Name: PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Ontdek de PIP-on-a-chip methode voor labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties met behulp van een microfluidisch platform. Deze techniek biedt een biologisch relevant alternatief voor traditionele methoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DS en CEC werden gedeeltelijk ondersteund door subsidie ​​AI053531 (NIAID, NIH); SS en PSC werden ondersteund door subsidie ​​N00014-14-1-0792 (ONR).

De auteurs hebben niets te onthullen.

Elke PIP variant, zij het bij lage concentraties, is aanwezig op het cytosolische oppervlak van specifieke organellen, waar zij bijdragen aan de totstandbrenging van een unieke fysieke samenstelling en functionele specificiteit van het organellair membraan 1 . Een van de belangrijkste toepassingen van PIP&#39;s is als een specifiek docking platform voor de veelheid van eiwitten die specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie 6 , 7</s...

Myriade interacties en biochemische processen vinden plaats op tweedimensionale vloeistof membraanoppervlakken. Membraan-omsloten organellen in eukaryote cellen zijn uniek, niet alleen in biochemische processen en hun bijbehorende proteome maar ook in hun lipidsamenstelling. Een uitzonderlijke klasse fosfolipiden is fosfoinositiden (PIP&#39;s). Hoewel ze slechts 1% van het cellulair lipidoom omvatten, spelen ze een cruciale rol in signaaltransductie, autofagie en membraanhandel, onder andere 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamische fosforylering van de inositol-hoofdgroep door cellulaire PIP-kinasen leidt tot zeven PIP-hoofdgroepen die mono-, bis- of trisfosforyleerd zijn 5 . Bovendien definiëren PIP&#39;s de subcellulaire identiteit van membranen en dienen als gespecialiseerde membraan docking sites voor proteïnen / enzymen die één of meer fosfoïnen bevattenBindende domeinen, bijvoorbeeld Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) en epsin N-terminale Homology (ENTH) 6 , 7 . Een van de best bestudeerde PIP-bindende domeinen is fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domein dat specifiek interageert met fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) bij een hoge nanomolaire laag micromolaire gebied affiniteit 8 , 9 , 10 , 11 . Er zijn verschillende kwalitatieve en kwantitatieve in vitro methoden ontwikkeld en gebruikt om het mechanisme, de thermodynamica en de specificiteit van deze interacties te bestuderen. Onder de meest gebruikelijke PIP-bindende assays zijn oppervlakte plasmon resonantie (SPR), isothermale calorimetrie (ITC), NMR-spectroscopie, liposome flotatie / sedimentatie assay en lipide-blots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Alhoewel deze uitgebreid worden gebruikt, hebben ze allemaal veel nadelen. Bijvoorbeeld, SPR, ITC en NMR vereisen grote hoeveelheden monster, dure instrumentatie en / of getraind personeel 12 , 13 . Enkele assayformaten zoals antilichamen gebaseerde lipide-blots gebruiken wateroplosbare vormen van PIP&#39;s en presenteren ze op een nonfysiologische wijze 12 , 14 , 15 , 16 . Bovendien kunnen lipide-blots niet betrouwbaar worden gekwantificeerd en hebben ze vaak geleid tot valse positieve / negatieve waarnemingen 12 , 17 , 18 . Om deze uitdagingen te overwinnen en te verbeteren op de huidige gereedschapsset werd een nieuwe labelvrije methode op basis van een ondersteunde lipid bilayer (SLB) opgesteld in het kader van am<html> Microfluidisch platform, dat succesvol werd toegepast op de studie van eiwit-PIP-interacties ( Figuur 1 ) 19 . De strategie die wordt gebruikt voor het detecteren van eiwit-PIP-interacties is gebaseerd op pH-modulatie detectie. Dit omvat een pH-gevoelige kleurstof die ortho- sulforhodamine B ( o SRB) direct geconjugeerd is met fosfatidylethanolamine lipide hoofdgroep 20 . O SRB-POPE probe (Figuur 2A) is sterk fluorescerende bij lage pH en geblust bij hoge pH met een pKa ongeveer 6,7 bij 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SLBs (Figuur 5B). PLC-δ1 PH domein is uitgebreid gebruikt voor het valideren eiwit-PIP-bindende methoden vanwege de hoge specificiteit voor PI (4,5) P2 (figuur 5A) 21, 22,&quot;&gt; 23, 24, 25 .Hence, redeneerden we dat de PLC-δ1 PH-domein kan worden gebruikt om te testen de binding aan PI (4,5) P2 via het PIP-on-a-chip assay. Het PH-gebied construct in deze studie gebruikte een netto positieve lading (pi 8,4), en daardoor aantrekt OH -. ionen (figuur 5C) bij binding aan PI (4,5) P2 bevattende SLBs, het PH domein brengt de OH - ionen aan de Membraanoppervlak, dat op zijn beurt het grensvlakpotentiaal moduleert en de protonatietoestand van o SRB-POPE ( Figuur 5C ) 26 verplaatst. Als een functie van de PH-domeinconcentratie wordt de fluorescentie uitgeblust ( Figuur 6A ). Ten slotte zijn de genormaliseerde gegevens passen bij een bindingsisotherm om de affiniteit van het PH-domein-PI (4,5) P2 interactie (Figuur 6B, 6C). bepalen &lt;/ P&gt; In deze studie wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om eiwitbinding uit te voeren naar PIP-bevattende SLB&#39;s in een microfluïdisch platform. Dit protocol neemt de lezer van het samenstellen van het microfluïdische apparaat en de vesikelpreparatie op SLB-vorming en eiwitbinding. Bovendien aanwijzingen voor gegevensanalyse affiniteitinformatie voor PLC-δ1 PH domein-PI (4,5) P2 interactie verschaft extraheren.

