Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity
11 november 2017
Het segment patch-clamp techniek is een effectieve methode voor het analyseren van leren-geïnduceerde veranderingen in de intrinsieke eigenschappen en de plasticiteit van excitatory of inhiberende synapsen.
Hallo, mijn naam is Dai Mitsushima. Hier laten we zien hoe u hersenplakjes maakt van getrainde dieren door patch clamp-gegevens in ongetrainde dieren te vergelijken. Zo kunnen we leer-geïnduceerde synaptische plasticiteit analyseren.
Hallo, mijn naam is Hiroyuki Kida. In dit experiment hebben we het neuromechanisme van motorisch lopen onderzocht met behulp van de rotor rod-test. De rotor rod-test wordt veelvuldig gebruikt om de motorische cognitie van knaagdieren te evalueren.
Het voordeel van deze methode is dat we het niveau van ontdekking tijdens de test kunnen variëren door de rotatiesnelheid te verhogen. Rotarod-test. Voorafgaand aan de motorische taak moet het rotarod-apparaat worden ingesteld op de versnellingsmodus van 4 tot 40 rpms over 300 seconden.
Ratten voerden tien pogingen uit voor elke test. Het tijdsinterval tussen de pogingen bedroeg 30 seconden. Tijdens de eerste trainingssessie vallen ratten gewoonlijk van de staaf, zelfs bij lage snelheden, en lopen ze soms in de verkeerde richting.
Na herhaalde training kan de rat echter met een hogere snelheid lopen. Door de latentie op de stang te meten, kunnen we de leerprestatie van de rat met betrekking tot deze vaardigheid schatten. Hier kunnen we de resultaten van de rotor rod-test zien.
Zoals in deze figuur wordt getoond, zijn twee dagen training voldoende om de motorische vaardigheid aan te leren. Vergeleken met de latentietijd bij de eerste poging, toonde post hoc-analyse een significante verbetering bij de laatste poging op de trainingsdagen. Door de latentietijd op de stang te meten, kunnen we de leerprestatie van de rat met betrekking tot deze vaardigheid schatten.
Vervolgens laten we u een inhibitie-vermijdingstest zien. Deze test is nuttig bij het analyseren van de contextuele leerprestaties. Het apparaat voor de inhibitie-vermijdingstest bestaat uit een lichte en een donkere zijde, gescheiden door een valluik.
Tijdens de trainingssessie worden de ratten in het verlichte gebied geplaatst en krijgen ze een korte tijd om aan de omgeving te wennen. Zodra de deur opengaat, kunnen de ratten naar eigen belieft het donkere gebied betreden. Wanneer ze het donkere gebied betreden, wordt de deur gesloten en krijgen de ratten gedurende twee seconden een milde elektrische schok.
Nadat de ratten na voltooiing van de proef 30 minuten terug in hun kooien zijn geplaatst, worden ze opnieuw in het verlichte gebied van het apparaat geplaatst. Dertig minuten na de schok vertoonden de getrainde ratten consequent een langere latentietijd voordat ze het donkere gebied betraden. Hier kunnen we de resultaten van de inhibitie-vermijdingstest zien.
Na de elektrische schok leerden de ratten het donkere gebied te vermijden en aan de verlichte zijde te blijven, die ze normaal gesproken niet zouden prefereren. Deze neiging om de donkere zijde te vermijden wijst op de acquisitie van contextuele herinneringen. Hersenplakjes na training.
Vóór de incisie koelen we alle scharen, hemostaten en bekerglazen af met geplette ijs. Hier ziet u onze voorbereiding voor de dissectie. De dissectie van de hersenen moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
Nadat de rat diep is genarceerd, wordt deze in een ondiepe schaal met crushed ice geplaatst en wordt er een incisie gemaakt om de buikholte te openen. Na de incisie van het diafragma wordt er een verdere laterale incisie gemaakt. Om de borstholte te openen, moet het costale kraakbeen met een hemostat worden dichtgekneld.
Na het blootleggen van het hart wordt een roestvrijstalen naald van 18 gauge in het posterieure deel van de linker ventrikel ingebracht. De punt van de naald moet zichtbaar zijn door de wand van de aorta. Na het doorknippen van het rechter aurikel wordt de perfusie gestart.
Zorg ervoor dat zowel de naald als de spuit eerst zijn gevuld met met gas verzadigde, ijskoude dissectiebuffer. Eventuele luchtbellen moeten vóór de perfusie worden verwijderd. Maak eerst een incisie aan de achterzijde van de schedel.
Maak vervolgens een laterale incisie, gevolgd door een centrale incisie om de hersenen bloot te leggen. Na dissectie moeten de hersenen gedurende vijf minuten in bubbelend ijskoud buffer worden geplaatst. Voordat er verder wordt gegaan met de dissectie, moet het filterpapier worden bevochtigd met ijskoud buffer.
