Name: Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Leer immunofluorescentie en immunoprecipitatie voor eiwit-eiwitinteracties in autophagy-onderzoek bij zoogdieren. Deze methoden onthullen nieuwe componenten van cellulaire signaalroutes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de wetenschappelijke en technologische onderzoek Raad van Turkije (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, de Sabanci Universiteit. SEB en NMK worden ondersteund door een TUBITAK BIDEB 2211 beurs voor Ph.D. studies.

1. immunofluorescentie <ol><li>HEK293T handhaven menselijke embryonale nier cellen in DMEM hoge glucose medium en N2A muis neuroblast cellen in DMEM lage glucose medium, een 5% CO 2-bevochtigde incubator bij 37 ° C. Aanvulling van de voedingsbodems met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderen (FBS) serum, antibiotica (50 U/mL penicilline, 50 µg Mo/mL streptomycine), en L-glutamine (2 mM).</li>
	<li>Loskoppelen de cellen met behulp van 0,25% trypsine. Eerst Verwijder het medium van de cultuur van de cel dan de cellen met 10 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wassen en incubeer met 1 mL trypsine bij 37 ° C gedurende 5 min. Inactivate trypsine door toevoeging van 2 mL DMEM middellange.</li>
	<li>Wassen de plaat goed door pipetteren. 10 µL van cell oplossing verwijderen en meng dit met 10 µL van trypan blauw. Het aantal levende cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Zowel HEK293T en N2A zijn aanhangend cellijnen, echter HEK293T cellen loskoppelen van de plaat gemakkelijk. Daarom, als u werkt met cellijn van HEK293T, jas de coverslides met steriele gefilterd 0,01% poly-L-lysine vóór het zaaien van de cellen.
	<ol><li>Plaats steriele coverslides in een 10 cm petrischaal. Voeg de juiste hoeveelheid poly-L-lysine oplossing op elke coverslide. Incubeer de coverslides met poly-L-lysine oplossing voor 10 min.</li>
		<li>Verwijderen de poly-L-lysine oplossing. 
		Opmerking: Poly-L-lysine is opnieuw bruikbaar; het is optioneel om te verzamelen en opnieuw gebruiken voor verdere experimenten. Aangezien poly-L-lysine giftig is, wachten totdat alle van de oplossing op de coverslides volledig is verdampt, en herstel daarna de poly-L-lysine.</li>
		<li>Wassen van de coverslides met steriele PBS.</li>
	</ol></li> <li>Voeg 1 mL DMEM in elk putje van de plaat van een 12-well. Plaatsen van een coverslide in elk putje.</li>
	<li>Zaad 20.000 cellen per putje, druppel voor druppel terwijl het schudden van de plaat op hetzelfde moment voor een homogene verdeling van de cellen in de coverslides. Houden van cellen in de CO-2 incubator bij 37 ° C en de drug toe te voegen zodat de totale incubatietijd 48 uur niet overschrijdt, dat wil zeggen, voor 3 h Torin behandeling, de drug toevoegen op 45 h post zaaien.
	<ol><li>Voor RACK1-LC3 interactie studies, Torin 1 rapamycin en honger werden gebruikt als autophagy inductoren. Cellen werden ge¨ uncubeerd met Torin 1 3 h (250 nM-eindconcentratie); met rapamycin voor 16 h (200 nM-eindconcentratie); en met Earle &#39; s evenwichtig zout oplossing (EBSS) voor 2 h om de cellen verhongeren. 
		Opmerking: Incubation in DMEM met 10% FBS werd gebruikt als besturingselement voorwaarde.</li>
	</ol></li> <li>Na 48u van totale incubatietijd, verwijder het medium op de coverslides en was ze met 1 mL PBS.</li>
	<li>Om op te lossen van de cellen, Incubeer de cellen met 1 mL ijs koud steriele gefilterde 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS (pH 7.4), gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder enige agitatie. 
	Aangezien PFA gevoelig voor licht is, houden (belangrijk) de plaat in het donker tijdens de incubatietijd; die betrekking hebben op de plaat met aluminiumfolie kan helpen. Bovendien PFA is giftig, dus, werken in een zuurkast terwijl de vaststelling van de cellen. 
	Opmerking: Houd er rekening mee dat de fixatie stap in immunofluorescentie experimenten moet worden geoptimaliseerd, als specifieke antilichamen kunnen werken beste met behulp van verschillende fixatie agenten en voorwaarden.</li>
	<li>Na 20 min van PFA incubatie, verwijdert u eerst de PFA-oplossing op de coverslides en daarna wassen elk monster 3 keer met 1 mL steriele gefilterde PBS. Op deze stap, (belangrijk) was de putjes één voor één om niet te laat ze drogen. Vermijd drogen want het zal met de daaropvolgende reacties van de cellen interfereren, de morfologie van de cel wijzigen en verhogen van niet-specifieke signalen.</li>
	<li>Wanneer de wash voltooid is, blijven de monsters in 1 mL PBS op ice.</li>
	<li>Bereid de blokkerende oplossing: PBS met 0,1% boviene serumalbumine (BSA) en 0,1% saponine.</li>
	<li>Is een 6-well afdekplaat met paraffine film. Ervoor zorgen dat de bodem plaat glad na de dekking van de film paraffine is. De 6-well-plate label.</li>
	<li>Met pincet, overdracht de coverslides van de 12-Wells-platen aan de 6-Wells-platen bedekt met paraffine film.</li>
	<li>Negeren van de PBS op coverslides en voeg 100 µL van het blokkeren van de oplossing op elk coverslide voor permeabilization. Incubeer de monsters op ijs voor 30 min.</li>
	<li>Bereiden het primaire antilichaam in het blokkeren van de oplossing. Voorafgaand aan de experimenten, het optimaliseren van de antilichaam-verdunningen om te definiëren van de beste werken concentraties voor kleuring. 
	Opmerking: bijvoorbeeld LC3 antilichaam wordt gebruikt bij een verdunning 1:100 oplossing tijdelijk blokkeren.</li>
	<li>Na de 30 min incubatie, negeren de blokkerende oplossing en de monsters zachtjes met 1 mL PBS eens wassen.</li>
	<li>Voeg 100 µL van primair antilichaam oplossing voor elke coverslide. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, in een roteerapparaat. 
	Opmerking: Incubatietijd met het primaire antilichaam moet worden geoptimaliseerd. Afhankelijk van het antilichaam, kan een overnachting incubatie bij 4 ° C wenselijk zijn. Het is het beste om te broeden op een shaker zachtjes (100 rotaties/min) te gelijkelijk verdelen het antilichaam op de coverslides.</li>
	<li>Na incubatie met het primaire antilichaam, wassen van monsters individueel, 3 keer met 1 mL PBS.</li>
	<li>Voorbereiden 1:500 secundair antilichaam blokkeren oplossing (optimalisaties van verdunningen van het secundaire antilichaam kunnen nodig zijn). Hier, anti-konijn IgG Alexa Fluor 568 werd gebruikt als een secundair antilichaam anti-konijn.
	<ol><li>Broeden de monsters met de 100 µL van secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Aangezien de fluorophore-geëtiketteerden secundaire antilichamen zijn gevoelig voor licht, (belangrijke) Bewaar deze oplossing in het donker. Leg de monsters in het donker tijdens en na de incubatie van secundair antilichaam.</li>
	</ol></li> <li>Na de incubatie van secundair antilichaam, wassen de plaat 3 keer met PBS. 
	Opmerking: Die zijn gebaseerd op ervaring, sommige antilichamen hebben hoge achtergrond signalen die niet kunnen worden uitgesloten door de PBS wast. Als omgaan met dergelijke een antilichaam, na stap 1.21, kan het bijhouden van de monsters in PBS bij 4 ° C gedurende 6 uur helpen.
	<ol><li>Indien nodig, vlek de cellen met een DNA-bindende kleurstof, zoals Hoechst, ter gelegenheid van de kernen.</li>
	</ol></li> <li>Om vlekken van meer dan één eiwit, gelden dezelfde procedure vanaf stap 1.16 voor de tweede proteïne.
	<ol><li>Zorg ervoor dat er geen soorten reactiviteit tussen de antilichamen is bij het uitvoeren van de kleuring met meer dan één antilichaam (b.v., gebruik muis en konijn antilichamen). 
		Opmerking: Hier, RACK1 is gekleurd als de tweede eiwit met behulp van anti-RACK1 primaire antilichamen en anti-muis IgG Alexa Fluor 488 secundaire antilichamen met behulp van dezelfde concentraties bovengenoemde.</li>
	</ol></li> <li>Bereid de montage oplossing: 50% Glycerol in 1 x PBS. Filter door een filter 22 µm.</li>
	<li>Veeg de dia's met ethanol met behulp van een pluisvrije doekje en 10 µL montage oplossing toevoegen aan elke dia. Met behulp van een pincet, plaats de coverslides op elk dropso dat de kant met de cellen in direct contact met het medium van de montage is. Verwijderen van de overtollige montage oplossing voorzichtig met behulp van pluisvrije doekjes.</li>
	<li>Verzegelen de coverslides met een doorzichtige nagellak. Eerste, het stabiliseren van de coverslides door toevoeging van druppels nagellak op de 4 hoeken en vervolgens zegel ze volledig.</li>