<table><tbody><tr><td>Dekglasje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glas Dekglasjes: Rechthoeken</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicaatglas</td></tr><tr><td>7X Reinigingsoplossing</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Detergentia</td></tr><tr><td>PYREX Kristallisatiebakje</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>Borosilicaat glazen bakje met een platte bodem; Diameter x Hoogte (190 x 100 mm); Distributeur: VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Oven</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS); Distributeur: Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>PYREX Droogkast</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td>Vacuum geschikt</td></tr><tr><td>Biopsie punch</td><td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; 1,0 mm diameter; Miltex Biopsie Punch met Plunger (Cat. Nr. 15110-10) kan als alternatief worden gebruikt</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Reinigingssysteem</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>2-traps Direct Drive Olie Vacuümpomp, O2 service (Krytox Charged)</td></tr><tr><td>Digitaal Hotplate</td><td>Benchmark</td><td>H3760-H</td><td>Gekocht via Denville Scientific (Cat. Nr. 1005640)</td></tr><tr><td>Mat Micro Slide</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Mat, Geselecteerd en Voorgereinigd; Gemaakt van Zwitsers Glas; Dikte: 1 mm; Afmetingen: 75 x 25 mm; GR 144</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Vorm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Ontwerpsoftware voor het ontwerp van fotomaskers</td></tr><tr><td>Fotomasker</td><td>CAD/Art Services</td><td>N/A</td><td>Ontwerp met zwarte achtergrond en heldere kenmerken werd gedrukt op een transparante masker (5 x 7 inch) door CAD/Art Services met een resolutie van 20k dpi</td></tr><tr><td>Silicone Wafers</td><td>University Wafer</td><td>1575</td><td>Prime Grade, Enkelzijdig Gepolijst; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Dikte</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Negatieve Toon Fotoresist; Eigendom van Penn State Nanofabrication Facility</td></tr><tr><td>SU-8 Ontwikkelaar</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Eigendom van Penn State Nanofabrication Facility</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alpha;-fosfatidylinositol-4-fosfaat</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alpha;-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td>POPE; Vereist voor de synthese van oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine B Sulfonylchloride (gemengde isomeren)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>Vereist voor de synthese van oSRB-POPE</td></tr><tr><td>pH Gevoelige Fluorescerende Lipiden Sonde (oSRB-POPE)</td><td>In-house</td><td>N/A</td><td>In-house Synthese (Huang D. et al. 2013)</td></tr><tr><td>Glas Scintillatieglas</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>20 mL volumecapaciteit</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Ultrasoon Waterbad</td></tr><tr><td>Nuclepore Track-Etched Membranes</td><td>Whatman</td><td>110605</td><td>Polycarbonaat Membraan; Diameter: 25 mm; Porie Grootte: 0.1 um; Distributeur: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td>HPLC kwaliteit</td></tr><tr><td>LIPEX Extruder</td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Dynamische Lichtverstrooiing; Eigendom van Penn State X-Ray Crystallography Facility</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Gegevensanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v.6</td><td>Curve-fitting software voor gegevensanalyse</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Epifluorescent Microscoop</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>AxioCam MRm Camera</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Camera</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>Lichtbron</td></tr><tr><td>Alexa 568 Filter Set</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Beeldverwerkingssoftware</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Anders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>VWR</td><td>10034-132</td><td>200 uL pipette tips; Dunne en gladde tip voor he

