Name: Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer een nieuwe niet-kruislinkende, formalinevrije weefselfixatiemethode voor HER2 FISH-analyse in borstkankerweefsel. Dit protocol combineert cryobehoud met eenvoudige formaline nabehandeling voor superieure moleculaire diagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het team van het laboratorium voor moleculaire pathologie bij het Instituut van de pathologie van de medische Universiteit Graz voor hun expertise en ondersteuning. Bovendien, wij danken Iris Kufferath en Daniela Pabst voor technische bijstand, Bernadette Rieger en Sylvia Eidenhammer voor de verwerking van de HER2-gevallen en Kinga Szurian (patholoog) alsmede Tamas Regényi (3DHISTEC). Wij danken Penelope Kungl voor proeflezen van het manuscript. Dit werk heeft financieel ondersteund door het Christian Doppler onderzoeksfonds, het Oostenrijkse federale ministerie van wetenschap, onderzoek en economie en de nationale Stichting voor onderzoek, technologie en ontwikkeling.

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de medische universiteit van Graz (referentie nummer 20-066), Oostenrijk. Weefselsteekproeven werden twee gevallen van chirurgisch gereseceerd primaire invasieve borstkankers verkregen nadat de patiënten schriftelijke geïnformeerde toestemming had gegeven.
1. de weefsels fixatie
Opmerking: Weefsel fixatie is uitgevoerd ofwel met standaard gebufferde formaline-oplossing (SBFS), gedefinieerd als 10% formaline-oplossing met een massafractie van 3,7% (overeenkomend met de breuk van een volume van 4%) formaldehyde gebufferd op een pH van 6.8 pH 7,2 volgens CEN/TS 16827-1:2015 of de niet-cross-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatie systeem (ook de alternatieve fixatie oplossing hieronder genoemd) bestaande uit een fixatief en een stabilisator oplossing bij kamertemperatuur (RT).
<ol>
	<li>Snijd de borst kanker weefselsteekproeven met een steriel scalpel in twee helften elk 4 mm dik om te zorgen voor voldoende weefsel hoeveelheid. Gebruik een maximumgrootte van 4 x 15 x 15 mm voor NCFPE of SBFS weefsel fixatie.</li>
	<li>Plaats elk halfjaar van het specimen van de tumor in een cassette standaard weefsel en het onderdompelen in SBFS of de alternatieve fixatie oplossing gedurende 24 uur met een volume per volumeverhouding (v/v) van 4 delen fixeer en enerzijds weefsel (4 mL/1 g weefsel (idealiter 10 mL/1 g)).</li>
	<li>Breng het alternatief-vaste monsters in de stabilisator oplossing voor 2-72 h door openen van de container, de cassette weefsel door 180° draaien en het dompelen.</li>
	<li>Plaats de cassettes van het weefsel met de monsters SBFS-fixed in 250 mL 70% ethanol voor 30 min op RT te verwijderen van de resterende SBFS. Opmerking: Deze stap is belangrijk om SBFS verontreiniging van niet-kruis-mailkoppeling fixeer-behandelde monsters in de geautomatiseerde weefsels-processor, die de heilzame eigenschappen van niet-kruis-mailkoppeling fixatives voor behoud van biomoleculen vernietigen zou te voorkomen. Let op: SBFS is een gevaarlijke oplossing veroorzaakt irritatie van de huid, ernstige oogbeschadigingen, de reactie van een allergische huid kan veroorzaken, wordt verdacht van het veroorzaken van genetische afwijkingen, kanker, irritatie van de luchtwegen, slaperigheid en veroorzaakt schade aan organen kan veroorzaken. De alternatieve fixeerspray is vergiftig bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond, irriterend voor de ogen en de huid, gevaar voor ernstige onherstelbare effecten bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond. Inhalatie- en fysiek contact moeten worden vermeden voor beide fixatie-oplossingen. Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en bescherming van de ogen en gezicht. Werken in een zuurkast.</li>
	<li>Ga naar bewerking, insluiten en weefsel segmenteren (punten 2 en 3).</li>
</ol>
2. de weefsels verwerking en insluiten
<ol>
	<li>Uitvoeren van de stapsgewijze uitdroging van weefsel cassettes met de vaste weefselmonsters in 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min) en ethanol 99% (2 x 60 min), gevolgd door xyleen (2 x 60 min). Vervolgens infiltreren met parafin in een geautomatiseerde weefsel processor (4 x 45 min).</li>
	<li>Plaats de uitgedroogd en paraffine-geïnfiltreerd monsters met pincet (alternatief en SBFS vaste) in metalen mallen.</li>
	<li>Insluiten van de monsters in 5-10 mL gesmolten paraffine (stollen punt 56-58 ° C) met behulp van een paraffine insluiten instrument.</li>
	<li>Plaats de mallen op een koeling bord bij-5 ° C gedurende 30 min.</li>
	<li>De blokken van paraffine-ingebedde weefsel herstellen van de mallen.</li>
	<li>Opslaan van de resulterende blokken (alternatief-vaste, paraffine-ingebedde (NCFPE) en SBFS-fixed paraffine-ingebedde (FFPE)) in het donker bij 4 ° C tot gebruik.</li>
</ol>
3. de weefsels segmenteren en dia voorbereiding voor vis
Opmerking: FFPE secties worden direct gebruikt voor vis, terwijl dia's met NCFPE secties post in SBFS voor 24 h vóór vis procedure worden vastgesteld.
