ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

Het algemene doel van ODELAY is om groeifenotypes van individuele cellen die uitgroeien tot kolonies op een high-throughput manier te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de microbiologie, genetica en systeembiologie, zoals de effecten van genetische perturbaties en geneesmiddelinteracties op de groeifenotypes van elke kolonievormende micro-organisme. Het belangrijkste voordeel van ODELAY is dat het de onderzoeker in staat stelt om populatieheterogeniteit tussen een groot aantal individuen direct waar te nemen en te kwantificeren.

Reinig de acrylvormen met 70% ethanol en droog ze met geforceerde lucht voordat u de agarvorm assembleert. Er zijn drie bodemstukken en twee verticale stukken. Om de montage van de agarvorm te starten, neemt u de drie bodemstukken en assembleert u deze zodanig dat de twee identieke stukken het derde stuk inklemmen.

Gebruik twee kleine binder clips om de basisstukken aan elke zijde vast te klemmen. Plaats de steunen in de mal en zorg ervoor dat de lasercurve correct is gepositioneerd. Plaats een gereinigde en gedroogde objectglasplaat op de mal en houd deze op zijn plaats terwijl u een tweede objectglasplaat aan de andere zijde plaatst.

Klem de assemblage vast met een grotere klem. Klem beide objectglazen vast met grotere klemmen, waarbij u ervoor zorgt dat elke bovenste klem in contact staat met het objectglas en over het acryl heen valt. Voordat u de gemonteerde mal vult met gesmolten agar, dient u te controleren of de randen zijn afgedicht door ongeveer 70 µL gesmolten agarmedium langs de binnenzijde van de mal te pipetteren.

Vul de mal zonder luchtbellen in te sluiten door de gesmolten agar langzaam langs de rand van de mal te pipetteren. Laat de mal na het vullen ongeveer 40-60 minuten afkoelen bij een omgevingstemperatuur van circa 23 °C. De volgende stap is het scheiden van de mal.

Begin met het verwijderen van de onderste klem. Verwijder vervolgens het onderste deel van de mal, dat bestaat uit de drie tussengeplaatste stukken. Houd de objectglazen vast door ze samen te drukken en verwijder daarna voorzichtig de klemmen.

Plaats de mal op de rand van het werkblad, zodanig dat de zijde van de mal met de blauwe stip naar boven is gericht. Plaats beide duimen onder het acryl en de wijsvingers aan de bovenzijde richting de binnenrand van de mal, en duw langzaam en voorzichtig met de duimen tegen de mal omhoog, alsof u de malafstandhouder om zijn onderrand draait. Oefen een constante, maar langzaam toenemende druk uit.

Er zou een breuk en een luchtbel moeten verschijnen langs de lijn waar het bovenste glas de vormafstandhouder bedekt. Nadat de eerste breuklijn zichtbaar is, gaat u door met omhoog duwen met beide duimen en oefent u een constante druk uit. De agar zou zich nu van het glas moeten beginnen los te maken.

Blijf de mal omhoog kantelen. Zodra het glas volledig loskomt, pakt u het vast en verwijdert u het geheel uit de mal. Verwijder vervolgens het andere malstuk met een vergelijkbare beweging om het stuk los te tillen zonder de agar te verschuiven.

Plaats de objectglazen in een steriele tipdoos met een kleine hoeveelheid steriel water van hoge zuiverheid op de bodem. Sluit de doos en bewaar deze gedurende de nacht bij 4 °C voor gebruik de volgende dag. Start deze procedure door de stammen in een 96-wells plaat voor te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik een platenlezer om de optische dichtheid bij 600 nanometer van elke cultuur te meten. Gebruik vervolgens een geautomatiseerd verdunningsprotocol om de culturen in de plaat te verdunnen tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van ongeveer 0,1. Zodra het verdunningsprogramma is ingesteld, plaatst u de platen, buisjes en tips op het deck van de vloeistofbehandelingsrobot zoals aangegeven in de deckindeling.

Klik op de afspeelknop om het verdunningsprogramma uit te voeren. Selecteer het juiste aantal tips van 50 µL en het juiste aantal tips van 300 µL. Wanneer de verdunning is voltooid, verwijdert u de verdunningsplaat uit de robot en cultureert u de plaat gedurende vijf tot zes uur bij 30 °C, waarbij de luchtvochtigheid wordt gehandhaafd om uitdroging van de plaat te voorkomen.

Ongeveer één tot twee uur voordat de incubatie van de cultuurplaat is voltooid, schakelt u de incubatiekamers van de microscoop in en laat u deze equilibreren bij 30 °C. Verdun de cultuur voor een tweede maal tot een optische dichtheid bij 600 nm van 0,01 tot 0,02 met gebruik van hetzelfde geautomatiseerde verdunningsprotocol. Dek de verdunningsplaat af met een metalen vriesafdichting en soniceer 30 seconden in een ijsbad, waarbij de plaat drijft in ijswater.

Label vier 96-wells platen met een vlakke bodem als één, twee, drie en vier. Breng 150 µL van elke gesoniceerde cultuur over van de verdunningsplaat naar de platen met een vlakke bodem volgens dit patroon. Wells A1 tot D6 naar wells C4 tot F9 van Plaat Eén.