	<li>Analyseren van de monsters onder een TL of confocal microscoop zo spoedig mogelijk, omdat het fluorescent signaal kan na een paar uur bleekmiddel.</li>
</ol> 2. Immunoprecipitation <ol><li>Detach and graaf de cellen als in stap 1.2 en 1.3 beschreven.</li>
	<li>Als werken met HEK293T cellen, seed 4 miljoen cellen voor elke voorwaarde in petrischalen van 15 cm. Als werken met N2A cellen, seed 5 miljoen cellen in petrischalen van 15 cm. Incubeer de cellen in een CO 2 incubator bij 37 ° C tot het einde van het experiment.</li>
	<li>Behandelen de cellen met de desbetreffende drugs of de voorwaarden voor een bepaalde duur, zodat de totale incubatietijd van de cellen niet meer dan 48 h. 
	Opmerking: Voor de immunoprecipitation proeven in deze studie, werden cellen behandeld gedurende 3 uur met Torin 1 (250 nM), 16 h met rapamycin (200 nM), en 2 h met EBSS. DMEM met 10% FBS werd toegevoegd aan de cellen als het besturingselement.</li>
	<li>Na 48 h van totale incubatietijd, verwijder het medium en het oogsten van de cellen. Aangezien HEK293T cellen gemakkelijk van de plaat loskoppelen, kan wassen van de plaat met ijs koud PBS toereikend zijn voor de oogst. Echter N2A cellen meer resistent zijn tegen detachement; cel schrapers gebruiken om te helpen met het oogsten van de cellen.
	<ol><li>Verzamelen van alle cellen in de buizen microcentrifuge.</li>
	</ol></li> <li>Centrifuge monsters bij 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Discard het supernatant en wassen de pellet met 1 mL PBS door schorsing van het opnieuw door pipetteren.</li>
	<li>Centrifuge Herhaalstap, maar op de hoogste snelheid van de centrifuge bij 4 ° C gedurende 15 min. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Bereiden Radio Immuno-neerslag Assay (RIPA) buffer voordat het experiment. 
	Opmerking: Er zijn 3 soorten RIPA buffer; kiezen op basis van de intensiteit van de interactie van de eiwitten wordt onderzocht (zie onderstaande formules).
	<ol><li>Als er een sterke eiwit-eiwit interactie, kiest u de regelmatige RIPA buffer.</li>
		<li>Als de interactie zwak is, kiest u milde RIPA of mildere RIPA. 
		Opmerking: De recepten van deze buffers zijn in de volgende stappen. Alle buffers die worden gebruikt in immunoprecipitation tests moeten worden aangevuld met proteaseinhibitors.
		<ol><li>Bereiden regelmatig RIPA Buffer met 1% NP-40 150 mM NaCl, 0,5% natrium deoxycholate en 0,1% natrium dodecyl sulfaat 50 mM Tris pH 8.</li>
			<li>Bereiden milde RIPA Buffer met 1% NP-40 150 mM NaCl en 0,25% natrium deoxycholate in 50 mM Tris pH 7.5.</li>
			<li>Bereiden de mildere RIPA Buffer met 1% Triton-X 100, 137 mM NaCl, 1% glycerol en 1 mM natrium orthovanadate in 50 mM Tris pH 7.4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Na het kiezen van de juiste RIPA buffer, aanvulling van de buffer met proteaseinhibitors (RIPA +). Vervolgens lyse de cellen met 3 x het volume van de cel pellet in RIPA +.</li>
	<li>Vortex de schorsing voor 15 s. houden op ijs voor 5 min. vortex en slagroom 5 keer herhaal en centrifugeer dan de monsters bij 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Overbrengen in het supernatant een schone microcentrifuge buis en centrifuge restant cel puin te verwijderen. Supernatant overbrengen in een schone buis.</li>
	<li>Verdun de eiwit lysates 1:50 en bereiden een 96-wells-plaat met blanco en normen. De monsters verdund.
	<ol><li>Mix monsters met Bradford oplossing 1:20. Incubeer gedurende 15 min. in het donker.</li>
		<li>Meet de optische dichtheid bij 595 nm golflengte. Berekenen van de eiwitconcentratie extinctie waarden voor elk monster gebruiken.</li>
	</ol></li> <li>De dag vóór het oogsten van de cellen, eiwit A Plus kralen koppelen aan antilichamen die specifiek voor de proteïne van belang zijn.
	<ol><li>De rand van een tip van de 200 µL met behulp van schaar te knippen en 25 µL van de kraal drijfmest te gebruiken voor elke voorwaarde.</li>
		<li>Wassen de kralen een keer met 1 mL PBS, eenmaal met 1 mL RIPA buffer en één keer met 1 mL RIPA +. Uitvoeren van de stappen wassen op 3300 x g, 4 ° C voor 1 min.</li>
		<li>Na de laatste wash, voeg 300 µL van RIPA + op de parels en toevoegen van 1,5 µg antilichaam dat specifiek is voor het eiwit te worden neergehaald.</li>
		<li>Broeden de buizen 's nachts bij 4 ° C op een rotator (20 rotaties/min). 
		Opmerking: Hier, ATG5 was immunoprecipitated met behulp van antilichamen van specifieke anti-ATG5.</li>
	</ol></li> <li>Na de overnachting incubatie van kralen met het antilichaam, de kralen keer met PBS, eenmaal met RIPA en eenmaal met RIPA + wassen zoals beschreven in stap 2.12.2.</li>
	<li>Toevoegen 2 mg eiwit lysate op de parels voor elke voorwaarde en het totale volume aan 300 µL met RIPA + buffer/buis te voltooien. Incubeer de buizen 's nachts op een rotator bij 4 ° C.</li>
	<li>Na de incubatie, wassen de parels zoals hiervoor is beschreven (stap 2.12.2).
	<ol><li>Na de laatste wash, een kleinere Pipetteer tip te gebruiken om alle de bovendrijvende vloeistof zonder het aanraken van de kralen.</li>
		<li>Voeg toe 10 µL van 3 x laden kleurstof: 6% SDS, 30% Glycerol, β-Mercaptoethanol 16% en 0,1% Bromophenol blauw in 1M Tris-HCl pH 6.8.</li>
	</ol></li> <li>De input controles met behulp van ten minste 100 µg eiwit lysate voor elke voorwaarde voor te bereiden. Egaliseren van de volumes van de monster met behulp van water en voeg de juiste hoeveelheid 3 x laden kleurstof toe.</li>
	<li>Kook monsters bij 95 ° C gedurende 10 min. 
	Opmerking: Meestal wanneer het koken van de monsters, de doppen van de buizen spontaan kunnen openen en monsters gaan verloren. Dit voorkomen door het houden van de doppen afgesloten met een specifieke GLB blocker.</li>
	<li>Spin de monsters en de belasting op SDS-pagina gelen te scheiden van de proteïnen volgens hun grootte met behulp van standaardprotocollen. 
	Opmerking: In deze studie over RACK1 en ATG5, monsters werden doorlopen 12% polyacrylamide gels op 80 V voor 30 min, en vervolgens op 120 V voor ongeveer 90 min. Echter, voor de kleinere proteïnen zoals LC3, met behulp van 15% polyacrylamide gels is geschikter.</li>
	<li>Als de gel uitgevoerd is voltooid, overbrengen in de eiwitten nitrocellulose of PVDF membranen met behulp van beide methoden voor natte of semi-droge overdracht. Dan, het blokkeren van de membranen van incubatie in 5% non-fat melk in PBS met 0,05% Tween-20 (PBST) bij kamertemperatuur voor 1 h. Wash membranen 3 keer met PBST voor 5 min.</li>
	<li>Laat de membranen met primaire antilichamen bij werken concentraties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. Gebruik voor primair antilichaam verdunningen, BSA met rode oplossingen (5% BSA Cohn V-Fractie, natriumazide 0.02% in PBST, pH 7.5; fenol red toegevoegd als een pH-markering toevoegen) om het hergebruik van antilichamen. 
	Opmerking: Verdun bijvoorbeeld ATG5 antilichaam 2.000 x in de rode oplossing.
	<ol><li>Aan het eind van de incubatietijd, wassen de membranen 3 keer met PBST.</li>
	</ol></li> <li>Broeden de membranen met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen die werden opgesteld in 5% non-fat melk oplossing (hier, anti-konijn IgG bij 1:10.000 werd gebruikt). Daarna wassen de membranen 3 x met PBST voor 5 min.</li>
	<li>Maken de ECL-oplossing: 25 mM luminol, 9 mM coumarinezuur, 3 x 10 -4% H 2 O 2 in 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Gebruik verse H 2 O 2 voor elk experiment. 
	Opmerking: De reactie begint na H 2 O 2 toevoeging en het blijft gedurende ongeveer 20 minuten.
	<ol><li>Broeden de membranen en X-ray films voor 20 min in ECL. Ontwikkelen en te corrigeren in een donkere kamer.</li>
	</ol></li> <li>Om te controleren de co-immunoprecipitation van eiwitten met sluiten of overlappende molecuulgewichten, kan het nodig te strippen van de antistoffen af de membranen door de membranen bij 60 ° C gedurende 30 minuten in de stripper buffer aan het broeden zijn: (25 mM Tris-HCl pH 2 en 1% SDS).</li>
	Herhaal stap 2,20 tot en met 2.23 <li>om te controleren voor co-immunoprecipitation met verschillende antilichamen. Bijvoorbeeld werd na ATG5 detectie en strippen van de membranen, RACK1 eiwit getest op de dezelfde membranen met behulp van een anti-RACK1 primair antilichaam (1:1, 000) en secundaire antilichamen (1:10, 000). Β-actine werd gebruikt als het besturingselement laden; en IgG signaal werd gebruikt als het besturingselement laden voor immunoprecipitated monsters.</li>
</ol>