<ol>
	<li>Een eenmalig gebruik mes in de microtoom invoegen en aanpassen van de microtoom aan 10 µm.</li>
	<li>Neem het eerste blok van de koeling plaat en het invoegen van het instrument.</li>
	<li>Trim het blok tot een egaal oppervlak is bereikt. Reinig de microtoom met een borstel en aan te passen aan 3 µm. Gooi de eerste 2-3 secties.</li>
	<li>Snij 3 µm secties van NCFPE en FFPE blokken en plaats ze in een bad met koud water (ultrazuiver water). Opmerking: Voor het verkrijgen van betere foto's zonder overlappende kernen, hier, beelden van 2 µm secties in plaats van 3-5 µm zoals aanbevolen in de manufacturer´s-instructies worden weergegeven.</li>
	<li>Elke drijvende sectie met een fijne kwast en een naald op een gecoate microscoopglaasje voor de hechting van de weefselsecties halen.</li>
	<li>Deze dia duik in een warme (40 ° C) water bad en laat de sectie volledig strekken.</li>
	<li>De sectie terug op de dia door zorgvuldig de dia uit het water te trekken en voorkomen van rimpels.</li>
	<li>Laat die alle secties bij kamertemperatuur gedurende 1 uur drogen.</li>
	<li>Verwarm de dia's bij 70 ° C gedurende 30 minuten in een incubator te smelten de paraffine.</li>
	<li>Zet de dia's horizontaal in een glazen pot kleuring.</li>
	<li>Hydrateren de secties stapsgewijze op RT in de kleuring potten gevuld met 250 mL elke van de volgende vloeistoffen: 100% xyleen 2 x 15 min, 96% ethanol 90% ethanol 2 min, 80% ethanol 2 min, 70% ethanol 2 min, 50% ethanol, 2 x 15 min 2 min , en gedistilleerd water 2 x 10 min. Let op: Deparaffinization en rehydratie stappen uitvoeren in een zuurkast, giftige volatilized oplosmiddelen niet inademen. Opmerking: Afhankelijk van de secties en weefsel, het kan noodzakelijk zijn voor het testen van verschillende incubatie keer vooraf.</li>
</ol>
4. na fixatie van NCFPE specimens
<ol>
	<li>Na fixatie van NCFPE dia's door ze te plaatsen in een nieuwe kleuring pot gevuld met SBFS gedurende 24 uur op RT. plaats de pot in een zuurkast tijdens de 24 h na fixatie stap uitvoeren</li>
	<li>De overtollige SBFS verwijderen door te wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (3 x 10 min) en gedestilleerd water (2 x 10 min).</li>
</ol>
5. fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)
Opmerking: Hier vissen wordt uitgevoerd met behulp van de verkrijgbare HER2/CEN17 dual kleur sonde Kit volgens de instructies van de fabrikant. Laat niet de weefselsecties te drogen tijdens de kruising en wassen stappen. Laat niet de DNA sonde en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA counterstain oplossingen aan het licht worden blootgesteld gedurende een langere periode. Voer deze stappen uit in het donker met behulp van Svetonepronitsaemyi containers. Afhankelijk van de leeftijd en de stap van de fixatie van het monstermateriaal, verhogen of verlagen de denaturering en wassen temperaturen om betere hybridisatie resultaten te verkrijgen.
