PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Het algemene doel van de PIP-on-a-chip test is om eiwitmembraaninteracties op een kwantitatieve, labelvrije manier te beoordelen. Eiwitmembraaninteracties zijn de kern van zoveel processen van de cel en zijn pathogenen, maar technieken om deze interacties te bestuderen zijn er weinig. De voordelen van deze techniek zijn een laag eenvoudig volume, geen ligand of receptor labeling vereisten, gecombineerd met de mogelijkheid om membraaninteracties op een fysiologisch relevante manier te testen.

Veel therapeutische doelen van virussen zijn membraaneiwitten, studies van deze doelwitten worden vaak uitgevoerd in oplossing met behulp van detergenten. Onze techniek biedt een meer biologisch relevante alternatief. Hoewel je zult zien dat deze test in staat is om de interacties van eiwitten met membranen te bewaken, is het eigenlijk een vrij veelzijdige test en kan worden gebruikt om ijzermembraan, kleine molecuulmembraan en zelfs peptidemembraaninteracties te bewaken.

Om te beginnen, meng polydimethylsiloxaan of PDMS prepolymer en het hardende middel in een verhouding van 10:1, in een grote plastic weegschaal. Degasseer het mengsel in een vacuüm gedurende een uur met een vacuümsterkte van 500 tor of minder. Plaats de siliconen master die meerdere replica's van hetzelfde SU8 micropatroon bevat in een grote plastic weegschaal en giet het degas PDMS erin, genees het dan in een droge oven bij 60 graden Celsius een nacht.

De volgende dag, trek voorzichtig het PDMS van de siliconen master met je handen af. Markeer de grenzen van elk micropatroon in rechthoeken met een chirurgisch scalpel en een liniaal. Snijd vervolgens het PDMS in blokken, prik op beide uiteinden van elk microkanaal 16 gaten met een biopsiepomp, om gaten met een diameter van 1,0 millimeter te maken.

Pipetteer berekende volumes fosfatidycholine, Fosfolipidinzuur 4, 5-bisfosfaat en pH-gevoelige fluorescente sonde in een enkele 20 milliliter glazen ventilatieviaal. Droog het mengsel in een stroom stikstofgas binnenin de chemische afzuigkap gedurende 10 minuten of totdat het oplosmiddel verdampt en de dunne lipidelaag zich aan de bodem van de fles vormt. Droog vervolgens het mengsel onder vacuüm gedurende minimaal drie uur bij een vacuümsterkte van 10 millitor om eventueel resterend organisch oplosmiddel te verwijderen.

Herhydrateer de gedroogde lipidelaag met vijf milliliters vloeibuffer, plaats de geherhydrateerde lipide in een ultrasone bad bij een bedrijfsfrequentie van 35 kilohertz gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vries en ontdooi de blaasjessuspensie met vloeibaar stikstof en het 40 graden Celsius waterbad om unilaminaire blaasjes te verkrijgen. Herhaal het vries en ontdooi 10 keer, extrudeer de blaasjessuspensie tot een 0,1 micron track edge polycarbonaatmembraan, met behulp van een lipide extrudeerder om kleine unilaminaire blaasjes te verrijken.

Herhaal de extrusie 10 keer. Test de inlaten en uitlaten van het PDMS-blok op blokkering door gedeïoniseerd water door de gaten te spuiten met behulp van een waterwasfles, droog vervolgens het PDMS-blok met stikstofgas. Plaats vervolgens het PDMS-blok en de vooraf gereinigde dekglas in de monsterkamer van het zuurstofplasmasysteem.

Stel het PDMS-blok en het dekglas bloot aan zuurstofplasma gedurende 45 seconden met de vermogensinstellingen op 75 watt, zuurstofstroomsnelheid op 10 kubieke centimeters per minuut en de vacuümsterkte van 200 millitor. Plaats vervolgens het patroonoppervlak van het PDMS-blok onmiddellijk na de zuurstofplasmabehandeling in contact met het dekglas. Druk voorzichtig om eventuele luchtbellen op de contactplaatsen te verwijderen.

Plaats het apparaat op een vlak heet plaatje bij 100 graden Celsius gedurende drie minuten om de binding te verbeteren. Gebruik een natte pluisvrije doek met 100% ethanol om eventuele stofdeeltjes van de boven- en onderkant van het apparaat te verwijderen. Plak vervolgens het apparaat bovenop een glazen microscoopglas.

Breng 100 microliter van de Fosfolipidinzuur 4, 5-bisfosfaat bevattende kleine unilaminaire blaasjes over in een 0,65 milliliter microcentrifugebuis. Pas de pH van de oplossing aan tot ongeveer 3/2 door 6,4 microliters van 0,2 normaal zoutzuur toe te voegen. Pipetteer 10 microliters van de pH aangepaste kleine unilaminaire blaasjesoplossing in elk van de kanalen door de inlaat en breng druk uit door de pipet totdat de oplossing de uitlaat bereikt.

Verwijder de punt van de pipet en laat deze aan het apparaat verbonden. Herhaal deze stap voor elk kanaal, incubeer het apparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, injectie van blaasjes in microkanalen moet onmiddellijk na de apparaatontwerp worden uitgevoerd. Snijd ondertussen sets inlaat- en uitlaatbuisjes, verbind met behulp van een pincet de uitlaatbuisjesset met het apparaat en plak vervolgens het apparaat op een microscoopstandaard.

Dompel het ene uiteinde van de inlaatbuisjesset onder in 25 milliliter vloeibuffer in een kegelvormige buis en plak het vast om ervoor te zorgen dat de buisjes vastzitten. Gebruik een labjack om de kegelvormige buis op een hoger niveau te plaatsen dan het apparaat om de oplossing door de microkanalen via zwaartekrachtstroom te duwen. Gebruik voor elk inlaatbuisje een spuit om één milliliter vloeibuffer van het vrije uiteinde van de buis te trekken.

Verwijder de pipetpunt van de inlaat en steek het vrije uiteinde van de inlaatbuis in het apparaat. Herhaal dit proces om alle inlaatbuisjes aan het apparaat te koppelen. Het door de kanalen stromen van vloeibuffer helpt om overtollige ongeroeide blaasjes te verwijderen en de dubbellaag te gelijk te brengen met experimentele omstandigheden.

Open vervolgens de microscoopbesturingssoftware. Klik in het linkerdeelvenster op het microscooptabblad en kies de 10x objectief. Klik op live en vervolgens op de Alexa 568-be