Name: ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer de ODELAY-methode voor grootschalige kwantificering van gistgroei met tijdverloopmicroscopie. Deze techniek maakt directe observatie en kwantificering van populatieheterogeniteit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen steun voor dit werk door U54 RR022220 en P50 GM076547 te JDA van de Amerikaanse National Institutes of Health. FDM is een postdoctorale collega met de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek. Wij danken ook het Luxemburgse Centrum voor Systemen Biomedicine en de Universiteit van Luxemburg voor ondersteuning.

1. Bereiding van agarose gelvoorraad <ol><li> Weeg 2 g agarose met een hoge zuiverheid af. </li><li> Voeg de agarose toe aan een 500 ml fles en schrijf de gecombineerde massa op. </li><li> Bereken de doelmassa van de fles plus 2 g agarose met 150 g ultrazuiver water en voeg dan 150 g ultrazuiver water toe aan binnen 0,1 g van deze doelmassa. </li><li> Let op de massa van de fles plus de agarose en het water. </li><li> Plaats de fles in een magnetron en zorg ervoor dat u de fles vastzet met een losse dop op de bovenkant om de waterverdamping te minimaliseren terwijl u de agarose verhit. </li><li> Magnetron de fles in 15 - 20 s bursts gevolgd door de fles kort te draaien om de agarose en water te mengen. Herhaal deze procedure tot de oplossing kookt en het mengsel is homogeen. VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat de huid niet wordt afgespild met stoom die uit de fles komt. Ook wordt de fles heet en kan de bescherming beschadigd worden, zoals een autoclaafhandschoen.</li><li> Nadat de gesmolten agarose homogeen is, weeg de fles weer en voeg ultrauw water toe binnen 0,1 g van de originele massa. Dit zal vervangen worden door het verlies van water door verdamping. </li><li> Voordat de gesmolten agarose stollt, wervel om te mengen in het toegevoegde water om homogeniteit te waarborgen. </li><li> Aliquot 15,2 g agarose in 9 - 50 ml plastic buizen. </li><li> Koel de buizen naar behoefte. </li></ol> 2. Voorbereiden van ODELAY Agarose Media <ol><li> Verhit 400 ml gedeïoniseerd water in een overdekte beker, op een kookplaat onder zacht roeren met een magnetische roerbalk. </li><li> Voeg 2 ml 10X media ( bijv . Gist Extract Pepton (YEP) of Complete Supplement Mengsel (CSM) toe aan een 15,2 g agarose-aliquot in een 50 ml conische buis uit stap 1.10. OPMERKING: CSM-medium heeft de neiging om vast te houden aan de glazen glijbanen. Als u CSM media formuleringen gebruikt, voeg dan 5 μL 50% wt polyethyleenglycol (PEG) in steriel water toe aan de mediumformulering. De PEG voorkomt de aGar van het vasthouden aan de glazen glijbanen tijdens het loslaten van de schimmel en verhindert de gistengroei niet. </li><li> Voeg extra 100X voedingssupplementen toe, indien nodig, en gebruik water om het totale toegevoegde volume van deze stap naar 1 ml te brengen. </li><li> Weeg de agarose-aliquot met extra media en supplementen voordat u de 50 ml kegelbuis in kokend water van stap 2.1 plaatst. </li><li> Na 16 minuten haal de 50 ml buis uit en meng het mengsel met een draaikolk. Houd de dop vast aan de 50 ml conische buis vast. OPMERKING: Een deksel op de beker helpt de gehele buis gelijkmatig te verwarmen, anders vormt een film van vaste agarose en eventueel niet smelt. Ook tijdens deze tijd is het handig om de agarosevorm te monteren ( figuur 1 ). </li><li> Homogeniseer het mengsel met behulp van een draaikolk. </li><li> Kook nog 2 minuten om ervoor te zorgen dat alle agar gemengd en gesmolten is. </li><li> Weeg buis en vervang eventuele massa die met ultrazuiver steriel water is verloren. </li><li> Voeg 2 ml 10X carbonzuur toeCe reagens ( bijv . 20% w / v glucose) en vortex om agarose medium oplossing te verkrijgen. OPMERKING: Scheiding van glazen glijbanen: Bij het monteren van de mal moet erop worden gezorgd dat de lange afstandhouders met de juiste oriëntatie in de vorm worden geplaatst. Dit komt doordat de laser de acryl snijdt, het heeft de neiging om te knippen als een kegel, waarbij het deel met een beetje hoekige zijden wordt verlaten in plaats van precies 90 ° kanten. Dan moet de rand van de spacer op een scherpe hoek zijn met de agar wanneer de vorm op de bencht geplaatst wordt om het glas uit de agar te laten lossen. De scherpe hoek helpt de rand van de agar weg van het bovenste glas te comprimeren, aangezien de buitenrand van de schimmelruimte om de onderrand draait (zie figuur 1 ). Het resultaat is een consistente scheiding van de agar uit het bovenste glas. OPMERKING: Mould release agentia toegepast op het glas zoals oliën, siliciumsprays of zelfs commerciële vensterbehandelingen mogen niet gebruikt worden omdat ze de s verontreinigen<html> Oppervlak van de agar en mogelijk de groei remmen. Deze methoden hebben een aantal praktijken om consistent te zijn. </li><li> Reinig vier 2 in x 3 in x 1 mm dikke glijbanen met 70% ethanol en droog met gedwongen lucht. </li><li> Maak acrylvormen schoon met 70% ethanol, droog en monteer zoals afgebeeld in Figuur 1 . Neem de drie onderstukken, zoals afgebeeld, en monteer ze zodat de twee identieke stukken het derde stuk sandwichen ( figuur 1B ). Klem de basisstukken aan beide zijden aan met behulp van twee kleine binderclips ( figuur 1C ). Plaats de staander in de vorm en zorg ervoor dat de laserkapper correct is gepositioneerd ( Figuur 1E ). </li><li> Plaats de gereinigde en gedroogde glazen glijplaat op de mal en houd hem vast terwijl u een tweede glazen glijbaan aan de andere kant plaatst. Bevestig de montage met een grotere bindmiddelclip ( Figuur 1D ). Pak beide glijbanen vast met grotere bindclips (Lass = &quot;xfig&quot;&gt; Figuur 1D). Zorg ervoor dat de bovenste bindmiddelclip in contact is met de glazen glijbaan die overlapt met de acryl. </li><li> Voeg resterende bindclips toe. Zorg er nogmaals voor dat de klemmen contact opnemen met de dia, waar het de acryl overlappt ( Figuur 1D ). OPMERKING: Voordat u de gemonteerde vorm met gesmolten agar opvult, dient u ervoor te zorgen dat de randen door middel van pipettering ongeveer 70 μl gesmolten agarmedia langs de binnenzijde van de vorm worden verzegeld. Deze agar zal snel stollen en voorkomen dat er lekken ontstaan. </li><li> Vul de vorm met gesmolten agar, zorg ervoor dat de luchtbellen in de mal voorkomen worden. OPMERKING: dit kan worden bereikt door langzaam de gesmolten agar langs de rand van de mal te pipetteren. Nadat het is gevuld, laat de vorm gedurende 40 minuten tot 1 uur afkoelen bij ongeveer 23 ° C omgevingstemperatuur. Als het te lang afkoelt, kan de agar in de mal breken. OPMERKING: Schimmelvorming: Het verwijderen van de schimmelvorming van de gegoten agar is essentieel om een ​​uniforme vaste stof te waarborgenAgar pad voor gistengroei. Als u niet in staat bent om de schimmelvorming op deze stap doeltreffend te scheiden, veroorzaakt u groeiverschillen die te wijten zijn aan onvolkomenheden in het solide agarpaneel. Dit is een paar keer aanbevolen om deze stap uit te oefenen. </li><li> Begin door de onderste binder clip te verwijderen. Verwijder het onderste gedeelte van de mal die bestaat uit de drie ingebonden stukken. Houd de dia&#39;s vast door ze te comprimeren en verwijder vervolgens de bindclips. Zorg ervoor dat u de vormkanten niet stoot terwijl u de bindklemmen verwijdert. Dit zal de media vervormen. </li><li> Plaats de mal op de rand van de bankbovenkant zodat de zijde van de mal met de blauwe stip naar boven en in de linker benedenhoek staat ( Figuur 1E ). Plaats duimen onder de acryl en de eerste vinger aan de bovenkant naar de binnenkant van de mal. </li><li> Duw langzaam en zorgvuldig met de duim tegen de matrijs omhoog, alsof de malafstand tussen de onderrand ( figuur 1F ) draait. Breng constant aanMaar langzaam toenemende druk. Gebruikers zullen een pauze zien en luchtbellen verschijnen langs de lijn waar het bovenste glas de vormruimte verdeelt. </li><li> Nadat u de eerste pauze hebt gezien, blijft u met duimen omhoog duwen en constant druk toepassen. De agar moet op dit moment vanaf het glas wegbreken ( figuur 1F ). Ga door de vorm naar voren te draaien. Dit zal het glas opheffen zonder te glijden. Een lijn waar de agar wegvalt van het glas, moet zich verder bewegen van de eerste breeklijn. OPMERKING: op dit punt stopt de agar aan zowel de bodem als de bovenkant van het glas. Dit gebeurt af en toe met de linker meest rand. Zolang het gebied vervormd is, is het niet in het gebied waar gist is gespot, dit zou goed moeten zijn. </li><li> Als het glas helemaal vrij komt, pak het en verwijder het helemaal uit de mal. Verwijder vervolgens het andere vormstuk met een soortgelijke beweging om het stuk los te maken zonder de agar te verplaatsen. Plaats de glijbanen in eenSteriele puntendoos met wat steriel water met hoge zuiverheid in de bodem. Sluit de doos en bewaren bij 4 ° CO / N voor gebruik de volgende dag. Als u langer wordt opgeslagen, worden de groeitempo inconsistent. </li></ol> 3. ODELAY Cultuurvoorbereiding <ol><li> Lay-out stammen in een 96-put plaat voor O / N groei. </li><li> De volgende dag verdunnen 20 μL van de nachtcultuur in 200 μl media voor 220 μl totaal volume in een nieuwe plaat. </li><li> Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van elke cultuur in een plaatlezer. Volg het geautomatiseerde verdunningsprotocol van stappen 3.3.1 - 3.3.6 met behulp van een plaatlezer en een vloeibare behandelingsrobot. Verdun de culturen handmatig in de plaat tot ongeveer 0,1 OD600 (optioneel). <ol><li> Klik op de plaatlezer op &quot;Experiment&quot; onder &quot;Creëer nieuw&quot;. Kies ODELAYDilution.exp en voer het experiment uit. Voer de experimentnaam in als ODELAY &quot;Date&quot; &quot;Time&quot; &quot;Experiment Name&quot; iteratie. </li><li> Klik op de sTabblad tabellen en klik vervolgens op het Excel-icoon. Sla de gegevens op op een thumb drive en over te brengen naar een robot robot computer. </li><li> Open de Robot&#39;s Layout and Method Editor. Open het methodebestand &quot;ODELAYDilution_v1.med&quot;. Voer de uitvoerbare &quot;Convert_SynergyFiles.exe&quot; uit. Voer 0,09 voor doel OD600 in. </li><li> Klik op &quot;Glu Correction&quot; en &quot;Gal Correction&quot; op 0,05. Meet blanco media in een identieke plaat. Klik op &quot;Generate File&quot;. Selecteer het bestand in de methode-editor. Klik op het pictogram stoplicht om de methode te starten om het runtime-verdunningsprogramma te openen. </li><li> Zorg ervoor dat de buizen niet open zijn en de platen hebben deksels verwijderd en de stofafdekkingen worden verwijderd van de tips. Laad platen, buizen en uiteinden op het dek van de vloeistofverwerkende robot, zoals aangegeven door de deklay-out. </li><li> Klik op de knop &#39;Afspelen&#39; om het verdunningsprogramma te starten. Selecteer het juiste aantal 50 μL tips. Selecteer het juiste aantal 300 μL tips. Wacht over12 minuten voor het proces te lopen. </li></ol></li><li> Neem de verdunningsplaat uit de robot, bedek de tips en pak de 15 ml mediabuisjes op. Kweek de plaat gedurende 5 - 6 uur bij 30 ° C. </li><li> Ongeveer 1 - 2 uur voor het starten van de tweede verdunning zorg ervoor dat u de incubatiekamers voor de microscoop inschakelt. Laat ze evenwaren bij ° C of de temperatuur die nodig is voor het experiment. </li><li> Herhaal de verdunningsstapjes 3.3 - 3.4, maar verdunde culturen aan een OD600 van 0,01-0,02 om de culturen op agaroseglazen te spotten. </li><li> Bedek de verdunningsplaat met een metalen vriezerafdichting. </li><li> Soniceer de verdunningsplaat in een ijsbad gedurende 30 s met de plaat die in ijswater drijft met behulp van een centrifuge metalen emmer om de plaat vast te houden ( figuur 2A ). Breng de sonicated culturen over van de verdunningsplaat naar een platte bodemplaat. Label 4 x 96-brede platte bodemplaten 1, 2, 3 en 4 ( Figuur 2B ). <ol><li> Overdracht 150 &amp;# 181; L van de verdunningsplaat uit putten A01 - D06 in putten C04 - F09 van plaat gemerkt 1. Vervolgens 150 μL van de verdunningsplaat uit putten A07 - D12 in putjes C04 - F09 van plaat gemerkt 2. Vervolgens 150 μL Van de verdunningsplaat uit de putjes E01 - H06 in putten C04 - F09 van de plaat gemarkeerd. 