<ol>
	<li>Plaats een kleuring pot met 250 mL warmte voorbehandeling oplossing citroenzuur in een waterbad van 98 ° C.</li>
	<li>Plaats de gerehydrateerd FFPE en na vaste NCFPE dia's in de pot en incubeer gedurende 15 minuten.</li></ol>Gebruik niet meer dan zes dia's per pot kleuring.
	<li>Wassen van de dia's in gedestilleerd water gedurende 3 minuten op RT in een nieuwe kleuring pot.</li>
	<li>Voor proteolyse, plaatst u de dia's in een temperatuur gecontroleerde kruising systeem bij 37 ° C.<ol>
		<li>Onmiddellijk, breng de-kant-en-klare pepsine oplossing (2mg/ml) ontkleuring (~ 30 µl per druppel) naar de weefselsecties totdat het volledig bedekt is. Incubeer gedurende 9 min bij 37 ° C in de kruising systeem. Opmerking: Een incubatietijd van 5-15 min wordt aanbevolen. De optimale tijd voor proteolyse moet vooraf worden vastgesteld.</li>
		<li>Plaats van de dia's in een pot met was buffer SSC en incubeer gedurende 5 min.</li>
		<li>De dia's in gedestilleerd water gedurende 1 min spoelen op RT.</li>
		<li>Uitvoeren van uitdroging van de secties in de volgende gesorteerde alcoholen: 50%, 70%, 90% en 100%, elk voor 1 min. lucht drogen de secties.</li>
		<li>Voor hybridisatie, Pipetteer 10 µL van HER2/CEN17 sonde naar de gedroogde weefselsecties, dekking van elk monster met een dekglaasje aan en verzegel het met rubber-cement. Opmerking: 10 µL van de sonde wordt aanbevolen per 22 x 22 mm weefsel gebied. Een zachte opwarming van de aarde van de sonde maakt de pipetting proces gemakkelijker. Vermijd bubbels en lange blootstelling van de sonde aan het licht.</li>
		<li>Co denatureren sonde en specimen DNA in het systeem van de kruising bij 75 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>De kruising systeem ingesteld op 37 ° C en 's nachts te vermengen.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig het rubber-cement met een tang na kruising en opsporing.</li>
		<li>Incubeer de dia's in een kleuring pot met 37 ° C vooraf opgewarmd 1 x wassen buffer A voor 5 min. verwijderen de coverslips.</li>
		<li>Wassen de dia's met behulp van vooraf opgewarmd 1 x wassen buffer A tweemaal gedurende 5 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Uitdrogen van de dia's in 70%, 90% en 100% ethanol, 1 minuten elk.</li>
		<li>De monsters in de lucht droog en beschermen tegen licht.</li>
		<li>Voor vlekken, breng 30 µL DAPI-oplossing voor het gehybridiseerde gebied vermijden van bubbels. Dekking van de secties met een dekglaasje aan.</li>
		<li>Incubeer gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de overtollige DAPI-oplossing door zachtjes te drukken op de dia tussen filtreerpapier.</li>
		<li>De dia's bij 2-8 ° C in het donker opslaan voor maximaal 2 weken tot evaluatie door confocale microscopie.</li>
	</ol>
	</li>

6. confocal imaging en scannen van dia's van vis
<ol>
	<li>Uitvoeren van de confocal imaging en scannen van dia's op een confocal digitale scanner is uitgerust met een 40 x / 1.2 nb objectief, quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) en een 5.5Mpx, 16 bit, gekoeld wetenschappelijke aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (CMOS) camera.</li>
	<li>Verwerven van de beelden met filters voor groen (excitatie: 503 nm, emissie: 528 nm) en oranje (excitatie: 547 nm, emissie: 572 nm) kanalen.</li>
</ol>
7. interpretatie
Opmerking: De sonde HER2/CEN17 is een mengsel van een rode fluorescerende gemerkt CEN17 sonde specifiek voor de regio Alfa satelliet centromeric van chromosoom 17 (D17Z1) en een groene fluorescerende-gelabelde HER2 sonde specifiek voor het HER2-gen (sonde locatie 17q12). Tumor specimens met een HER2:CEN17 verhouding ≤2.0 per kern worden gescoord als normaal, overwegende dat degenen met een HER2:CEN17 verhouding ≥2.0 als versterkte17worden gescoord.