<ol><li>Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+pathological+significance+of+the+molecular+cross-talk+between+autophagy+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis.</a> Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).</li>
<li>Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIR376A+is+a+regulator+of+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy.</a> PLoS One. 8, e82556(2013).</li>
<li>Itah, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+cavitation+kills+prostate+cells+and+ablates+benign+prostatic+hyperplasia+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue.</a> Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).</li>
<li>Gozuacik, D., Kimchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+cell+death+and+tumor+suppressor+mechanism%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism).</a> Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).</li>
<li>Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+IBMPFD-related+P97%2FVCP+mutation+with+differential+binding+pattern+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).</li>
<li>Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-related+gene%2C+TdAtg8%2C+in+wild+emmer+wheat+plays+a+role+in+drought+and+osmotic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response.</a> Planta. 236, 1081-1092 (2012).</li>
<li>Longatti, A., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+trafficking+and+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Vesicular trafficking and autophagosome formation.</a> Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).</li>
<li>Erbil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RACK1+Is+an+Interaction+Partner+of+ATG5+and+a+Novel+Regulator+of+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy.</a> J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).</li>
<li>Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+use+of+nanoparticles+as+nucleic+acid+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers.</a> J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).</li>
<li>Uetz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+protein-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 403, 623-627 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Immunoprecipitation en immunofluorescentie technieken zijn cruciaal voor de studie van eiwit-eiwitinteractie. Hoewel deze twee technieken vaak gebruikt worden en gevestigde, verscheidene criteria moeten worden overwogen om te definiëren van de kwaliteit van de experimenten tijdens het gebruik van deze technieken.
Eerste, primaire antilichamen die worden gebruikt in deze tests moet specifiek voor de proteïnen van belang. Om hiervoor te zorgen, shRNA knockdowns of knock-out cellen gebruiken om t...

