory receptor neurons, clarifying molecular receptive ranges.
- Screening: Describes assay readiness through stable tetrode recordings that yield consistent spike detection across channels, allowing comparison of neuronal responses under different conditions.
- Analytics: Highlights spike sorting as a key analytical output that assigns action potentials to unique neurons, enabling resolution of individual contributions to population coding.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how gustatory receptor neuron responses propagate to follower neurons in the brain, informing postsynaptic target validation.
- Enterprise Reuse: Positions the tetrode-based recording system as a reusable platform for longitudinal studies, as recordings are longer lasting and more robust than intracellular sharp electrode methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how tastant identity and concentration are represented in neural activity patterns.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through a perfusable preparation that supports repeated recordings and simultaneous multi-area monitoring.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing objective, quantifiable neural readouts that correlate tastant delivery with electrophysiological outcomes, reducing reliance on behavioral proxies alone.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that alter gustatory coding fidelity, enabling early detection of off-target sensory effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, microsurgery, and electrophysiology to successfully expose maxillary nerves and subesophageal zone without damaging delicate structures.
- Dependent on specialized instrumentation including micromanipulators, tetrodes, perfusion systems, and color sensors for tastant delivery and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and wax-sealing protocols to ensure consistent preparation quality across users and laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the approach to other model systems, as the maxillary nerve accessibility and sheath removal techniques are species-specific.
- Includes practical limitations such as the intricate dissection process and allergenic scaling from the moth, which require safety precautions and may limit throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Preparing M. sexta for Brain Surgery
10:03
Conclusion
8:45
Results: Tetrode Recordings of Stimulated Gustatory Receptor Neurons
4:22
Revealing the Subesophageal Zone (SEZ) and Maxillary Nerves
6:00
Tastant Delivery System and Extracellular Tetrode Recording