Wells A7 tot D12 in wells C4 tot F9 van plaat twee. Wells E1 tot H6 in wells C4 tot F9 van plaat drie. En wells E7 tot H12 in wells C4 tot F9 van plaat vier.

Om deze procedure te starten, plaatst u de agarose-dia correct in de diahouder. Plaats vervolgens de 96-well platen met platte bodem op de tafel in de volgorde van hun kwadrant. Plaat één, twee, drie en vier van links naar rechts.

Plaats tips in vier lege tipdozen, zodat de binnenste 24 putjes van elke tipdoos met tips zijn gevuld. Plaats in een vijfde doos een tip op positie C10 en tips waarvan het uiteinde is afgesneden op posities A1, A12, H1 en H12. Deze vier afgesneden tips zorgen voor stabiliteit voor de klem van de tipplaat.

Plaats de eerste tip punch op de startpositie van het robotgestuurde spottingprogramma om een gat in de agarose te ponsen, dat later wordt gebruikt voor het uitlijnen van de oorsprongscoördinaat. Plaats plaat één op de vloeistofbehandelingsrobot om het eerste kwadrant te spotten. Verwijder het deksel en ga verder met het spottingprogramma.

Controleer of alle spots aanwezig zijn. Gooi de gebruikte tips in de container voor biologisch gevaarlijk afval en plaats nieuwe tips op de robot. Wacht ongeveer 30 seconden totdat de spots zijn opgedroogd tot een diameter van ongeveer één millimeter en vervolg vervolgens het programma.

Vervang plaat één door plaat twee en ga verder met het spotting-programma. Wanneer alle vier de kwadranten zijn gespot en de spots droog zijn, plaatst u de afdekking van de objectglaskamer terug en draait u het apparaat om. Plaats een objectglas op de bovenzijde van de objectglaskamer.

Plaats eerst de objectglaskamer in de microscoop. Time-lapse microscopie wordt uitgevoerd door middel van een speciaal ontworpen script. Klik op de sluiter om de doorlaatlichtsluiter te openen en vervolgens op de focusknop om de hoge camerasnelheid te starten.

Klik op "Go Origin" en verplaats de tafel omHet in de agar geslagen nulpuntsmerk te vinden, en beweeg vervolgens iets naar rechts om scherp te stellen op de cellen die in gebied E7 zijn gespot. Beweeg terug naar het nulpuntsmerk en centreer dit in het gezichtsveld. Stel het nulpunt in op deze waarde door op de knop "Set" te drukken. Verplaats naar positie H18 en stel scherp met de inbusbout die het dichtst bij die locatie ligt.

Ga vervolgens naar positie L7 en stel de focus in met de inbusschroef die zich het dichtst bij die locatie bevindt. Ga tot slot naar positie E7 en stel de focus in met de inbusschroef die het dichtst bij die locatie ligt. Controleer de focus in het centrum en aan de randen op de punten E12, H12 en L12; pas het autofocusbereik aan als de focus z-waarden, zoals aangegeven door de z-waarde, groter zijn dan plus of minus het autofocusbereik.

Druk op de knop "Reset" en druk vervolgens op ODELAY. Kies de map waarin de gegevens moeten worden opgeslagen. De microscoop verzamelt 48 uur lang gegevens of tot het programma wordt gesloten.

Deze representatieve timelapse-beelden tonen gistcellen die groeien op een vast medium op nul uur, drie uur, zes uur en negen uur na het spotten. Hier wordt een representatieve dataset getoond waarin twee giststammen worden vergeleken na verwerking van de timelapse-beelden. De relatief uniforme verdubbelingstijden weerspiegelen de goed geprepareerde agarose-slide, hoewel de lagg-tijden aanzienlijk variëren door autofocus-instellingen die niet optimaal zijn.

Hier wordt een consistentere dataset getoond waarin alle verdubbelingstijden goed lijken te overlappen en de lag-tijden consistent lijken te zijn. Eenmaal beheerst kan de opstelling van ODELAY in drie tot vier uur worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd. De meest kritieke stappen voor reproduceerbare ODELAY-metingen zijn het consistent bereiden van de media en het vermijden van mechanische vervorming van de media bij het scheiden van de objectglaasjes.

ODELAY is een zeer gevoelige assay. Zo kunnen hiermee groeidefecten in temperatuurgevoelige giststammen bij kamertemperatuur worden waargenomen, terwijl veelgebruikte spot-assays het kweken van gist bij 37 °C vereisen om een groeidefect aan te tonen. Hoewel ODELAY is ontwikkeld voor gist, is de methode toepasbaar op elk kolonievormend organisme, inclusief pathogenen, om een breed scala aan omgevings- en genetische condities te onderzoeken en zo het gedrag van micro-organismen te begrijpen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ODELAY uitvoert om groeifenotypes te meten van eencellige micro-organismen die kolonies vormen op vaste media. Vergeet niet dat werken met micro-organismen gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen die geschikt zijn voor de bestudeerde organismen.