Macroautophagy (autophagy, hierin) is een mechanisme van cellulaire spanning die wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van bulk cytoplasma, eiwitten en organellen in dubbele membraan blaasjes autophagic blaasjes genoemd. Door de fusie van de buitenste laag van het dubbele membraan, autophagic blaasjes en hun lading zijn geleverd aan lysosomen en daarin1gedegradeerd. Autophagy treedt op basale laag in alle soorten van de cellen en alle organismen, homeostatische functies zoals de aantasting van het eiwit en organel (b.v., mitochondriën) omzet. Onder omstandigheden leiden tot cellulaire stress, zoals honger, autophagy is snel upregulated en maakt de cel energie niveaus en fundamentele metabolisme1,2,3te handhaven.
Ongeveer 30 autophagy genen hebben gekloond uit de gist en hun eiwitproducten bleken een rol te spelen in verschillende stadia van het autophagic proces, inclusief vesikel nucleatie, uitbreiding, blaasje fusion laat endosome/lysosoom en aantasting van de lading 4 , 5. Orthologs van de meerderheid van deze genen zijn geïdentificeerd en studies in verschillende organismen bevestigd behoud van hun cellulaire functies6. Studies in de afgelopen tien jaar is gebleken dat verschillende autophagy-gerelateerde eiwitcomplexen en eiwit-eiwitinteractie bestaan en dat ze autophagy trajecten in een ingewikkelde en gecontroleerde manier regeren. Kruispunten, back-ups en feedback feedforward mechanismen bestaan, en ze laten de cel te coördineren autophagy met andere verwante evenementen (zoals vesiculaire secretie, lysosoom biogenese, sortering en transport van de endosomal7, enz.) In een onbevooroordeelde gist-twee hybride-scherm met behulp van de autophagy proteïne ATG5 als aas, (ATG5 is een belangrijke autophagy eiwitten die betrokken zijn bij het E2-achtige conjugating systeem dat LC3 lipidation in honger bemiddelt geïnduceerde autophagy), hebben wij vastgesteld Receptor geactiveerd C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) als een sterke interactor en een roman autophagy onderdeel8. Nog belangrijker is, is het scherm laat zien dat de ATG5-RACK1-interactie onmisbaar voor autophagy inductie door klassieke autophagy inductoren (d.w.z., honger en mTOR remming was).
Immunofluorescentie gebaseerde methoden worden vaak gebruikt om te controleren van eiwit-eiwitinteractie. Deze technieken zijn voornamelijk gebaseerd op antilichaam en helpen te visualiseren interacties en cellulaire lokalisaties te bevestigen. Bij deze techniek, TL tag geconjugeerde antilichamen die specifiek zijn voor proteïnen van belang zijn in het algemeen gebruikt voor een specifieke kleuring. Elke proteïne kan worden aangeduid met de antilichamen, gekoppeld aan verschillende fluorescente kleurstoffen. Een overlapping in het signaal wanneer afbeeldingen worden samengevoegd met eiwit-specifieke antilichamen, en geeft aan dat de co lokalisatie van eiwitten onder confocale microscopie. De techniek is van toepassing op cellen of zelfs weefsels. Immunofluorescentie technieken geven aanwijzingen over de dynamiek van de interactie, en helpen bij het identificeren van de grootte en de distributie van eiwitcomplexen, terwijl het bijhouden van algemene wijzigingen in cellulaire morfologie onder verschillende omstandigheden9. Immunoprecipitation is een andere veel gebruikte antilichaam gebaseerde techniek die het mogelijk voor de analyse van de wisselwerking maakt tussen gegeven eiwitten10. Met behulp van deze techniek, eiwitten van belang zijn geïsoleerde van cellen of weefsel wordt geëxtraheerd met behulp van specifieke antilichamen, resulterend in de precipitatie van de eiwitten die in een complex of in contact met een proteïne van belang. Co-immunoprecipitation, waar de eiwitten en zijn mede interactor worden gedetecteerd, blijkt niet alleen de interactie tussen de twee eiwitten, maar kan meten de sterkte van interactie onder verschillende omstandigheden11.
Dit protocol beschrijft in detail belangrijke technieken die werden gebruikt om te bevestigen en karakteriseren van ATG5-RACK1 en RACK1-LC3 interactie. De focus ligt op immunofluorescentie en immunoprecipitation technieken, met nadruk van kritische stappen en valkuilen voor autophagy onderzoek, evenals het oplossen van problemen met suggesties.