3. Breng 150 μL van de verdunningsplaat van de putjes E07 - H12 uiteindelijk over in putjes C04 - F09 van de plaat gemerkt 4. </li></ol></li><li> Ga verder naar stap 4, Spotting on Agar. </li></ol> 4. Spotting op agar met behulp van een geautomatiseerde vloeibare spotting robot <ol><li> Verwijder de agarose glijbanen die zijn opgeslagen bij 4 ° C / N (vanaf stap 2.19) van hun bevochtigde steriele pipetdozen. </li><li> Indien nodig, trim de hoeken van het agarosemedium met een schoon scheermesje om ervoor te zorgen dat ze op de glijkamer passen. </li><li> Verwijder de diafragma van de beugel. Plaats de agarplaat voorzichtig in het inbouwvak van de podiumkamer. OPMERKING: Zorg ervoor dat de ofDe afname van de dia is consistent van experiment tot experiment. </li><li> Controleer of de klem in de bodem van de kamer staat. Als het schuin is, dan is de dia mogelijk niet volledig in het ingebouwde gebied. Plaats de nivelleringsruimte in de middenplaatpositie van de spottrobot. Deze afstandsbediening zorgt voor contact voor de nivelleringsschroeven, zodat de diafragment met de tips kan worden geliquideerd. </li><li> Plaats de borden op de tafel in volgorde van hun kwadrant. Platen 1, 2, 3 en 4 besteld van links naar rechts ( figuur 2B ). </li><li> Leg de tips omhoog zodat de binnenste 24 putjes C04 - F09 met tips in 4 lege tipkasten worden bezet. Een vijfde doos moet één tip in de C10 positie hebben, evenals 4 tips met hun uiteinden afgesneden in de A01, A12, H01 en H12 posities. Deze 4 snijpunten zorgen voor stabiliteit voor de tipplaatklem ( Figuur 2C en 2D ). </li><li> Verwijder de bovenklep van de slIde kamer mount. </li><li> Plaats de eerste tip punch in de startplaats van het robot control spotting programma. Dit moet een gat in de agarose steken, die later gebruikt wordt voor het aanpassen van de oorsprong coördinaat. Plaats plaat 1 op de vloeistofverwerkende robot om het eerste kwadrant te detecteren. Zorg ervoor dat de deksel is verwijderd en ga door met het spotting programma. </li><li> Controleer of alle plekken aanwezig zijn. Wacht ook ~ 30 s zodat ze kunnen drogen. Wanneer de plekken ongeveer 1 mm in diameter zijn, kan het programma doorgaan. Leeg de gebruikte tips in de biohazard container en plaats verse tips op de robot. Schakel plaat 1 uit voor de 2e kwadrantplaat. </li><li> Herhaal voor het derde kwadrant. En herhaal opnieuw voor het vierde kwadrant. </li><li> Wanneer de vlekken droog zijn, vervang de klep van de diafragma en draai het apparaat om. </li><li> Installeer de slangverbindingen met een luchtfilter. </li><li> Plaats een glazen glijbaan op de bovenkant van de kamer. OPMERKING: deze dia is cruciaal voor verminderingNg de warmteflux naar de agar en minimaliseert de vorming van condensatie op de objectieve afdekklepzijde van de kamer. Vergeet niet deze cover slip. Afhankelijk van de microscoopconfiguratie voorkomt deze afdekplaat verhitting van de verlichtingszijde om condensatie op de objectieve kant te veroorzaken. </li><li> Plaats een ventilator om de hete lucht op de objectieve kant van de kamer te blazen. Deze ventilator voorkomt dat condensatie op de afdekkap vormt. Zet de luchtstroom door de bubbler tot 10 mL / min. </li></ol> 5. ODELAY draaien op microscoop <ol><li> Voer het script &#39;ODELAY_Microscope_Control.m&#39; uit. </li><li> Klik op de &quot;Shutter&quot; om de verzonden lichtluiter te openen en vervolgens de &quot;Focus&quot; knop om de hoge camera snelheid te starten ( Afbeelding 3A , Rode pijlen). </li><li> Klik op &quot;Ga herkomst&quot; en verplaats het podium om het origineelmerk te vinden dat in de agar werd geslagen. </li><li> Ga dan een beetje naar rechts naarFocus op gistcellen die in gebied E07 zijn opgespoord. </li><li> Ga terug naar de origineelpunch en centreer het in het zichtveld. </li><li> Stel de oorsprong in op deze waarde door op de knop &quot;Set&quot; te drukken ( Figuur 3A , Blauwe pijlen). Ga nu naar positie H18 en focus met behulp van de hexadekschroef die dichtst bij die locatie ligt. Ga dan naar positie L07 en focus met behulp van de zeskroef die dichtst bij die locatie ligt. Ga dan naar positie E07 en focus met behulp van de hex-schroef dichtst bij die locatie. </li><li> Herhaal stap 5.5 tot en met 5.7, indien nodig, totdat die posities in focus blijven. </li><li> Controleer de focus in het midden en aan de randen op plekken E12, H12, L12. Stel het autofocusbereik in als de Z-waarden van de focus, zoals aangegeven door de Z-waarde, groter zijn dan ± het autofocusbereik ( bijv . Stel het autofocusbereik in op 60 μm de Z-waarde voor een middelpunt die groter is dan ± 40 μm). </li><li> Druk op de reset knop, aangezien dit de knop eigenschappen zal activeren en druk dan opODELAY ( Figuur 3A , Groene Pijlen). Kies de map om de gegevens op te slaan. Zorg ervoor dat er voldoende schijfruimte beschikbaar is. OPMERKING: De microscoop verzamelt gegevens gedurende 48 uur, of tot het programma is gesloten. </li></ol> 6. Verwerking ODELAY Data <ol><li> Open de ODELAY_IPT.exe of gebruik het script ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m script ( Figuur 3C ). </li><li> Bereid een * ODELAYExpDisc.xlsx Excel-spreadsheet op. </li><li> Noem het experiment in cel B1. </li><li> Selecteer de Image Directory waar de afbeelding bestanden E07 - H18 zijn opgeslagen. </li><li> Selecteer de Data Directory waar gegevens worden geschreven. </li><li> Schrijf de datum waarop het experiment is begonnen met cel B04. Gebruik het formaat MM / DD / JJJJ. </li><li> Schrijf de verdunningstijd in cel C04. Deze keer is ongeveer vijf minuten voordat de eerste afbeelding wordt verzameld. Gebruik het formaat HH: MMpm waar HH voor h is en MM is voor