<ol>
	<li>Het uitvoeren van de analyse van de kwaliteit van de beelden met de open source CaseViewer 2.120.<ol>
		<li>Evalueren ten minste 20 cellen die zich in twee verschillende regio's van de invasieve component van het carcinoom bevinden zoals gedefinieerd door een patholoog. Duidelijk te onderscheiden goed gedistribueerde kernen deelnemen aan het tellen gebied. Uitsluiten van het weefsel regio's aan de grens en de ingeklapte of geperst gebieden tellen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. RNA kwaliteit
<ol>
	<li>RNA extractie<ol>
		<li>Zorg ervoor dat alle instrumenten en hulpmiddelen RNAse gratis worden. Gebruik een oplossing RNAse-verwijderen.</li>
		<li>Knippen 10 tot 20 delen (5 µm dik) van NCFPE of FFPE monsters gebruikend microtome volgens het protocol tot stap 3.8.</li>
		<li>RNA uittreksel uit NCFPE monsters met behulp van de RNA-isolatie kit (Zie de tabel van materialen). Het uittreksel van RNA van FFPE monsters met behulp van een FFPE RNA isolatie kit. Opmerking: Extractie van RNA van niet-kruis-mailkoppeling fixatives vereist een isolatie-methode aangepast aan de fixatie-methode. Gebruik niet een andere RNA isolatie methode (bijvoorbeeld Trizol, RNeasy FFPE, etc. voor NCFPE model).</li>
		<li>Bepaal het RNA concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. De verhouding van de absorptie bij 260 nm en 280 nm (A260/280) moet worden ~ 2.0.</li>
		<li>De geïsoleerde RNA bij-70 ° C bewaren tot verdere analyse.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uitvoeren van een glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) real-time omgekeerde transcriptie PCR inleidingen gebruiken voor het genereren van waarbij van verschillende lengtes8,9.<ol>
		<li>Gebruik een cDNA omgekeerde transcriptie kit volgens de instructies van de manufacturer´s voor cDNA synthese. Gebruik 500 ng RNA van elk monster. Bewaren cDNA bij-20 ° C tot verder gebruik.</li>
		<li>De master mix van PCR volgens de instructies van de manufacturer´s voor te bereiden.</li>
		<li>Pipetteer de master mix van PCR in triplicates in een 384-well reactie plaat. Toevoegen van 4 µL van 1:16 verdund cDNA (PCR sjabloon). De PCR volgens de instructies van de manufacturer´s uit te voeren. Opmerking: Voor menselijke GAPDH, werden de volgende inleidingen gebruikt: GAPDH naar voren: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH omgekeerde: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ en 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.</li>
		<li>Analyseer de resultaten met behulp van een software die van toepassing zijn op de machine van PCR. Niet-specifieke producten moeten worden uitgesloten op basis van het smelten van de kromme analyse21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+banks%3A+well-guarded+treasures+in+the+interest+of+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).</li>
<li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li>
<li>Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+formaldehyde-induced+modifications+in+proteins%3A+reactionswith+model+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides.</a> J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).</li>
<li>Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+formaldehyde+fixation+on+RNA%3A+optimization+of+formaldehyde+adduct+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal.</a> J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).</li>
<li>Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-formalin+fixative+versus+formalin-fixed+tissue%3A+A+comparison+of+histology+and+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).</li>
<li>Do, H., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artifacts+in+DNA+from+formalin-fixed+tissues%3A+causes+and+strategies+for+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization.</a> Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).</li>
<li>Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+of+RNA+Preservation+and+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissue%3A+Implications+for+RT-PCR+and+Microarray+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis.</a> PloS One. 8 (7), e70714(2013).</li>
<li>Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technology+for+stabilization+of+biomolecules+in+tissues+for+combined%09histological+and+molecular+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined	histological and molecular analyses.</a> J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).</li>
<li>Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+colon+cancer+histomorphology%3A+A+comparison+between+formalin+and+PAXgene+tissue+fixation+by+an+international+ring+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial.</a> Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).</li>
<li>Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+PAXgene-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues.</a> J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).</li>
<li>Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+Assessment+of+PAXgene+Tissue+Fixation+and+Stabilization+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27704(2011).</li>
<li>Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Evaluation+of+the+PAXgene+Tissue+Fixation+System%3A+Morphology%2C+Immunohistochemistry%2C+Molecular+Biology%2C+and+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics.</a> Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).</li>