Vervolgens wordt het brein op een ijskoude roestvrijstalen plaat geplaatst. De hoek van de snijplaat is cruciaal om een correcte snijhoek voor de breinplak te garanderen. Een onjuiste hoek zou potentieel de doelwit-piramidale neuronen kunnen doorsnijden.
Na het trimmen moet één druppel secondelijm op de tafel van de vibratoom worden geplaatst. Om een goede hechting te garanderen, dient overtollige dissectiebuffer te worden verwijderd met een stukje filterpapier. Met behulp van de vibratoom kunnen dunne hersencoupures worden gemaakt, terwijl deze worden in stand gehouden in een bruisende, ijskoude buffer.
Ons doelgebied is de primaire motorische cortex. Het doelgebied in de hersenen kan worden weggesneden met iris-scharen. De interfacekamer kan worden gemaakt met een plastic vershoudbakje.
Het deksel van de interfacekamer is noodzakelijk om het gas binnen te houden. Slices worden waargenomen met een infrarood-DIC-microscoop. Hier zien we een voorbeeld van laag 2/3-neuronen in de primaire motorische cortex.
Patch-registratiepipetten worden gevuld met de geschikte intracellulaire oplossing. De oplossing voor de stroomklemmetanalyse verschilt van die voor de spanningsklemmetanalyse. Representatieve resultaten.
De current-clamp techniek is nuttig voor het analyseren van intrinsieke celeigenschappen. Na training met de Rotor rod waren we in staat om current-clamp data te verkrijgen van neuronen in laag 2/3 van de primaire motorische cortex. Paneel A toont typische traces die door stroominjecties zijn geïnduceerd.
Paneel B geeft de relatie weer tussen de geïnjecteerde stroom en het aantal spikes. Ratten die één dag getraind waren, induceerden minder spikes, terwijl ratten die twee dagen getraind waren, veel meer spikes induceerden dan ongetrainde ratten. Zoals te zien is in de onderste panelen, vertoonden één dag getrainde ratten een lager rustpotentiaal, een hogere spike-drempelwaarde en een diepere afterhyperpolarisatie.
Ratten die twee dagen waren getraind, vertoonden een hoger rustpotentiaal en een hogere membraanweerstand. De voltage-clamptechniek is nuttig voor het analyseren van door leren geïnduceerde synaptische plasticiteit. Hier zien we gegevens van CA1-neuronen na contextuele training.
We hebben miniatuur postsynaptische stromen verkregen uit CA1-neuronen, geïnduceerd door enkele blaasjes van glutamaat of GABA. Panelen A en B tonen representatieve sporen van miniatuur postsynaptische stromen. In aanwezigheid van tetrodotoxine werden miniatuur EPSC's bij -16 millivolt en miniatuur IPSC's bij 0 millivolt sequentieel gemeten in dezelfde neuronen.
Paneel C toont tweedimensionale plots van de amplitudes van miniature EPSC en miniature IPSC bij ongetrainde, getrainde, ongepaarde en walk-through ratten. Paneel D toont de plots voor de miniature frequenties. Zoals te zien is in de onderste panelen, hebben contextuele trainingen zowel de exciterende als de inhiberende synapsen significant versterkt, wat de diversiteit van synaptische input naar de neuronen bevordert.
Samenvattend is de current-clamp techniek nuttig voor het analyseren van door leren geïnduceerde veranderingen in celkenmerken. Daarnaast is de voltage-clamp techniek een krachtig instrument voor het analyseren van door leren geïnduceerde plasticiteit bij excitatoire en inhibitoire synapsen. De gedetailleerde resultaten van deze analyses kunnen worden gevonden in de volgende publicaties.
Overzicht
Dit artikel demonstreert de slice patch clamp-techniek voor het analyseren van door leren geïnduceerde veranderingen in synaptische eigenschappen en plasticiteit. De studie richt zich op motorische cognitie en contextueel leren bij getrainde ratten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- De slice patch clamp-techniek is cruciaal voor het bestuderen van de synaptische functie.
- Motorische cognitie kan worden beoordeeld met de rotor rod-test.
- Contextueel leren wordt geëvalueerd via tests voor inhibitoire vermijding.
- Inzicht in synaptische plasticiteit is essentieel voor het begrijpen van leermechanismen.
Doel van de studie
- Om door leren geïnduceerde synaptische plasticiteit bij ratten te analyseren.
- Om synaptische eigenschappen tussen getrainde en ongetrainde dieren te vergelijken.
- Om het neuromechanisme van motorisch rennen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Rotor rod-test voor het beoordelen van de acquisitie van motorische vaardigheden.
- Inhibitory avoidance-test voor de analyse van het contextuele geheugen.
- Preparatie van hersenplakjes en patchclamp-opnames.
- Current- en voltage-clamp technieken om synaptische activiteit te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Twee dagen training verbeterden de motorische vaardigheid aanzienlijk.
- Getrainde ratten vertoonden verbeterde synaptische eigenschappen in vergelijking met ongetrainde ratten.