min. </li><li> Voeg in de stamnamen toe volgens tO de bronplaat (stap 3.1). Vanwege de manier waarop de stammen worden gespot, worden ze op de ODELAY-agarose-schuif gerangschikt. Cellen in de spreadsheet B31-B126 zijn de bronplaat, terwijl de cellen C31 - C126 de plaats in de ODELAY agarplaat zijn. </li><li> Druk dan op de &quot;Process Data&quot; knop en selecteer de * ODELAYExpDisc.xlsx die net werd voorbereid. </li><li> Wacht 16-24 uur afhankelijk van het computersysteem dat wordt gebruikt om gegevens te verwerken. </li><li> Wanneer de afbeeldingen worden verwerkt, verschijnt een map met de naam &quot;ODELAY Well Data&quot; en een bestand &quot;* _Index_ODELAYData.mat&quot;. Druk op de knop &#39;Gegevens laden&#39; en selecteer het bestand &#39;* _Index_ODELAYData.mat&#39; dat net is gegenereerd. Dit laadt de gegevensset die pas werd verwerkt. De &quot;*&quot; in de bestandsnaam wordt vermeld volgens de experimentnaam die in de Excel-spreadsheet is ingevoerd. </li><li> Nadat u de gegevens hebt geladen, controleert u het met behulp van de tijdbalk bovenaan, klik op een afbeelding vierkant om de groeikurven te zien fOf die plek, of vind een bron van belang in de lijst aan de linkerkant en laad vervolgens de afbeeldingen voor die lijst. </li><li> Genereer histogrammen van populatiegroei parameters door op de knop &quot;Viool Plot&quot; te drukken. Hierdoor wordt een grafiek weergegeven in figuur 4 of figuur 6 . </li></ol>

<ol><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li>
<li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mass%2C+density%2C+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li>
<li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scan-o-matic%3A+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li>
<li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+%27omics%27%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177(2014).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325(2012).</li>
<li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22ODELAY%21+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li>
<li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25225336">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4297649/">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ODELAY-analyse heeft verschillende kritische punten om reproduceerbare en betrouwbare fenotypische metingen te waarborgen. Het eerste kritieke punt is de consistente bereiding van de gistculturen. Er moet voorzichtig zijn om de gistcellen uit de logaritmische groei te oogsten. Als de culturen verzadigd zijn, zal hun populatie heterogeniteit worden verhoogd, die heterogeniteit kan veroorzaken die wordt veroorzaakt door genetische of milieu- ( bijvoorbeeld koolstofbron) factoren 11 . Het tweede kritieke punt is de consistente voorbereiding van de media. In het algemeen moet een groot volume van 10X stock media oplossing gegenereerd worden en vervolgens over de tijd gebruikt worden om de batcheffecten te minimaliseren. Het formuleren van media per gewicht, waar mogelijk, helpt bij het verbeteren van de consistentie van het medium met verloop van tijd door de dichtheid van agar te waarborgen en het totale watergehalte van de agarose kan nauwlettend worden gecontroleerd. Het derde kritieke punt omvat het minimaliseren of elimineren van elke mechanische vervorming van de agarose mijdia. Mechanische vervorming van de media komt meestal voor tijdens het scheiden van de agarose uit de glazen glijbanen. Zoals bij veel laboratoriumtechnieken is de oefening vereist om deze stap te beheersen. Variatie in vertragingstijd zoals afgebeeld in figuur 4 , is vaak gerelateerd aan één van de drie factoren: mechanische vervorming van het agarosemedium, variatie in de gevormde agar dikte of een instabiele lichtbron. Als het agarose medium varieert in Z-hoogte over het gespot array, kan de hoogtevariatie het bereik van de autofocus routine overspoelen, waardoor de initiële afbeeldingen iets flauw zijn. Controleer daarom de focushoogte op meerdere plekken in het midden en langs de randen van de gevlekt array om ervoor te zorgen dat de autofocus routine voldoende Z-bereik heeft om de focus te vinden. Gebruik indien nodig het autofocus paneel om het focusbereik te verhogen en het aantal focusings stappen te verhogen. Een derde mogelijke conditIonen die tot slechte focus kan leiden, is een instabiele of flikkerende lichtbron, die de berekende focuspunt voor een bepaalde Z-hoogte kan verstoren. De gloeilampen van wolfraamhalogen hebben de neiging om goed te flikkeren voordat de bollen uitbranden. Het effect van slechte focus wordt waargenomen in één voorbeeld waar de groeikurven tussen de eerste en tweede tijdspunten duiken ( Figuur 5A), terwijl de aangrenzende plek niet dezelfde dip heeft ( Figuur 5B ). In dit geval werd de arme focus conditie verlicht door de wolfraam halogeen lichtbron te vervangen. In de praktijk hebben de auteurs geconstateerd dat de gloeilampen om de flikker van 100W wolfraam halogeenlampen moeten verminderen, elke 500 uur of ongeveer elke 2 maanden vervangen worden wanneer de microscopen zwaar worden gebruikt. Om slechte focus problemen van een flikkerende lamp te vermijden, vervang de wolfraam halogeenlichtbron vaak of vervang de halogeenlamp met een diode lichtbron. EenVoorbeeld van een dataset die een lage variatie in verdubbelingstijden laat zien, evenals meer uniforme lagertijden is weergegeven in figuur 6 . Deze dataset werd genomen met een diodeverlichting, die tijdens de uitvoering van de autofocus stabielere verlichting geeft. Terwijl veel van de hier genoemde punten voor het optimaliseren van de media voorbereiding lijken te zijn, zijn de meeste grootschalige schermen niet goed met elkaar 8 , 11 in de literatuur. Daarom hebben we de voorbereiding van culturen en agarose media nauwkeurig beschreven, zodat meer reproduceerbare fenotypische schermen kunnen worden gegenereerd. De ODELAY assay is momenteel beperkt in