<li>Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+HER2+FISH+determination+on+PAXgene-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Path%22%5BJournal%5D)">Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer.</a> Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).</li>
<li>Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+ofHER-2%2Fneu+gene+amplification+in+human+breast+cancer+archival+material+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization.</a> Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).</li>
<li>Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+amplification+ratios+by+fluorescence+in+situ+hybridization+and+correlation+with+immunohistochemistry+in+a+cohort+of+6556+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues.</a> Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).</li>
<li>Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19548375">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer.</a> Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).</li>
<li>Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER-2%2Fneu+gene+amplification+characterized+by+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+poor+prognosis+in+node-negative+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas.</a> J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).</li>
<li>Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+a+tumor+marker+ready+for+prime+time%3F+A+case+study+of+c-erbB-2+as+a+predictive+factor+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).</li>
<li>Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+image+analysis+algorithm+for+detecting+nuclear+signals+in+digital+whole+slides+for+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology.</a> Cytometry A. , (2017).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4489822.pdf">QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</a>. , Publication Number 4489822 (2013).</li>
<li>NCCLS. <a target="_blank" href="https://infostore.saiglobal.com/store/details.aspx?ProductID=800906">Quality Assurance for Immunocytochemistry</a>. , Wayne. (1999).</li>
<li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaker%2C+JR+%22Principles+of+Biological+Microtechnique%22">Principles of Biological Microtechnique</a>. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).</li>
<li>Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+specimen+preparation+in+surgical+pathology%3A+issues+concerning+the+recovery+of+nucleic+acids+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).</li>
</ol>

D.G. is werkzaam bij Qiagen en voorraad opties of bond bedrijven heeft in de pensioenregeling van het bedrijf. De gegevens in dit manuscript verwijzen naar het PAXgene weefsel systeem, dat is ontwikkeld in een gezamenlijke inspanning door Qiagen en PreAnalytiX. Qiagen is industriële partner van de overheid gefinancierde Christian Doppler laboratorium voor Biospecimen onderzoek en Biobanking technologieën. Alle auteurs hebben geen belangenconflict en geen concurrerende financiële belangen.

De resultaten tonen aan dat twee belangrijkste bevindingen. Eerst is een eenvoudige 24u SBFS na fixatie stap van de secties gesneden uit NCFPE weefsels voldoende om het verkrijgen van gelijkwaardige resultaten voor mensen met FFPE in de vis analyses met behulp van vis testen voor FFPE weefsels goedgekeurd (Zie ook naslaginformatie14). Dit protocol heeft het voordeel van het gebruik van vis tests oorspronkelijk ontwikkeld en goedgekeurd voor FFPE zonder de behoefte aan uitgebreide revalidatie (bijvoorbeeld door het optimaliseren van de pre kruising voorwaarden voor non-cross-linked weefsel). Precies zoals beschreven in de instructies van de fabrikant kan de vis-protocol worden gebruikt.
Kleine wijzigingen van de instructies van de manufacturer´s beschreven in dit protocol (bijvoorbeeld weefsel sectie diameter en incubatie periodes in de deparaffinization stappen) resultaat van eerdere aanpassingen, die uitdrukkelijk door de fabrikant is aanbevolen Als gevolg van het gebruik van verschillende weefseltypes (HLA) en fixatie methoden.
De stap na fixatie is essentieel, omdat het vereist een chemische reactie tijd van 18-24 h, die strekt zich uit de tijd van de analyse door een dag maar staat dezelfde dagelijkse workflow ontwikkeld voor FFPE weefsels (Figuur 1). SBFS wordt gemeld dat het weefsel op een gemiddelde van 1 mm per uur,22 tot en met 5 mm in 2 h afhankelijk van het type23,24van weefsel doordringen. De observatie dat alleen na fixatie langdurig van meer dan 18 h kon veranderen de eigenschappen van NCFPE naar FFPE afdelingen, geeft aan dat er sprake is van cruciaal belang voor het bereiken van de gewenste resultaten1 niet de penetratie van de fixeer, maar de chemische reactie tijd ,14.
Ten tweede, het resterende weefsel van de NCFPE die niet voor fixatie van de post gebruikt wordt kan worden gebruikt voor verdere moleculair analyses zoals de biomoleculen goed bewaard gebleven zijn. Dit werd aangetoond door real-time omgekeerde transcriptie PCR (Figuur 3). De bepaling is meer gevoelig en specifiek zijn dan het electropherogram afkomstige RIN waarde (RNA integriteit nummer) met betrekking tot kwaliteit van de RNA (dat wil zeggen, chemische modificatie en fragmentatie) voor mRNA geïsoleerd van paraffine-ingebedde weefsels8. Kwaliteitscontrole was beperkt in deze studie tot PCR in real time aangezien onafhankelijke groepen hebben aangetoond dat naast RNA, de kwaliteit van DNA en eiwitten geïsoleerd van NCFPE beter dan die van FFPE weefsels 8,9, is 13.