<table><tbody><tr><td>Trypsin EDTA Solution A</td><td>Biological Industries </td><td>BI03-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GE Healthcare</td><td>SH-30256.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (hoge glucose)</td><td>Sigma </td><td>5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (lage glucose)</td><td>Sigma</td><td>5546</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>coverslides</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSL-103</td><td></td></tr><tr><td>slides</td><td>Isolab</td><td>I.075.02.005</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma </td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Torin</td><td>Tocris</td><td>4247</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>VWRSAD2650</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Biological Industries </td><td>BI02-010-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>15812-7</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;A4503</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>LC3 Antibody</td><td>Sigma</td><td>L7543</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td><td>&nbsp;Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>RACK1 Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&nbsp;sc-17754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp;Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Applichem</td><td>A16694.0250</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Applichem</td><td>A9242.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Biochemika</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X </td><td>Applichem</td><td>4975</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>ATG5 Antibody</td><td>Sigma</td><td>A0856</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Applichem</td><td>A4453</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol </td><td>Applichem</td><td>A1108.0250</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue </td><td>Applichem</td><td>A3640.0005</td><td></td></tr><tr><td>Non-Fat milk</td><td>Applichem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Riedel de Haen</td><td>13412</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red </td><td>Sigma</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit IgG, HRP conjugated</td><td>Jackson Immuno. </td><td>1110305144</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Coumercic Acid</td><td>Sigma</td><td>C9008</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Merck</td><td>K35522500604</td><td></td></tr><tr><td>anti mouse IgG, HRP conjugated</td><td>Jackson Immuno.</td><td>115035003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin Antibody</td><td>Sigma </td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;R0395</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Agarose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2001</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum </td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin solution</td><td>Biological Industries </td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Biological Industries </td><td>BI03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Solution</td><td>Sigma</td><td>6916</td><td></td></tr><tr><td>Nitocellulose membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>A10083108</td><td></td></tr><tr><td>X-ray Films</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19289</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