pip-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Talrijke cellulaire eiwitten interageren met membraanoppervlakken om essentiële cellulaire processen te beïnvloeden. Deze interacties kunnen gericht zijn op een specifieke lipidcomponent binnen een membraan, zoals bij fosfoinositiden (PIP&#39;s), om specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie te waarborgen. PIP&#39;s en cellulaire PIP-bindende domeinen zijn uitgebreid bestudeerd om hun rol in cellulaire fysiologie beter te begrijpen. We hebben een pH-modulatie-analyse toegepast op ondersteunde lipid bilayers (SLB&#39;s) als middel om eiwit-PIP-interacties te bestuderen. In deze studies wordt pH-gevoelige ortho- sulforhodamine B geconjugeerde fosfatidylethanolamine gebruikt om eiwit-PIP-interacties te detecteren. Bij binding van een eiwit aan een PIP-bevattend membraanoppervlak wordt het grensvlakpotentiaal gemoduleerd ( dwz verandering in lokale pH), waarbij de protonatietoestand van de probe wordt verplaatst. Een casestudy van het succesvolle gebruik van de pH-modulatie-analyse wordt gepresenteerd door gebruik te maken van fosfolipase C delta1 Pleckstrin Homologie (PLC-δ1 PH) domein en fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) interactie voorbeeld. De schijnbare dissociatieconstante ( Kd , app ) voor deze interactie was 0,39 ± 0,05 μM, vergelijkbaar met Kd , appwaarden verkregen door anderen. Zoals eerder opgemerkt, de PLC-δ1 PH domein PI (4,5) P2 bepaald, toont zwakkere binding aan fosfatidylinositol-4-fosfaat en geen binding aan zuiver fosfatidylcholine SLBs. De PIP-op-een-chip-analyse is voordelig boven de traditionele PIP-bindingsassays, waaronder maar niet beperkt tot een laag monstervolume en geen eisen voor ligand / receptor-etikettering, het vermogen om membraaninteracties met hoge en lage affiniteit te testen met zowel kleine als Grote moleculen, en verbeterde signaal-ruisverhouding. Bijgevolg zal het gebruik van de PIP-on-a-chip-aanpak het verhelderen van mechanismen van een breed scala van membraaninteracties vergemakkelijken. Bovendien kan deze methode u mogelijk zijnSed in identificerende therapieën die het vermogen van eiwit om met membranen te interageren moduleren.

We gebruikten de pH modulatie test om de PLC-δ1 PH domein PI-studie (4,5) P2 interactie in een PIP-on-a-chip micro-inrichting (figuur 1). Door middel van een gedetailleerd protocol hebben we aangetoond hoe u microfluidische apparaatcomponenten kunt voorbereiden en monteren, kleine unilamellaire vesicles (SUV&#39;s) maken ( Figuur 2 ), SLB&#39;s vormen binnen een apparaat ( Figuur 3 ) en g...