doorvoer in vergelijking met pinning gebaseerde assays zoals synthetische genetische arrays of de Scan-O-Matic assay. Hoewel deze methoden het aantal getallen die worden gemeten, verhogen, hebben ze geen vermogen om individuele cellen te oplossen aNd kan dus de bevolkings heterogeniteit die we observeren in clonale giststammen niet meten. De oorsprong van deze populatie heterogeniteit wordt momenteel niet begrepen, maar de samenvoeging van technologie en berekening zoals hier wordt aangetoond biedt een kans om objectief de onderliggende cellulaire mechanismen 12 aan te pakken. De auteurs willen er rekening mee dat ODELAY momenteel alleen geoptimaliseerd is voor een specifiek microscoopmerk en lichaamstype. Het wijzigen van ODELAY voor andere microscoopsystemen is rechtdoor maar vereist kennis van de open source API 13 . Echter, zowel de API als de ODELAY scripts zijn geschreven om gemakkelijk aan te passen aan verschillende systemen en experimentele analyses. Terwijl ODELAY oorspronkelijk was ontwikkeld voor gist, hebben we het zonder veranderingen kunnen gebruiken om de groei van Mycobacterium smegmatis te waarnemen. Observatie van de andere kolonievormende micro-organismen isMogelijk met wijzigingen van de broncode geleverd 11 . Over het algemeen is ODELAY een krachtig en flexibel instrument voor het vergelijken van micro-organismen die onder verschillende milieuomstandigheden en genetische verstoringen worden geteeld.

Groei fenotypes van micro-organismen zijn een sterke indicator van hun onderliggende genetische geschiktheid voor een gegeven milieuconditie. Groei wordt klassiek gescheiden in 3 verschillende groeistelsels: lagfase, logfase en stationaire fase groei 1 . Elke groeifase kan verschillende aspecten van fitness tonen die afhankelijk zijn van diverse milieu- en genetische omstandigheden. Bijvoorbeeld, vertragingstijd of de tijdsduur die een organisme in lagfase besteedt voor het begin van de exponentiële groei kan duiden op het vermogen van een organisme om te reageren op gewijzigde milieuomstandigheden 2 . Verdubbelingstijd tijdens logfasegroei, de meest voorkomende metrieke van cellulaire fitness, onthult de algehele efficiëntie van het vermogen van een organisme om te verdelen door metaboliseren en gebruik maken van milieuproducten voor replicatie. Stationaire fase, waar de groei na logfase snel wordt verminderd, is een andere indicator van fitness, die regelmatig isWordt gebruikt als groeipuntpunt in spot-gebaseerde gistgroeitesten. Verscheidene gistgroeitesten zijn momenteel beschikbaar en beschouwd als standaardmethoden voor het evalueren van groeifenotypen in gist 3 , 4 , 5 . Deze analyses zijn in hoofdzaak gebaseerd op methoden voor het kweken van gist, ook niet op vaste stoffen of in vloeibare media. Op vaste media overdragen koloniepennen assays een klein aantal cellen op vaste agar met een pen en gistcellen mogen gedurende een bepaalde periode groeien. Kolonies worden vervolgens afgebeeld en hun maten worden vergeleken bij een eindpunt 6 . Deze kolonie-pinning-analyses zijn bewezen robuust en schaalbaar om genoom-brede schermen te genereren. Meer recent, zijn periodieke beeldvorming met behulp van flatbed scanners en Single Lens Reflex (SLR) camera&#39;s opgenomen in deze analyses om de groei van de kolonie op tijd op te nemen 7 , 8, 9 . Echter, de resolutie van deze apparaten voorkomt dat ze enkelvoudige cellen detecteren en bijgevolg observeert deze kolonie-pinningsassays niet de vertragingstijd direct en kan ze geen variatie zien tussen de afzonderlijke cellen die in kolonies groeien. Vloeibas gebaseerde groeieresultaten zijn ook toegepast om genoom-brede schermen 3 uit te voeren . Koppeling van een vloeibare groei-analyse met time-lapse microscopie onthulde heterogeniteit van de populatie in de verdubbelingstijd van genetisch identieke afzonderlijke cellen, die een belangrijk perspectief biedt voor het begrijpen van genetische regulering en milieu-aanpassing. Deze maatregel meet echter geen andere aspecten van groei zoals vertragingstijd en draagvermogen 10 . Hier presenteren we een methode om alle drie de groeifasen van kolonievormende micro-organismen op vaste media te karakteriseren met behulp van een test die we termen ODELAY 11 noemen. ODELAY bestaat uit utiliZing high-through time-lapse microscopie om afbeeldingen van enkele cellen op te nemen die groeien in kolonies op vaste media. Deze populatie van individuele cellen die in kolonies groeien onthult de onderliggende bevolkings heterogeniteit, die niet gedetecteerd wordt door andere minder gevoelige metingen, zoals eindpunten van eindpunten. We tonen de methode op gist, maar ODELAY kan toegepast worden op elk organisme dat contrast toont in heldere veldmicroscopie.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 case</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate flat bottom</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Hydra liquid handleing robot</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA objective</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB with image processing tool box</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY voor Matlab scripts en software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY voor mechanische tekeningen</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY voor maltekeningen</td></tr></tbody></table>

