Gelijktijdige meting van HDAC1 en HDAC6 activiteit in HeLa cellen met behulp van UHPLC-MS

Het algemene doel van deze methode is om het HDAC-remmende potentieel van verbindingen te bepalen en de selectiviteit voor HDAC6 of HDAC1 in cellen te identificeren met behulp van een enkele ultra-hoge prestatie vloeistofchromatografie massaspectrometrie-assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van geneesmiddelontdekking, zoals het bepalen of een HDAC-remmer selectief is voor HDAC6 boven klasse I HDAC's in levende cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een enkele incubatiestap met cellen, remmers en selectieve substraten vereist om de werkzaamheid tegen twee HDAC-isovormen gelijktijdig te bepalen.

De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar vroege geneesmiddelontdekking van selectieve HDAC-remmers, omdat het detecteert of HDAC6-selectiviteit wordt gehandhaafd in levende cellen, waarbij endogene eiwitacetyleringsassays worden vermeden. Hoewel deze methode de selectiviteit van HDAC-remmers in HeLa-cellen beoordeelt, kan deze ook worden toegepast op andere cellijnen zoals primaire en andere tumorcellen, inclusief klinische monsters. Kweek HeLa-cellen tot 80% confluency in een T75 celcultuurkolf in minimaal essentieel medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum, penicilline G en streptomycine.

Was de cellen tweemaal met vijf milliliter Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline. Asptereer vervolgens de buffer en voeg een milliliter celdissociatiereagens toe. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken.

Na vijf minuten, voeg negen milliliter MEM-kweekmedium toe aan de cellen en schud de celsuspensie grondig. Breng de cellen over naar een nieuwe 15 milliliter buis en tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer. Pas de dichtheid van de celsuspensie aan tot 60.000 cellen per milliliter in MEM.

Voeg vervolgens 100 microliter van de celsuspensie toe aan de controle- en testkolommen van een steriele, platte bodem, weefselkweekbehandelde 96-wellplaat. Voeg vervolgens 100 microliter MEM-kweekmedium toe aan de lege kolommen van de 96-wellplaat. Incubeer de 96-wellplaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Asptereer het medium uit de kolommen van de 96-wellplaat. Vermijd tijdens het aspireren van het medium het losmaken en verwijderen van cellen uit de put. Dit kan worden bereikt door een lage aspiratiesnelheid te gebruiken en de aspirantentips voorzichtig op de bodemhoek van het putoppervlak te plaatsen.

Voeg vervolgens 25 microliter van de twee keer testverbindingen in MEM toe aan de testkolommen, inclusief Trichostatin A, MS275 en Tubastatin A. Voeg 25 microliter MEM toe aan de controle- en lege kolommen. Voeg vervolgens 25 microliter van het substraatmengsel toe aan de controle- en testkolommen. Voeg vervolgens 25 microliter MEM toe aan de lege kolommen.

Incubeer de 96-wellplaat gedurende acht uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% koolstofdioxide incubator. Om cellyse uit te voeren, voeg eerst 10 microliter zes keer RIPA-buffer aangevuld met proteaseremmer toe aan elke kolom van de 96-wellplaat. Stop de reactie door 160 microliter koud acetonitril aan elke kolom toe te voegen en te mengen door op en neer te pipetten.

Plaats de plaat in een min 80 graden Celsius vriezer gedurende 10 minuten. Verwijder de plaat uit de vriezer en breng 220 microliter van de inhoud van elke kolom over naar een niet-steriele, conische bodem 96-wellplaat. Centrifugeer de plaat bij 5.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Na centrifugatie, breng 200 microliter supernatant over in een 96-wellplaat die compatibel is met het UHPLC-systeem. Vervolgens, verzegel de plaat met afplakbare hitte-sealing folie met behulp van een plaatverzegeling. Bereid het ultrahoge prestatie vloeistofchromatografie massaspectrometrie systeem voor door het te vullen met het mobiele fase systeem.

Plaats de 96-wellplaat in een monsterbeheerder met een plakhouder. Voer de monsters uit volgens de UHPLC ESI MS/MS-condities die in de tekst zijn te vinden. Om gegevensanalyse uit te voeren, integreer het piekoppervlak van elk substraat en zijn deacetyleerd product met de juiste UHPLC-integratiesoftware.

Voor elk substraat, bereken de piekoppervlakteverhouding van deacetyleerd tot geacetyleerd in elk chromatogram. Bevat de test- en controlemonsters. Bereken tenslotte het percentage HDAC-remming van elk testmonster volgens de vergelijking in het tekstprotocol.

Het UHPLC-MS-chromatogram van een monster wordt hier gepresenteerd. De pieken die overeenkomen met de substraats die aan de cellen zijn toegevoegd, worden gedetecteerd volgens hun massaovergangen zoals beschreven in tabel één van het geschreven protocol. MOCPAC wordt gedeacetyleerd door HDAC1 om de gedeacetyleerde MOCPAC-piek te bieden.

Gelijkerwijs, BATCP wordt gedeacetyleerd door HDAC6 om de gedeacetyleerde BATCP-piek te bieden. Ten slotte, MAL biedt de gedeacetyleerde MAL-piek die de deacetylering van verschillende endogene HDAC's onspecifiek weerspiegelt. Hier getoond, de figuur met het chromatogram verkregen met verschillende concentraties van de HDAC-remmer Trichostatin A. Een dosisrespons evaluatie van standaard HDAC-remmers werd uitgevoerd.

De geïntegreerde waarden verkregen van MOCPAC en dMOCPAC werden gebruikt om de potentie van standaardremmers tegen HDAC1 te berekenen. Na IC 50-berekeningen, vertoonde MS275, een selectieve Klasse I HDAC-remmer, lagere IC 50-waarden voor HDAC1 dan Tubastatin A, een bekende HDAC6-remmer. Aan de andere kant, de geïsoleerde waarden van BATCP en dBATCP werden gebruikt om de potentie van de standaarden tegen HDAC6 te berekenen.

Deze keer, Tubastatin A verschafte een lagere IC 50-waarde dan MS275, wat hun isovormselectieprofiel bevestigt. Trichostatin A is een krachtige, niet-selectieve remmer. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 72 uur worden uitgevoerd als het goed wordt uit