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Het algemene doel van de PIP-on-a-chip test is om eiwitmembraaninteracties op een kwantitatieve, labelvrije manier te beoordelen. Eiwitmembraaninteracties zijn de kern van zoveel processen van de cel en zijn pathogenen, maar technieken om deze interacties te bestuderen zijn er weinig. De voordelen van deze techniek zijn een laag eenvoudig volume, geen ligand of receptor labeling vereisten, gecombineerd met de mogelijkheid om membraaninteracties op een fysiologisch relevante manier te testen.Veel therapeutische doelen van virussen zijn membraaneiwitten, studies van deze doelwitten worden vaak uitgevoerd in oplossing met behulp van detergenten. Onze techniek biedt een meer biologisch relevante alternatief. Hoewel je zult zien dat deze test in staat is om de interacties van eiwitten met membranen te bewaken, is het eigenlijk een vrij veelzijdige test en kan worden gebruikt om ijzermembraan, kleine molecuulmembraan en zelfs peptidemembraaninteracties te bewaken.Om te beginnen, meng polydimethylsiloxaan of PDMS prepolymer en het hardende middel in een verhouding van 10:1, in een grote plastic weegschaal. Degasseer het mengsel in een vacuüm gedurende een uur met een vacuümsterkte van 500 tor of minder. Plaats de siliconen master die meerdere replica's van hetzelfde SU8 micropatroon bevat in een grote plastic weegschaal en giet het degas PDMS erin, genees het dan in een droge oven bij 60 graden Celsius een nacht.De volgende dag, trek voorzichtig het PDMS van de siliconen master met je handen af. Markeer de grenzen van elk micropatroon in rechthoeken met een chirurgisch scalpel en een liniaal. Snijd vervolgens het PDMS in blokken, prik op beide uiteinden van elk microkanaal 16 gaten met een biopsiepomp, om gaten met een diameter van 1,0 millimeter te maken.Pipetteer berekende volumes fosfatidycholine, Fosfolipidinzuur 4, 5-bisfosfaat en pH-gevoelige fluorescente sonde in een enkele 20 milliliter glazen ventilatieviaal. Droog het mengsel in een stroom stikstofgas binnenin de chemische afzuigkap gedurende 10 minuten of totdat het oplosmiddel verdampt en de dunne lipidelaag zich aan de bodem van de fles vormt. Droog vervolgens het mengsel onder vacuüm gedurende minimaal drie uur bij een vacuümsterkte van 10 millitor om eventueel resterend organisch oplosmiddel te verwijderen.Herhydrateer de gedroogde lipidelaag met vijf milliliters vloeibuffer, plaats de geherhydrateerde lipide in een ultrasone bad bij een bedrijfsfrequentie van 35 kilohertz gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vries en ontdooi de blaasjessuspensie met vloeibaar stikstof en het 40 graden Celsius waterbad om unilaminaire blaasjes te verkrijgen. Herhaal het vries en ontdooi 10 keer, extrudeer de blaasjessuspensie tot een 0,1 micron track edge polycarbonaatmembraan, met behulp van een lipide extrudeerder om kleine unilaminaire blaasjes te verrijken.Herhaal de extrusie 10 keer. Test de inlaten en uitlaten van het PDMS-blok op blokkering door gedeïoniseerd water door de gaten te spuiten met behulp van een waterwasfles, droog vervolgens het PDMS-blok met stikstofgas. Plaats vervolgens het PDMS-blok en de vooraf gereinigde dekglas in de monsterkamer van het zuurstofplasmasysteem.Stel het PDMS-blok en het dekglas bloot aan zuurstofplasma gedurende 45 seconden met de vermogensinstellingen op 75 watt, zuurstofstroomsnelheid op 10 kubieke centimeters per minuut en de vacuümsterkte van 200 millitor. Plaats vervolgens het patroonoppervlak van het PDMS-blok onmiddellijk na de zuurstofplasmabehandeling in contact met het dekglas. Druk voorzichtig om eventuele luchtbellen op de contactplaatsen te verwijderen.Plaats het apparaat op een vlak heet plaatje bij 100 graden Celsius gedurende drie minuten om de binding te verbeteren. Gebruik een natte pluisvrije doek met 100% ethanol om eventuele stofdeeltjes van de boven- en onderkant van het apparaat te verwijderen. Plak vervolgens het apparaat bovenop een glazen microscoopglas.Breng 100 microliter van de Fosfolipidinzuur 4, 5-bisfosfaat bevattende kleine unilaminaire blaasjes over in een 0,65 milliliter microcentrifugebuis. Pas de pH van de oplossing aan tot ongeveer 3/2 door 6,4 microliters van 0,2 normaal zoutzuur toe te voegen. Pipetteer 10 microliters van de pH aangepaste kleine unilaminaire blaasjesoplossing in elk van de kanalen door de inlaat en breng druk uit door de pipet totdat de oplossing de uitlaat bereikt.Verwijder de punt van de pipet en laat deze aan het apparaat verbonden. Herhaal deze stap voor elk kanaal, incubeer het apparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, injectie van blaasjes in microkanalen moet onmiddellijk na de apparaatontwerp worden uitgevoerd. Snijd ondertussen sets inlaat- en uitlaatbuisjes, verbind met behulp van een pincet de uitlaatbuisjesset met het apparaat en plak vervolgens het apparaat op een microscoopstandaard.Dompel het ene uiteinde van de inlaatbuisjesset onder in 25 milliliter vloeibuffer in een kegelvormige buis en plak het vast om ervoor te zorgen dat de buisjes vastzitten. Gebruik een labjack om de kegelvormige buis op een hoger niveau te plaatsen dan het apparaat om de oplossing door de microkanalen via zwaartekrachtstroom te duwen. Gebruik voor elk inlaatbuisje een spuit om één milliliter vloeibuffer van het vrije uiteinde van de buis te trekken.Verwijder de pipetpunt van de inlaat en steek het vrije uiteinde van de inlaatbuis in het apparaat. Herhaal dit proces om alle inlaatbuisjes aan het apparaat te koppelen. Het door de kanalen stromen van vloeibuffer helpt om overtollige ongeroeide blaasjes te verwijderen en de dubbellaag te gelijk te brengen met experimentele omstandigheden.Open vervolgens de microscoopbesturingssoftware. Klik in het linkerdeelvenster op het microscooptabblad en kies de 10x objectief. Klik op live en vervolgens op de Alexa 568-be