studie van eiwit-eiwitinteractie in autophagy onderzoek

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Eiwit-eiwitinteractie zijn belangrijk voor het begrip cellulaire signalering cascades en herkenbare roman traject onderdelen en eiwit dynamiek. De meerderheid van cellulaire activiteiten vereist fysieke interactie tussen proteïnen. Te analyseren en kaart van deze interacties, werden verschillende experimentele technieken evenals bioinformatica tools ontwikkeld. Autophagy is een mobiele recycling mechanisme waarmee de cellen om te gaan met andere stressoren, met inbegrip van nutriënten ontbering, chemicaliën en hypoxie. Om signalering autophagy-gebeurtenissen beter te begrijpen en te ontdekken van nieuwe factoren die regelen van eiwitcomplexen in autophagy, trad we eiwit-eiwit interactie schermen. Validatie van de resultaten van deze screening vereist het gebruik van immunofluorescentie en immunoprecipitation technieken. In dit systeem, specifieke autophagy-gerelateerde eiwit-eiwitinteractie die we ontdekt werden getest in Neuro2A (N2A) en HEK293T cellijnen. Details over de technische procedures die zijn uitgelegd in deze gevisualiseerde experiment papier.

In Figuur 1 een voorbeeld van een mede-localisatie wordt resultaat verkregen met behulp van dit protocol weergegeven. Een figuur uit onze recente papier wordt8gepresenteerd. Hier, werd endogene RACK1 eiwit gekleurd in het groen, terwijl endogene LC3 werd gekleurd in rood. De gele punten die worden waargenomen in de samengevoegde afbeeldingen geven aan sites van overlap tussen de groene en rode signalen. Dus vertegenwoordigen de gele stippen de gedeeltelijke co lokalis...

Gepresenteerd hier zijn twee antilichaam gebaseerde eiwit-eiwit interactie onderzoekstechnieken: immunofluorescentie en immunoprecipitation. Deze technieken zijn geschikt voor de studie van de fysieke interacties tussen eiwitten voor de ontdekking van nieuwe onderdelen van cellulaire signaalroutes en begrip eiwit dynamiek.

Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Mijn naam is Devrim Gozuacik. Wij werken aan de Sabanci Universiteit in Istanbul, Turkije, aan de regulatie van autofagie bij zoogdieren. Wij richten ons op verschillende eiwitten, signaalpaden en RNA's die autofagie reguleren.Er zijn verschillende technieken om autofagie te bestuderen. Wij maken gebruik van moleculair-biologische, biochemische en celbiologische technieken om verschillende pathways die wij ontdekken te analyseren. Wij maken gebruik van immunoprecipitatie, immunofluorescentietechnieken, confocale microscopie en diverse andere technieken om autofagie-pathways te analyseren.Details over verschillende technieken, valkuilen en probleemoplossing worden toegelicht door mijn PhD-student, Secil Erbil. Het algemene doel van immunofluorescentie- en immunoprecipitatieprocedures is het monitoren van endogene eiwit-eiwitinteracties in een cel. Deze methode kan u helpen bij het beantwoorden van kernvragen over eiwit-eiwitinteracties en de cellulaire lokalisatie daarvan.Het belangrijkste voordeel van deze technieken is de mogelijkheid om de interactie-intensiteit tijdens gewenste behandelingen en condities te kwantificeren in vergelijking met de controle. Begin met het losmaken van de cellen met trypsine. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer en bereken de celconcentratie.Neem verpakte en geautoclaveerde dekglasjes en plaats deze in een Petri-schaal van 10 centimeter. Indien u werkt met een cellijn die gemakkelijk loslaat, zoals HEK293T, zoals in dit experiment, coat de dekglasjes dan met een steriel gefiltreerde 0,01% poly-L-lysine-oplossing. Verwijder de oplossing na 10 minuten incubatie.Wacht tot alle poly-L-lysine is verdampt en de dekglasjes volledig droog zijn. Was ze vervolgens met steriele PBS. Doe één milliliter medium in een 12-wells plaat en plaats de dekglasjes in elke well.Zaai 20 000 cellen per putje. Het is belangrijk om de plaat tijdens en na de inoculatie te schudden om een homogene distributie van de cellen op de dekglasjes te verkrijgen. Behandel de cellen met het gewenste geneesmiddel en de bijbehorende controle op een zodanige wijze dat de totale incubatietijd van de cellen 48 uur niet overschrijdt.Verwijder na 48 uur het medium van de dekglasjes en was de cellen eenmaal met PBS. Verwijder vervolgens, onder een afzuigkap, de PBS en fixeer de cellen door ze 20 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 4% PFA. Omdat PFA lichtgevoelig is, moet de plaat tijdens de incubatietijd met aluminiumfolie worden afgedekt.Verwijder vervolgens de PFA en was de monsters drie keer met PBS. In deze stap is het belangrijk om de monsters één voor één te wassen om uitdroging te voorkomen. Label daarna een six-well plaat volgens uw behandelingscondities en bedek elke well met Parafilm.Let in deze stap op dat de onderzijde glad is na het afdekken met Parafilm. Plaats vervolgens de dekglasjes in een six-well plaat, breng 100 µL van het BSA-saponine-mengsel aan op elk dekglasje en incubeer deze 30 minuten op ijs voor het blokkeren. Verwijder daarna de blokkeringsoplossing en was de monsters eenmaal met PBS.Bereid een 1:100 verdunning van het primaire antilichaam in een BSA-saponine mengsel en breng 100 µL van deze oplossing aan op elk dekglas. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Schud de plaat tijdens de incubatie bij voorkeur om een gelijkmatige distributie van het antilichaam op de dekglazen te waarborgen.Verwijder vervolgens het primaire antilichaam en was de monsters drie keer met PBS. Bereid een 1:500 verdunning van het Alexa Fluor secundaire antilichaam in het BSA-saponine mengsel en breng 100 µL van deze oplossing aan op elk dekglas. Aangezien Alexa Fluor lichtgevoelig is, is het belangrijk om de monsters na deze stap in het donker te bewaren.Dek daarom de zes-wellsplaat af met aluminiumfolie en incubeer deze één uur bij kamertemperatuur op de schudmachine. Verwijder vervolgens het secundaire antilichaam en was de monsters drie keer met PBS. Label de objectglazen met de namen van uw behandelingen en maak ze schoon met ethanol met behulp van Kimwipes.Breng vervolgens 10 µL montagevloeistof aan in het midden van elk objectglas. Plaats met een pincet elk dekglas op de objectglazen. Neem vervolgens voorzichtig de overtollige montagevloeistof weg met een Kimwipe.Stabiliseer eerst elk dekglas met vier druppels nagellak. Sluit het dekglas vervolgens volledig af. Analyseer het monster met behulp van een confocale microscoop.Hier ziet u een voorbeeld van een colocalisatieresultaat dat is verkregen met dit protocol, afkomstig uit onze recente publicatie. In deze video is het endogene RACK1-eiwit groen gekleurd, terwijl endogeen LC3 rood is gekleurd. De gele stippen in de samengevoegde beelden (Merge) zijn de plaatsen waar de groene en rode signalen elkaar overlappen.Met andere woorden vertegenwoordigen de gele stippen de colocalisatie van deze twee eiwitten. Immunoprecipitatie is een andere veelgebruikte methode voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteracties. Begin met het uitzaaien van vier miljoen HEK293T-cellen in Petrischalen van 15 centimeter voor elke conditie.Behandel de cellen met de gewenste geneesmiddelen zodanig dat de totale incubatietijd van de cellen 48 uur niet overschrijdt. Oogst na 48 uur incubatie de cellen met ijskoud PBS. HEK293T-cellen laten gemakkelijk los van de plaat.Daarom is het wassen van de plaat met PBS door middel van pipetteren voldoende om alle cellen los te maken en te oogsten. Verzamel de cellen in Eppendorf-buisjes en centrifugeer deze 15 minuten op maximale snelheid bij vier graden. Verwijder vervolgens het supernatant en was de celpellet met één milliliter PBS door deze opnieuw te suspenderen via pipetteren.Centrifugeer vervolgens opnieuw en verwijder het supernatant. Resuspendeer daarna de celpellet in RIPA-buffer met protease-remmers. Vortex de suspensie 15 seconden en bewaar de Eppendorf-buis vijf minuten op ijs.Herhaal het vortexen vijf keer, telkens met een tussenpoos van vijf minuten. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 15 minuten op de hoogste snelheid bij vier graden. Neem daarna de supernatant en centrifugeer deze opnieuw om het celdebris volledig te verwijderen.Verdun eiwitlysaten 1:50 en bereid een 96-wellplaat met de blanco, standaarden en de verdunde monsters. Meng deze in een verhouding van 1:20 met Bradford-oplossing, laat dit 15 minuten in het donker staan en meet de optische dichtheid bij 595 nm, waarna de eiwitconcentratie voor elk monster wordt berekend op basis van de absorptiewaarden. Bereid vervolgens de beads voor de antilichaamkoppeling.Knip met een schaar het uiteinde van een 200-microliter tip af en neem 25 microliters bead slurry voor elke conditie. Was de beads één keer met PBS, één keer met RIPA-buffer en één keer met RIPA-buffer die proteaseremmers bevat. Resuspendeer de beads na de laatste wasbeurt in 300 microliters RIPA-buffer met proteaseremmers en voeg 1,5 microgram toe van het antilichaam dat specifiek is voor het eiwit dat u wilt neerhalen (pull-down).Incubeer het mengsel van antilichaam en beads een nacht bij vier graden op een rotator. Was na de incubatie de beads met RIPA-buffer die protease-remmers bevat en breng twee milligram totaal cellysaat van elke conditie aan. Vul het totale volume aan tot 300 microliters met RIPA-buffer die protease-remmers bevat en incubeer deze een nacht op een rotator bij vier graden.Was de korrels vervolgens drie keer met RIPA-buffer die protease-remmers bevat. Probeer na de laatste wasbeurt, met behulp van een kleinere pipet, al het supernatant te verwijderen zonder de korrels aan te raken. Voeg daarna 10 µL 3X laadkleurstof toe.Voor het beheersen van de endogene expressie van eiwitten die in een co-immunoprecipitatie-experiment worden gecontroleerd, worden input-monsters voorbereid met gebruik van ten minste 100 micrograms eiwitlysaat. Voeg aan elk monster een passend volume 3X loading dye toe. Om de IP- en input-controlemonsters te denatureren, worden deze 10 minuten gekookt bij 95 degrees.Centrifuge vervolgens en breng de monsters aan op een SDS-gel om de eiwitten op basis van grootte te scheiden middels een western blot. Laat de eiwitmonsters door de SDS-gel lopen en breng de eiwitten daarna over op nitrocellulosemembranen. Nadat de natte transfer is voltooid, wordt het nitrocellulosemembraan geblokkeerd door het gedurende één uur bij kamertemperatuur op een schudplaat te incuberen in een 5% vetvrije melkoplossing.Was daarna het membraan drie keer in PBS-Torin-oplossing gedurende vijf minuten op de schudmachine bij kamertemperatuur. Incubeer het membraan gedurende één uur bij kamertemperatuur in het primaire antilichaam dat specifiek is voor het eiwit dat u wilt detecteren. U kunt er eventueel voor kiezen om primaire antilichamen in rode oplossing te bereiden, zodat ze hergebruikt kunnen worden zonder kwaliteitsverlies.Herhaal na incubatie met het primaire antilichaam drie keer de wasstappen met PBS-Torin. Bereid vervolgens een oplossing van HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in 5% vetarme melk voor en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur op de schudmachine met het membraan. Herhaal na de incubatie opnieuw de wasstappen.Bereid vervolgens een zelfgemaakte ECL-oplossing en plaats het membraan in een cassette. Voer daarna de fixatiestappen uit zoals beschreven in de tekst in een volledig diagram. Markeer na het fixeren en drogen van de film de randen van het membraan en de eiwitletter om de specifieke band te kunnen voorspellen.Herhaal al deze antilichaamincubatiestappen, gevolgd door de donkerkamerprocedures, voor alle eiwitten waarvan u de interactie wilt controleren. Analyseer vervolgens de resultaten. Hier ziet u een resultaat van een endogene immunoprecipitatie afkomstig uit onze recente publicatie.In deze video werd het endogene ATG5-eiwit neergeslagen en werden de niveaus van endogene RACK1 co-immunoprecipitatie gecontroleerd onder verschillende omstandigheden. Bij het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om zoveel mogelijk biologische herhalingen met positieve en negatieve controles te gebruiken, om zo de gekwantificeerde interactieniveaus na verschillende behandelingen te kunnen verzamelen. Het totaalbeeld dat alle biologische replica's geven, wordt gedefinieerd als het interactiepatroon onder verschillende omstandigheden.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de dynamiek van eiwit-eiwitinteracties kunt onderzoeken.