odelay: een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Groei fenotypes van micro-organismen zijn een sterke indicator van hun onderliggende genetische fitness en kunnen gescheiden worden in 3 groeistelsels: lagfase, logfase en stationaire fase. Elke groeifase kan verschillende aspecten van fitness tonen die verband houden met verschillende milieu- en genetische omstandigheden. Hoge resolutie en kwantitatieve metingen van alle 3 fasen van groei zijn over het algemeen moeilijk te verkrijgen. Hier presenteren wij een gedetailleerde methode om alle 3 groeifasen op vaste media te karakteriseren met behulp van een test, die de &#39;One-cell Doubling Evaluation of Living Array of Yeast&#39; (ODELAY) noemt. ODELAY kwantificeert groeifenotypen van afzonderlijke cellen die in kolonies groeien op vaste media met behulp van tijdverloopmicroscopie. Deze methode kan direct de populatie heterogeniteit met elke groeiparameter in genetisch identieke cellen waarnemen in kolonies, waarnemen. Deze populatie heterogeniteit biedt een uniek perspectief voor het begrijpen van genetische en epigenetische regulering, en reacties opGenetische en milieuverstoringen. Terwijl de ODELAY methode wordt aangetoond met behulp van gist, kan het worden gebruikt op elk colonievormend micro-organisme dat zichtbaar is door lichte veldmicroscopie.

<html> Voorbeeldbeelden van gistgroei in time-lapse microscopie worden getoond in Figuur 3B . Na het verwerken van de time-lapse beelden, wordt een representatieve gegevensverzameling van giststammen BY4741 en BY4742 getoond in Figuur 4 . In dit voorbeeld dataset is er zeer weinig variatie in verdubbelingstijd tussen verschillende posities op de plaat. Als het agarosemedium slecht wordt bereid, zou een duidelijke afwijking in zowel de verdubbelingstijd als de vertragingstijd duidelijk zijn in de vlekposities die samenvallen met het vervormde gebied van de agarosegel. Terwijl de verdubbelingstijden relatief uniform lijken te zijn, toont dit voorbeeld variaties in lagtijdmetingen. In figuur 6 is een consistente dataset weergegeven. In deze dataset zijn zowel vertragingstijd als verdubbelingstijd uniform. Bestanden / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Agar Mold Assembly. De componenten van de agarvorm worden in ( A ) getoond. Monteer de basis zoals afgebeeld in ( B ) en klem de basis vast met kleine bindklemmen. Plaats de langere staande stukjes in de holte van de basis ( C ) en plaats dan de glijbanen in de vorm zoals aangegeven in ( D ). Een zijaanzicht die de hoek van de matrijs en de oriëntatie van de vormscherf toont die nodig is voor consistente scheiding van de agar uit de glazen glijbaan ( E ). Let op de positie van de duim en voorvingeren, evenals de rechte lijn van de agar die van de dia ( F ) scheidt en let op de horizontale pijl. De scheidingslijn moet gelijkmatig verplaatsen in de richting van de verticale pijlen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> = &quot;Jove_content&quot; voor: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figuur 2: Sonication en Spotting Method. Soniceer de plaat in ijswater en gebruik een centrifuge emmerhouder om de plaat ( A ) te ondersteunen. Leg de borden van stap 3.8.1 uit voor het spotten op de agaroseplaat ( B ). Zorg ook voor de tips zodat de linkerste tipbox een punt heeft op positie C10 en dan vier andere tips met hun uiteinden afsnijden zodat ze de bordhouder ( C ) niet in de steek laten vallen. Plaats de overige tips in vier dozen, zodat de binnenste 24 tips posities bezet zijn ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3: Grafische gebruikersinterface ODELAY. Een schermafbeelding van de grafische gebruikersinterface voor &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Deze interface laat toezicht op de camera en voor het aanpassen van de instellingen voor microscoopverlichting voor epifluorescente en heldere veldmodi. Rode pijlen wijzen op de toetsen Focus en Transmitted die de camera activeren om snel afbeeldingen te verkrijgen en de overgedragen lichtluiter respectievelijk open te maken. Blauwe pijlen worden gebruikt om het podium voor de oorsprong te verplaatsen en instelt vervolgens de oorsprong met de knop &quot;Ga herkomst&quot; en &quot;Set&quot;. Groene pijlen wijzen naar &quot;Reset&quot; en &quot;ODELAY !!!&quot; Knoppen die ODELAY-beeldmodi terugzetten naar de huidige omstandigheden en start ODELAY-beeldverzameling. Time-lapse beelden van gistgroei op vast medium op 0, 3, 6 en 9 uur na het spotten ( B ). Een schermafbeelding van de grafische gebruikersinterface voor &quot;ODELAY_IPT.m&quot; of th<html> E ODELAY Image Processing Tool ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figuur 4: Voorbeeld ODELAY Output. Deze dataset vergelijkt de stammen BY4741 en BY4742 op YPD media. Dit cijfer is een voorbeeld van een goed voorbereide agarose dia; De instellingen voor autofocus zijn echter niet optimaal. De gegevens in elke kolom, van links naar rechts, zijn: de draagvermogen in log 2 van het koloniegebied; Verdubbelingstijd, gegeven in min; En vertragingstijd, gegeven in min. In dit voorbeeld verdubbelen de verdubbelingstijden van alle plekken op de agarglijbaan goed met een kleine hoeveelheid verhoogde verdubbelingstijd naar de kolom. De vertragingstijden verschillen echter aanzienlijk in deze dataset._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. <img alt="Figuur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figuur 5: Growth Curve Voorbeelden. Dit voorbeeld laat zien hoe slecht beginfocus de geschatte vertragingstijd (t lag ) kan verhogen ( A ), terwijl de aangrenzende positie een kortere vertragingstijd ( B ) laat zien. T d is de verdubbelingstijd in min, en t lag is de vertragingstijd in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figuur 6: Voorbeeld van goed uitgevoerde testexperiment. Een eVoorbeeld van de BY4742-stam getest na het vervangen van een wolfraam halogeenlamp met een diode verlichting en het garanderen dat de autofocus correct is ingesteld. Alle verdubbelingstijden lijken goed te overlappen en de vertragingstijden lijken consistent te zijn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Wij presenteren een methode voor het kwantificeren van groeifenotypes van individuele gistcellen, aangezien zij groeien in kolonies op vaste media met behulp van tijdlapse microscopie, één-celdubbelevaluatie van levende arrays van gist (ODELAY). Bevolkings heterogeniteit van genetisch identieke cellen die in kolonies groeien, kunnen direct worden waargenomen en gekwantificeerd.

ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Het algemene doel van ODELAY is om groeifenotypes van individuele cellen die uitgroeien tot kolonies op een high-throughput manier te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de microbiologie, genetica en systeembiologie, zoals de effecten van genetische perturbaties en geneesmiddelinteracties op de groeifenotypes van elke kolonievormende micro-organisme. Het belangrijkste voordeel van ODELAY is dat het de onderzoeker in staat stelt om populatieheterogeniteit tussen een groot aantal individuen direct waar te nemen en te kwantificeren.Reinig de acrylvormen met 70% ethanol en droog ze met geforceerde lucht voordat u de agarvorm assembleert. Er zijn drie bodemstukken en twee verticale stukken. Om de montage van de agarvorm te starten, neemt u de drie bodemstukken en assembleert u deze zodanig dat de twee identieke stukken het derde stuk inklemmen.Gebruik twee kleine binder clips om de basisstukken aan elke zijde vast te klemmen. Plaats de steunen in de mal en zorg ervoor dat de lasercurve correct is gepositioneerd. Plaats een gereinigde en gedroogde objectglasplaat op de mal en houd deze op zijn plaats terwijl u een tweede objectglasplaat aan de andere zijde plaatst.Klem de assemblage vast met een grotere klem. Klem beide objectglazen vast met grotere klemmen, waarbij u ervoor zorgt dat elke bovenste klem in contact staat met het objectglas en over het acryl heen valt. Voordat u de gemonteerde mal vult met gesmolten agar, dient u te controleren of de randen zijn afgedicht door ongeveer 70 µL gesmolten agarmedium langs de binnenzijde van de mal te pipetteren.Vul de mal zonder luchtbellen in te sluiten door de gesmolten agar langzaam langs de rand van de mal te pipetteren. Laat de mal na het vullen ongeveer 40-60 minuten afkoelen bij een omgevingstemperatuur van circa 23 °C. De volgende stap is het scheiden van de mal.Begin met het verwijderen van de onderste klem. Verwijder vervolgens het onderste deel van de mal, dat bestaat uit de drie tussengeplaatste stukken. Houd de objectglazen vast door ze samen te drukken en verwijder daarna voorzichtig de klemmen.Plaats de mal op de rand van het werkblad, zodanig dat de zijde van de mal met de blauwe stip naar boven is gericht. Plaats beide duimen onder het acryl en de wijsvingers aan de bovenzijde richting de binnenrand van de mal, en duw langzaam en voorzichtig met de duimen tegen de mal omhoog, alsof u de malafstandhouder om zijn onderrand draait. Oefen een constante, maar langzaam toenemende druk uit.Er zou een breuk en een luchtbel moeten verschijnen langs de lijn waar het bovenste glas de vormafstandhouder bedekt. Nadat de eerste breuklijn zichtbaar is, gaat u door met omhoog duwen met beide duimen en oefent u een constante druk uit. De agar zou zich nu van het glas moeten beginnen los te maken.Blijf de mal omhoog kantelen. Zodra het glas volledig loskomt, pakt u het vast en verwijdert u het geheel uit de mal. Verwijder vervolgens het andere malstuk met een vergelijkbare beweging om het stuk los te tillen zonder de agar te verschuiven.Plaats de objectglazen in een steriele tipdoos met een kleine hoeveelheid steriel water van hoge zuiverheid op de bodem. Sluit de doos en bewaar deze gedurende de nacht bij 4 °C voor gebruik de volgende dag. Start deze procedure door de stammen in een 96-wells plaat voor te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol.Gebruik een platenlezer om de optische dichtheid bij 600 nanometer van elke cultuur te meten. Gebruik vervolgens een geautomatiseerd verdunningsprotocol om de culturen in de plaat te verdunnen tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van ongeveer 0,1. Zodra het verdunningsprogramma is ingesteld, plaatst u de platen, buisjes en tips op het deck van de vloeistofbehandelingsrobot zoals aangegeven in de deckindeling.Klik op de afspeelknop om het verdunningsprogramma uit te voeren. Selecteer het juiste aantal tips van 50 µL en het juiste aantal tips van 300 µL. Wanneer de verdunning is voltooid, verwijdert u de verdunningsplaat uit de robot en cultureert u de plaat gedurende vijf tot zes uur bij 30 °C, waarbij de luchtvochtigheid wordt gehandhaafd om uitdroging van de plaat te voorkomen.Ongeveer één tot twee uur voordat de incubatie van de cultuurplaat is voltooid, schakelt u de incubatiekamers van de microscoop in en laat u deze equilibreren bij 30 °C. Verdun de cultuur voor een tweede maal tot een optische dichtheid bij 600 nm van 0,01 tot 0,02 met gebruik van hetzelfde geautomatiseerde verdunningsprotocol. Dek de verdunningsplaat af met een metalen vriesafdichting en soniceer 30 seconden in een ijsbad, waarbij de plaat drijft in ijswater.Label vier 96-wells platen met een vlakke bodem als één, twee, drie en vier. Breng 150 µL van elke gesoniceerde cultuur over van de verdunningsplaat naar de platen met een vlakke bodem volgens dit patroon. Wells A1 tot D6 naar wells C4 tot F9 van Plaat Eén.Wells A7 tot D12 in wells C4 tot F9 van plaat twee. Wells E1 tot H6 in wells C4 tot F9 van plaat drie. En wells E7 tot H12 in wells C4 tot F9 van plaat vier.Om deze procedure te starten, plaatst u de agarose-dia correct in de diahouder. Plaats vervolgens