- Current-clamp-gegevens lieten een toename van de spiking-activiteit zien bij getrainde ratten.
- Voltage-clamp-resultaten wezen op veranderingen in miniatuur postsynaptische stromen.
Conclusies
- De studie bevestigt de effectiviteit van de slice patch clamp-techniek.
- Training verbetert zowel de motorische vaardigheden als de synaptische plasticiteit.
- Deze bevindingen dragen bij aan het begrip van de neurale basis van leren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
De slice patch clamp-techniek maakt directe meting mogelijk van leer-geïnduceerde veranderingen in neuronale exciteerbaarheid en synaptische sterkte, wat mechanistische inzichten biedt in de adaptatie van neurale circuits. Deze benadering ondersteunt target-validatie bij het ontdekken van neurologische geneesmiddelen door gedragstypische fenotypes te koppelen aan cellulaire en synaptische fenotypes. Het verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door hypothesen over de effecten van verbindingen op plasticiteitsgerelateerde pathways te reduceren in risico.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door veranderingen in de rustmembraanpotentiaal, de drempelwaarde voor actiepotentialen en de membraanweerstand te meten in getrainde versus ongetrainde neuronen.
- Wetenschappelijke waarde: Verduidelijkt de betrokkenheid van signaalpaden door aan te tonen dat leerprocessen leiden tot een toename van de spiking-activiteit in piramidale neuronen van laag II/III in de motorische cortex.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door synaptische plasticiteit te kwantificeren bij zowel excitatoire als inhibitoire synapsen in hippocampale CA1-neuronen na contextueel leren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen (acute hersensecties) voor op verdere beoordeling van de effecten van verbindingen op intrinsieke en synaptische neuronale eigenschappen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt standaardisatie van de assay mogelijk door sequentiële registratie van mEPSC's en mIPSC's van hetzelfde neuron, waardoor variabiliteit in metingen van de synaptische sterkte wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve resultaten (amplitude, frequentie van postsynaptische stromen) die een betrouwbare evaluatie van verbindingen in fenotypische screeningscampagnes ondersteunen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de bruikbaarheid van het systeem voor ziekte-relevante toepassingen door het modelleren van leer-geïnduceerde plasticiteit in de motorische cortex en hippocampus, regio's die relevant zijn voor cognitieve en motorische stoornissen.
- Wetenschappelijke waarde: Garandeert translationele continuïteit van gedragstraining (rotarod, inhibitie-vermijdingsleer) naar cellulaire read-outs, wat bijdraagt aan mechanisme-gebaseerde target-validatie.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door het identificeren van verbindingen die leer-geïnduceerde hyperactiviteit of synaptische disbalans normaliseren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De techniek is geïntegreerd in het continuüm van ontdekkingen, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, in het bijzonder voor targets die de neuronale exciteerbaarheid of synaptische transmissie moduleren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door neuronale eigenschappen van behavioraal getrainde en naïeve dieren te vergelijken om target engagement te valideren.
- Screening: Biedt assay-gereedheid via stabiele, reproduceerbare whole-cell patch clamp-opnames in acute coupes, wat dosis-responsanalyses van testverbindingen mogelijk maakt.
- Analytics: Genereert belangrijke read-outs, waaronder spikecount, rustpotentiaal, membraanweerstand en mEPSC/mIPSC-amplitude/frequentie om neuronale en synaptische responsen te kwantificeren.
- Translationeel Onderzoek: Zorgt voor preklinische continuïteit door door leren geïnduceerde synaptische veranderingen te koppelen aan potentiële biomarkers van circuitdysfunctie in neuropsychiatrische ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbaar elektrofysiologisch platform dat toepasbaar is op verschillende hersengebieden (bijv. sensorische cortex, amygdala) en leerparadigma's, waardoor de benutting van assets wordt gemaximaliseerd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit te verminderen in de wijze waarop leren neuronale en synaptische functies verandert.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie via gedefinieerde protocollen voor slice-preparatie, perfusie en registratie, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door direct elektrofysiologisch bewijs te leveren van target-gemedieerde effecten op plasticiteitspaden.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van verbindingen die pathologische plasticiteit omkeren zonder de baseline-functie te verstoren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, hersensectie en gedragsneurowetenschappen om de datakwaliteit en interpretatie te waarborgen.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder vibratomen, patchclamp-versterkers, perfusiesystemen en infrarood-DIC-microscopie, voor een succesvolle coupesvoorbereiding en registratie.
- Necessiteert cross-team standaardisatie tussen groepen voor gedrag, histologie en elektrofysiologie om trainingsparadigma's af te stemmen op de timing van de coupes en de doelregio's.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de techniek op verschillende hersenregio's of neurontypes, zoals het aanpassen van de oriëntatie van de coupes of de samenstelling van de intracellulaire oplossing.
- Beperkt door de acute aard van hersencoupes, wat longitudinale studies beperkt maar de oorspronkelijke circuitry behoudt voor ex vivo mechanistische analyse.
