Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity
11 november 2017
Het segment patch-clamp techniek is een effectieve methode voor het analyseren van leren-geïnduceerde veranderingen in de intrinsieke eigenschappen en de plasticiteit van excitatory of inhiberende synapsen.
Hallo, mijn naam is Dai Mitsushima. Hier laten we zien hoe je herfsnedes maakt in getrainde dieren door patch clamp-gegevens te vergelijken in niet-getrainde dieren. We kunnen leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit analyseren.
Hallo, mijn naam is Hiroyuki Kida. In dit experiment onderzochten we het neuromechanisme van motorisch rennen door gebruik te maken van de Rotor rod-test. De rotor rod-test wordt veel gebruikt om de motorische cognitie van knaagdieren te evalueren.
Het voordeel van deze methode is dat we het niveau van ontdekking tijdens de test kunnen veranderen door de draaisnelheid te verhogen. Rotor rod-test. Voorafgaand aan de motorische taak moet de rotor rod-apparatus worden ingesteld op accelererende modus van 4 tot 40 tpm gedurende 300 seconden.
Ratten moesten voor elke test tien pogingen doen. In het tijdsinterval tussen de pogingen was 30 seconden. Tijdens de eerste trainingssessie vallen ratten meestal van de staaf, zelfs bij lage snelheden en lopen soms in de verkeerde richting.
Na herhaling van de training kan de rat echter met een hogere snelheid lopen. Door de latentie op de staaf te meten, kunnen we de leerprestatie van de rat van de vaardigheid schatten. Hier kunnen we de resultaten van de rotor rod-test zien.
Zoals in deze figuur te zien is, is twee dagen training voldoende om de motorische vaardigheid te verwerven. In vergelijking met de latentie bij de eerste poging, toonde post hoc-analyse een significante verbetering op de laatste trainingsdag. Door de latentie op de staaf te meten, kunnen we de leerprestatie van de rat van de vaardigheid schatten.
Vervolgens laten we je een remmende vermijdingstest zien. Deze test is nuttig bij het analyseren van contextuele leerprestaties. Het remmende vermijdingsapparaat bestaat uit lichte en donkere kanten gescheiden door een valluik.
Tijdens de trainingssessie worden ratten in het verlichte gebied geplaatst en krijgen ze een korte tijd om te acclimatiseren aan de omgeving. Zodra de deur opengaat, kunnen ratten vrij in het verduisterde gebied gaan. Bij het betreden van het verduisterde gebied wordt de deur gesloten en krijgen ratten gedurende twee seconden een milde elektrische schok.
Nadat ze 30 minuten in hun kooi zijn teruggekeerd na voltooiing van de proef, worden de ratten weer in het verlichte gebied van het apparaat geplaatst. Dertig minuten na de schok vertoonden de getrainde ratten consequent een langere latentie voordat ze het donkere gebied binnenkwamen. Hier kunnen we de resultaten van de remmende vermijdingstest zien.
Na de elektrische schok leerden de ratten het verduisterde gebied te vermijden en op de verlichte kant te blijven, wat ze normaal niet zouden doen. Deze neiging om de verduisterde kant te vermijden geeft de verwerving van contextuele herinneringen aan. Hersenslices na training.
Voorafgaand aan de incisie koelen we alle schaar, klemmen en bekers met gemalen ijs. Hier zie je onze voorbereiding voor de dissectie. Hersendissectie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
Na diepe anesthesie wordt de rat in een ondiepe bak met gemalen ijs geplaatst en wordt een incisie gemaakt om de buikholte te openen. Na incisie van het diafragma wordt een verdere laterale incisie gemaakt. Om de borstholte te openen, moet het kraakbeen van de ribben worden gesloten met een klem.
Nadat het hart is blootgelegd, wordt een 18-gauge roestvrijstalen naald in het achterste deel van de linker ventrikel gestoken. Het uiteinde van de naald moet zichtbaar zijn door de wand van de aorta. Na het doorknippen van het rechter oortje, wordt de perfusie gestart.
Zorg ervoor dat zowel de naald als de spuit eerst zijn gevuld met gas-ijskoud dissectiebuffer. Eventuele luchtbellen moeten ook worden verwijderd voorafgaand aan de perfusie. Snijd eerst aan de achterkant van de schedel.
Maak vervolgens een laterale snede, gevolgd door een centrale snede om de hersenen bloot te leggen. Bij dissectie moet de hersenen vijf minuten in borrelend ijskoud buffer worden geplaatst. Voordat de dissectie wordt voortgezet, moet het filterpapier worden bevochtigd met ijskoud buffer.
Vervolgens wordt de hersenen op een ijskoud roestvrijstalen platform geplaatst. De hoek van het snijplatform is cruciaal om een correcte snijvlakke hoek voor de hersenslices te garanderen. Een onjuiste hoek kan mogelijk de doelwitten pyramidale neuronen snijden.
Na het trimmen moet een druppel superlijm op het platform van de vibratoon worden geplaatst. Om een goede hechting te garanderen, moet overtollig dissectiebuffer worden verwijderd met een stukje filterpapier. Met behulp van de vibratoon kunnen dunne hersenslices worden gemaakt die in borrelend ijskoud buffer worden gehouden.
Ons doelgebied is de primaire motorische cortex. Het doelgebied van de hersenen kan worden bijgesneden met behulp van Iris-schaar. De interfacekamer kan worden gemaakt met een plastic voedselcontainer.
Het deksel van de interfacekamer is noodzakelijk om het gas vast te houden. Slices worden waargenomen met behulp van een infrarood-DIC-microscoop. Hier zien we een voorbeeld van laag 2/3 neuronen in de primaire motorische cortex.