de 96-well platen met platte bodem op de tafel in de volgorde van hun kwadrant. Plaat één, twee, drie en vier van links naar rechts.Plaats tips in vier lege tipdozen, zodat de binnenste 24 putjes van elke tipdoos met tips zijn gevuld. Plaats in een vijfde doos een tip op positie C10 en tips waarvan het uiteinde is afgesneden op posities A1, A12, H1 en H12. Deze vier afgesneden tips zorgen voor stabiliteit voor de klem van de tipplaat.Plaats de eerste tip punch op de startpositie van het robotgestuurde spottingprogramma om een gat in de agarose te ponsen, dat later wordt gebruikt voor het uitlijnen van de oorsprongscoördinaat. Plaats plaat één op de vloeistofbehandelingsrobot om het eerste kwadrant te spotten. Verwijder het deksel en ga verder met het spottingprogramma.Controleer of alle spots aanwezig zijn. Gooi de gebruikte tips in de container voor biologisch gevaarlijk afval en plaats nieuwe tips op de robot. Wacht ongeveer 30 seconden totdat de spots zijn opgedroogd tot een diameter van ongeveer één millimeter en vervolg vervolgens het programma.Vervang plaat één door plaat twee en ga verder met het spotting-programma. Wanneer alle vier de kwadranten zijn gespot en de spots droog zijn, plaatst u de afdekking van de objectglaskamer terug en draait u het apparaat om. Plaats een objectglas op de bovenzijde van de objectglaskamer.Plaats eerst de objectglaskamer in de microscoop. Time-lapse microscopie wordt uitgevoerd door middel van een speciaal ontworpen script. Klik op de sluiter om de doorlaatlichtsluiter te openen en vervolgens op de focusknop om de hoge camerasnelheid te starten.Klik op "Go Origin" en verplaats de tafel omHet in de agar geslagen nulpuntsmerk te vinden, en beweeg vervolgens iets naar rechts om scherp te stellen op de cellen die in gebied E7 zijn gespot. Beweeg terug naar het nulpuntsmerk en centreer dit in het gezichtsveld. Stel het nulpunt in op deze waarde door op de knop "Set" te drukken. Verplaats naar positie H18 en stel scherp met de inbusbout die het dichtst bij die locatie ligt.Ga vervolgens naar positie L7 en stel de focus in met de inbusschroef die zich het dichtst bij die locatie bevindt. Ga tot slot naar positie E7 en stel de focus in met de inbusschroef die het dichtst bij die locatie ligt. Controleer de focus in het centrum en aan de randen op de punten E12, H12 en L12; pas het autofocusbereik aan als de focus z-waarden, zoals aangegeven door de z-waarde, groter zijn dan plus of minus het autofocusbereik.Druk op de knop "Reset" en druk vervolgens op ODELAY. Kies de map waarin de gegevens moeten worden opgeslagen. De microscoop verzamelt 48 uur lang gegevens of tot het programma wordt gesloten.Deze representatieve timelapse-beelden tonen gistcellen die groeien op een vast medium op nul uur, drie uur, zes uur en negen uur na het spotten. Hier wordt een representatieve dataset getoond waarin twee giststammen worden vergeleken na verwerking van de timelapse-beelden. De relatief uniforme verdubbelingstijden weerspiegelen de goed geprepareerde agarose-slide, hoewel de lagg-tijden aanzienlijk variëren door autofocus-instellingen die niet optimaal zijn.Hier wordt een consistentere dataset getoond waarin alle verdubbelingstijden goed lijken te overlappen en de lag-tijden consistent lijken te zijn. Eenmaal beheerst kan de opstelling van ODELAY in drie tot vier uur worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd. De meest kritieke stappen voor reproduceerbare ODELAY-metingen zijn het consistent bereiden van de media en het vermijden van mechanische vervorming van de media bij het scheiden van de objectglaasjes.ODELAY is een zeer gevoelige assay. Zo kunnen hiermee groeidefecten in temperatuurgevoelige giststammen bij kamertemperatuur worden waargenomen, terwijl veelgebruikte spot-assays het kweken van gist bij 37 °C vereisen om een groeidefect aan te tonen. Hoewel ODELAY is ontwikkeld voor gist, is de methode toepasbaar op elk kolonievormend organisme, inclusief pathogenen, om een breed scala aan omgevings- en genetische condities te onderzoeken en zo het gedrag van micro-organismen te begrijpen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ODELAY uitvoert om groeifenotypes te meten van eencellige micro-organismen die kolonies vormen op vaste media. Vergeet niet dat werken met micro-organismen gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen die geschikt zijn voor de bestudeerde organismen.

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een complementaire reeks van experimentele en computationele methoden voor het schatten van microbiële cultuur fitnesses. QFA schat het effect van genetische mutaties, drugs of andere toegepaste behandelingen microbe groei. Experimenten scaling van gerichte analyse van de afzonderlijke culturen tot duizenden parallelle culturen kan worden ontworpen.

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.

Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Leer de ODELAY-methode voor grootschalige kwantificering van gistgroei met tijdverloopmicroscopie. Deze techniek maakt directe observatie en kwantificering van populatieheterogeniteit mogelijk.

ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

Meer video's verkennen