Analyse van de Gap Junction-afhankelijke Transfer van miRNA met 3D-FRAP Microscopy

Het algemene doel van deze procedure is om de gap junction-afhankelijke overdracht van micro RNA in levende cardiomyocyten te onderzoeken. Deze methode kan helpen om de rol van micro RNA voor het intercellulaire signaaltransactiesysteem aan te pakken. Het grote voordeel van deze techniek is dat de gap junction uitwisseling van micro RNA gevisualiseerd en gekwantificeerd kan worden in levende cellen met hoge ruimtelijk-tijdelijke resolutie.

Na het isoleren van cardiomyocyten volgens het tekstprotocol, plateer de cellen op zes welplaten met een dichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter. Incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag, voeg 0,5 trypzine toe aan de cellen en incubeer de culturen gedurende vijf minuten om de cellen los te maken.

Inactiveer de trypzine door celcultuurmedium toe te voegen. Na het tellen van de cellen, centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 300 keer g. Gebruik vervolgens elektroporeringsbuffer om de cellen opnieuw te suspenderen bij vier keer 10 tot de vijfde cellen per 100 microliters.

Meng vervolgens 100 microliters van de celsuspensie met fluorescerend micro RNA in een buisje en laad het mengsel in een elektroporeringscuvet. Voer vervolgens elektroporering uit met behulp van het G009-programma op de elektroporeerder. Voeg 500 microliters voorverwarmd celcultuurmedium toe en breng het gehele volume celsuspensie over in een wel van een vier wel glazen bodem kamerschijven.

Kweek de cellen gedurende één dag bij 37 graden Celsius, in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Nadat de microscoopincubator voorverwarmd is en het confucale systeem is ingeschakeld, plaats de kamerschijven in de monsterhouder op de stage. Gebruik een 1,4 na oliën objectief en 561 nanometer laserexcitatilicht, bij lage laservermogen, met een detectiebereik van 570 tot 680 nanometer om de cluster van transvecteerde cardiomyocyten te vinden.

Activeer vervolgens in de setup manager de z-stack, time series, bleeching en regions knoppen. Om vervolgens de frap-parameters te definiëren, stel in het acquisitiemodusmenu de framegrootte in op 512 bij 512, de lijnstap op één en de scantijd op minder dan één seconde. Pas in het kanalenmenu de laservermogen, offset en gain instellingen aan om maximale fluorescentie te verkrijgen met minimale laserexcitati, om intensiteitsverzadiging te voorkomen.

Stel vervolgens de pinhole grootte in op twee micrometer. Selecteer vervolgens in het regiomenu het roy tekentool en gebruik de cursor om de doelcel, de referentiecel en het achtergrondgebied te markeren. Selecteer indien nodig meerdere doelcellen voor fotobleeching.

In het bleechingmenu, pas de fotobleeching instellingen aan. Definieer vervolgens in het z-stackmenu de grenzen voor z-stack acquisitie, afhankelijk van de dikte van de cellen. Pas het aantal z-lagen aan op 12 tot 15, start vervolgens het frap experiment en neem de fluorescentie herstel op.

Om de gegevens te analyseren, maak een maximale projectie van de verkregen z-stacks met behulp van microscoopspecifieke software, klik op verwerking, maximale intensiteitsprojectie, selecteer bestand, toepassen. Kopieer ten slotte de fluorescentie intensiteit gegevens op alle tijdstippen van de doel-, achtergrond- en referentiecel, in een spreadsheet en voer gegevensanalyse uit volgens het tekstprotocol. Hier getoond, zijn geïsoleerde cardiomyocyten met het typische gestreepte alfa-actinine patroon en grote plaques van connexine43, langs de cel-cel grenzen.

Sommige niet-cardiomyocyten waren aanwezig in de cultuur. Zoals hier te zien is door middel van flowcytometrie, werd een transvectie-efficiëntie van 45% bereikt. Bovendien, onthulde een live-dode test dat de meerderheid van de cellen een hoge levensvatbaarheid vertoonde, wat belangrijk is bij het analyseren van gap junction communicatie.

Voor frap-analyse worden doelcellen geselecteerd binnen een celcluster en worden fotobleeched met 100% laservermogen, wat leidt tot verminderde micro RNA fluorescentie in de geselecteerde cellen. Kwantitatieve analyse en normalisatie van de verkregen gegevens, toonde een gemiddeld herstel van 20% In dit experiment leidde siRNA-gemedieerde knockdown van connexine43 tot verminderde eiwitexpressie en de remming van gap junction communicatie. Fluorescentie herstel werd met meer dan 50% verminderd, wat aangeeft dat de efficiëntie van miro RNA overdracht sterk afhankelijk is van de gap junction koppeling tussen cellen.

Deze figuur toont een 3D oppervlakte rendering van een frap experiment. In vergelijking met maximale projecties, kan de acquisitie van z-stacks worden gebruikt om 3D reconstructies te maken om de lokalisatie en mobiliteit van micro RNA binnen cellen te onderzoeken. Eenmaal onder de knie, kunnen frap metingen worden uitgevoerd in twee tot drie uur als het op de juiste manier wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om doelcellen te selecteren die hetzelfde aantal buurcellen hebben. Bovendien moeten mijn bleeching parameters en beeldverwervingsomstandigheden worden geselecteerd om fototoxische effecten te voorkomen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u frap-microscopie kunt gebruiken om de beweging van micro RNA binnen cellulaire clusters te kwantificeren en te visualiseren.