pip-on-chip-label-free-study-protein-phosphoinositide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate protein-phosphoinositide interactions in a microfluidic pattern using the pH modulation assay, using pH-sensitive fluorescent dye tagged to phosphatidylethanolamine lipid of a supported lipid bilayer, called a microfluidic platform. The modulations in pH after protein binding to phospholipid cause fluorescence quenching.

pH Modulation Assay on Supported Lipid Bilayers to Detect Protein-Phosphoinositide Interactions

Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Een nieuwe aanpak die de hoge-resolutie analyse van kanker cel interacties mogelijk met exogeen hyaluronzuur (HA) is beschreven. Oppervlakken met een patroon zijn vervaardigd door het combineren van carbodiimide chemie en microcontact afdrukken.

Micropatterned Oppervlakken aan hyaluronzuur Interacties met kanker cellen te bestuderen

Raman spectroscopie is een geschikte techniek voor de non-contact, label-free analyse van levende cellen, weefsel-engineering constructen en cellen. Bronspecifieke spectrale vingerafdrukken worden gegenereerd en geanalyseerd met multivariate analyse.

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Ontdek de PIP-on-a-chip methode voor labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties met behulp van een microfluidisch platform. Deze techniek biedt een biologisch relevant alternatief voor traditionele methoden.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Meer video's verkennen