ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

Het algemene doel van ODELAY is om groeifenotypen van individuele cellen die uitgroeien tot kolonies te meten op een manier met hoge doorvoer. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie, genetica en systeembiologie, zoals de effecten van genetische verstoringen en medicijninteracties op groeifenotypen van elk kolonievormend micro-organisme. Het belangrijkste voordeel van ODELAY is dat het de onderzoeker in staat stelt om direct populatieheterogeniteit tussen een groot aantal individuen te observeren en te kwantificeren.

Voor het samenstellen van de agarvorm, reinig de acrylvormen met 70% ethanol en droog ze met geforceerde lucht. Er zijn drie onderdelen en twee verticale delen. Om de agarvorm te beginnen, neem de drie onderdelen en stel ze zo samen dat de twee identieke delen het derde stuk omvatten.

Gebruik twee kleine binderclips om de basisdelen aan elke kant vast te klemmen. Plaats de verticale delen in de vorm en zorg ervoor dat de lasercurve correct is gepositioneerd. Plaats een schoongemaakte en gedroogde glazen plaat op de vorm en houd deze op zijn plaats terwijl u een tweede glazen plaat aan de andere kant plaatst.

Klem de constructie met een grotere binderclip. Klem beide platen vast met grotere binderclips en zorg ervoor dat elke bovenste binderclip contact maakt met de glazen plaat die de acryl overlapt. Voordat u de samengestelde vorm vult met gesmolten agar, moet u ervoor zorgen dat de randen zijn afgedicht door ongeveer 70 microliter gesmolten agar media langs de binnenkant van de vorm te pipetteren.

Vul de vorm zonder luchtbellen erin door langzaam de gesmolten agar langs de rand van de vorm te pipetteren. Nadat de vorm is gevuld, laat deze ongeveer 40-60 minuten afkoelen bij een omgevingstemperatuur van ongeveer 23 graden Celsius. De volgende stap is het scheiden van de vorm.

Begin met het verwijderen van de onderste binderclip. Vervolgens verwijdert u het onderste deel van de vorm dat bestaat uit de drie ingeklemde stukken. Houd de platen vast door ze samen te drukken en verwijder vervolgens voorzichtig de binderclips.

Plaats de vorm op de rand van de werktafel zodat de kant met de blauwe stip naar boven gericht is. Plaats beide duimen onder de acryl en de eerste vingers aan de bovenkant richting de binnenrand van de vorm en duwt langzaam en voorzichtig omhoog met de duimen tegen de vorm alsof u de vormschijf om zijn onderste rand draait. Oefen constante maar langzaam toenemende druk uit.

Er zou een breuk en een luchtbel moeten verschijnen langs de lijn waar de bovenste glasplaat de vormschijf bedekt. Nadat u de eerste breuklijn hebt gezien, blijft u omhoog duwen met beide duimen en oefen constante druk uit. De agar zou moeten beginnen los te komen van het glas.

Ga door met het omhoog draaien van de vorm. Zodra het glas volledig vrijkomt, grijpt u het en verwijdert u het volledig uit de vorm. Vervolgens verwijdert u het andere vormdeel met een vergelijkbare beweging om het deel vrij te tillen zonder de agar te verplaatsen.

Plaats de platen in een steriele tipbox met wat sterieel water van hoge zuiverheid in de bodem. Sluit de doos en bewaar deze 's nachts bij 4 graden Celsius voor gebruik de volgende dag. Begin deze procedure door de stammen voor te bereiden in een 96-wellplaat zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik een plate reader om de optische dichtheid bij 600 nanometer van elke cultuur te meten. Gebruik vervolgens een geautomatiseerd verdunningsprotocol om de culturen in de plaat te verdunnen tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van ongeveer 0,1. Zodra het verdunningsprogramma is ingesteld, laadt u platen, buisjes en tips op het dek van de robot voor vloeistofbehandeling zoals aangegeven door de deklay-out.

Klik op de speelknop om het verdunningsprogramma uit te voeren. Selecteer het juiste aantal 50 microliter tips en het juiste aantal 300 microliter tips. Nadat de verdunning is voltooid, verwijdert u de verdunningsplaat van de robot en cultiveert u de plaat bij 30 graden Celsius met behoud van de luchtvochtigheid om uitdroging van de plaat te voorkomen gedurende vijf tot zes uur.

Ongeveer één tot twee uur voordat de incubatie van de cultuurplaat voltooid is, zet u de incubatiekamers voor de microscoop aan en laat ze gelijkmatig worden bij 30 graden Celsius. Verdun de cultuur een tweede keer tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,01 tot 0,02 met behulp van hetzelfde geautomatiseerde verdunningsprotocol. Bedek de verdunningsplaat met een metalen vriesverbinding en soniceer in een ijsbad gedurende 30 seconden met de plaat drijvend in ijswater.

Label vier 96-well vlakbodemplaten als één, twee, drie en vier. Breng 150 microliter van elke gesoniceerde cultuur over van de verdunningsplaat naar de vlakbodemplaten volgens dit patroon. Putjes A1 tot D6 naar putjes C4 tot F9 van plaat Een.

Putjes A7 tot D12 naar putjes C4 tot F9 van plaat Twee. Putjes E1 tot H6 naar putjes C4 tot F9 van plaat Drie. En putjes E7 tot H12 naar putjes C4 tot F9 van plaat Vier.

Om deze procedure te beginnen, plaatst u de agaroseplaat correct in de plaatkamer. Plaats vervolgens de 96-well vlakbodemplaten op de tafel in de volgorde van hun kwadrant. Plaat Een, Twee, Drie en Vier van links naar rechts.

Leg tips in vier lege tipdozen zodat de binnenste 24 putjes van elke tipbox worden bezet met tips. Plaats in een vijfde doos een tip op positie C10 en tips met hun uiteinde afgesneden op posities A1, A12, H1 en H12. Deze vier afgesneden tips zorgen voor stabiliteit voor de tipplaatklem.

Plaats de eerste tip punch in de startsite van het robot control spotprogramma om een gat in de agarose te prikken dat later zal worden gebruikt voor het uitlijnen van de oorsprongscoördinaat. Plaats plaat Een op de robot voor vloeistofbehandeling om het eerste kwadrant te