Patch-opname pipetten zijn gevuld met de juiste intracellulaire oplossing. De oplossing voor de huidige clamp-analyse is anders dan de spanning clamp-analyse. Representatieve resultaten.
De huidige clamp-techniek is nuttig voor het analyseren van intrinsieke celeigenschappen. Na Rotor rod-training waren we in staat om de huidige clamp-gegevens van laag 2/3 neuronen in de primaire motorische cortex te verkrijgen. Paneel A geeft typische sporen weer die worden veroorzaakt door huidige injecties.
Paneel B geeft de relatie weer tussen de geïnjecteerde stroom en het aantal spikes. Eendags getrainde ratten induceerden minder spikes, terwijl twee dagen getrainde ratten veel meer spikes induceerden dan niet-getrainde ratten. Zoals te zien is in de onderste panelen, vertoonden eendags getrainde ratten een lagere rustpotentiaal, hogere spike-drempel en diepere afterhyperpolarisatie.
Twee dagen getrainde ratten vertoonden een hogere rustpotentiaal en membraanweerstand. De spanning clamp-techniek is nuttig voor he
Overzicht
Dit artikel demonstreert de slice patch clamp-techniek voor het analyseren van leer-geïnduceerde veranderingen in synaptische eigenschappen en plasticiteit. De studie richt zich op motorische cognitie en contextueel leren bij getrainde ratten.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- De slice patch clamp-techniek is cruciaal voor het bestuderen van synaptische functie.
- Motorische cognitie kan worden beoordeeld met behulp van de rotor rod-test.
- Contextueel leren wordt geëvalueerd door middel van remmende vermijdingstests.
- Het begrijpen van synaptische plasticiteit is essentieel voor inzichten in leermechanismen.
Doel van het onderzoek
- Om leer-geïnduceerde synaptische plasticiteit bij ratten te analyseren.
- Om synaptische eigenschappen te vergelijken tussen getrainde en ongetrainde dieren.
- Om het neuromechanisme van motorisch rennen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Rotor rod-test voor het beoordelen van motorische vaardigheidsverwerving.
- Remmende vermijdingstest voor contextuele geheugenanalyse.
- Hersenslice-voorbereiding en patch clamp-opnamen.
- Stroom- en spanningsklemmentechnieken om synaptische activiteit te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Twee dagen van training verbeterden de motorische vaardigheidsprestaties aanzienlijk.
- Getrainde ratten vertoonden verbeterde synaptische eigenschappen in vergelijking met ongetrainde ratten.
- Stroomklemdata toonde verhoogde spiking-activiteit bij getrainde ratten.
- Spanningsklemresultaten gaven aanwijzingen voor veranderingen in miniatuur postsynaptische stromen.
Conclusies
- De studie bevestigt de effectiviteit van de slice patch clamp-techniek.
- Training verbetert zowel motorische vaardigheden als synaptische plasticiteit.
- Deze bevindingen dragen bij aan het begrijpen van de neurale basis van leren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The slice patch clamp technique enables direct measurement of learning-induced changes in neuronal excitability and synaptic strength, providing mechanistic insights into neural circuit adaptation. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking behavioral phenotypes to cellular and synaptic phenotypes. It enhances predictive confidence in early discovery by de-risking hypotheses about compound effects on plasticity-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in resting membrane potential, spike threshold, and membrane resistance in trained versus untrained neurons.
- Scientific Value: Clarifies pathway involvement by demonstrating learning-induced increases in spiking activity in layer II/III pyramidal neurons of motor cortex.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying synaptic plasticity at both excitatory and inhibitory synapses in hippocampal CA1 neurons following contextual learning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices) for downstream assessment of compound effects on intrinsic and synaptic neuronal properties.
- Scientific Value: Enables assay standardization through sequential recording of mEPSCs and mIPSCs from the same neuron, reducing variability in synaptic strength measurements.
- Scientific Value: Provides quantitative outputs (amplitude, frequency of postsynaptic currents) that support reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system utility by modeling learning-induced plasticity in motor cortex and hippocampus, regions relevant to cognitive and motor disorders.
- Scientific Value: Ensures translational continuity from behavioral training (rotor rod, inhibitory avoidance) to cellular readouts, supporting mechanism-based target validation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that normalize learning-induced hyperactivity or synaptic imbalance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, particularly for targets modulating neuronal excitability or synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing neuronal properties between behaviorally trained and naive animals to validate target engagement.
- Screening: Delivers assay readiness via stable, reproducible whole-cell patch clamp recordings in acute slices, enabling dose-response analysis of test compounds.
- Analytics: Generates key readouts including spike count, resting potential, membrane resistance, and mEPSC/mIPSC amplitude/frequency to quantify neuronal and synaptic responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking learning-induced synaptic changes to potential biomarkers of circuit dysfunction in neuropsychiatric disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiology platform applicable across brain regions (e.g., sensory cortex, amygdala) and learning paradigms, maximizing asset utilization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how learning alters neuronal and synaptic function.
- Operational Value: Promotes standardization through defined slice preparation, perfusion, and recording protocols that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct electrophysiological evidence of target-mediated effects on plasticity pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that reverse pathological plasticity without disrupting baseline function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slicing, and behavioral neuroscience to ensure data quality and interpretation.
- Dependent on instrumentation including vibratomes, patch clamp amplifiers, perfusion systems, and infrared-DIC microscopy for successful slice preparation and recording.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and electrophysiology groups to align training paradigms with slice timing and region targeting.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different brain regions or neuron types, such as adjusting slice orientation or intracellular solution composition.
- Limited by the acute nature of brain slices, which restricts longitudinal studies but preserves native circuitry for ex vivo mechanistic analysis.