study-of-protein-protein-interactions-in-autophagy-research

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Autofagie activatie is gunstig bij de preventie van een aantal ziekten. Een van de fysiologische technieken induceren autofagie in vivo lichaamsbeweging. Hier laten we zien hoe autofagie activeren door aërobe oefening en meet autofagie niveaus in muizen.

Het activeren van Autofagie door Aerobic Oefening in Muizen

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

Field-effect biosensing (FEB) is een labelvrije techniek voor het detecteren van biomoleculaire interacties. Het meet de elektrische stroom door de grafeen biosensor waaraan de bindende doelen worden geïmmobiliseerd. De FEB-technologie werd gebruikt om biomoleculaire interacties tussen Hsp90 en Cdc37 te evalueren en er werd een sterke interactie tussen de twee eiwitten gedetecteerd.

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Het huidige protocol beschrijft de inductie van autofagie in het Drosophila melanogaster larvaal vetlichaam via nutriëntendepletie en analyseert veranderingen in autofagie met behulp van transgene vliegenstammen.

Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam

Dit protocol beschrijft verschillende methoden die kunnen helpen bij de studie van ATG9A-biologie, waaronder immunofluorescentie gevolgd door beeldanalyse, overwegingen met betrekking tot voorbijgaande overexpressie en het onderzoeken van de ATG9A-glycosyleringsstatus met behulp van western blot.

Beeldvorming van ATG9A, een multi-overspanning membraaneiwit

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een op luciferase gebaseerde reportertest in een semi-geautomatiseerd screeningsformaat met hoge doorvoer.

Celgebaseerde geneesmiddelenscreening op remmers van autofagie-gerelateerde 4B-cysteïnepeptidase

Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes

Leer immunofluorescentie en immunoprecipitatie voor eiwit-eiwitinteracties in autophagy-onderzoek bij zoogdieren. Deze methoden onthullen nieuwe componenten van cellulaire signaalroutes.

Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek

Meer video's verkennen