Het protocol gepresenteerd volgt, indien van toepassing (bijv. SBFS recept, fixatie voorwaarden, de controle van de kwaliteit van het RNA, validatie), de eisen van de technische specificaties van de CEN voor vooraf analytische procedures voor in-vitro diagnostiek (IVD), die hebben onlangs vrijgegeven door het Europees Comité voor normalisatie (CEN) (bijvoorbeeld CEN/TS 16827-1:2015 voor RNA-isolatie uit FFPE weefsels waarin wordt verwezen naar de ISO 15189 norm).
De methode is beperkt tot deze specifieke fixeerspray. Hoewel het goede behoud van biomoleculen en morfologie met behulp van de niet-cross-mailkoppeling, formaline-gratis fixeerspray is gepresenteerd in verschillende studies, wordt het voornamelijk gebruikt in onderzoek maar niet in routine medische toepassingen. Een van de redenen is dat vervanging van de goudstandaard SBFS fixatie door een ander fixeer een verscheidenheid van validatieonderzoek vereisen zou aangezien niet alle protocollen die zijn geoptimaliseerd voor FFPE materiaal kunnen worden gebruikt voor materialen met niet-kruis-mailkoppeling fixatives bevestigd. Andere weefsel fixatie methoden werden niet getest voor deze vis-protocol.
De eenvoudige na fixatie stap beschreven in dit manuscript heeft het voordeel van het gebruik van IVD goedgekeurde testen beide voor FFPE en NCFPE weefsels.

Gepersonaliseerde geneeskunde afhankelijk steeds meer van Multi-parameter proeven waarbij morfologische en moleculair weefsel analyses. Formaline fixatie van weefsels als de gouden standaard biedt uitstekende morfologische kwaliteit1,2. Echter interfereert formaline-geïnduceerde chemische modificatie en cross-linking van proteïnen en nucleïnezuren3,4,5 negatief met moleculaire analyse6. Deze moleculaire wijzigingen beperken de kwaliteit van nucleïnezuren en proteïnen en kan resulteren in gen reeks artefacten7 of verminderde gevoeligheid van de polymerase-kettingreactie (PCR)-gebaseerd testen8. Hoewel grote inspanningen werden meegenomen naar het optimaliseren van moleculaire tests voor FFPE weefsel, is cryo-behoud van weefsels in algemene superieur aan formaline fixatie, waardoor het noodzakelijk wordt om te splitsen weefselmonsters voor behoud van de verschillende procedures. Om te voorkomen dat de behoefte aan cryo-behoud voor moleculaire analyses, een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-vrije kleefpoeders, PAXgene weefsel werd ontwikkeld. Dit commercieel beschikbare systeem bestaat uit een fixatie en een stabilisatie oplossing met verschillende alcoholen, azijnzuur en een oplosbare organische verbinding. Goede behoud van nucleïnezuren, eiwitten (phospo) en morfologie werd getoond in verscheidene studies6,9,10,11,12,,13.
Een bepaalde toepassing in kanker diagnostiek is vis opsporen van een brede waaier van chromosomale wijzigingen, zoals translocaties, submicroscopische verwijderingen en amplifications 14. Bijvoorbeeld, twintig procent van de invasieve borst kanker tumoren Toon versterking van de menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) gene15,16,17, die geassocieerd met een slechte prognose18 wordt ,19. Bepaling van de HER2 overexpressie en versterking status bij borstkanker door vis nodig is om te kiezen van patiënten voor anti-HER2-gerichte therapie en is een metgezel diagnostische vermeld door de Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. In staat te stellen een brede toepassing van vis gebaseerde metgezel diagnostiek in de gezondheidszorg zijn testen ontwikkeld en goedgekeurd voor FFPE weefsels.
In een eerdere studie toonden we dat NCFPE weefsels kunnen niet worden gebruikt voor het testen van de vis die zijn goedgekeurd voor FFPE weefsel. Tests van tijd reeks andere post fixatie procedures van NCFPE weefsels met 4% gebufferd formaldehyde bleek dat fixatie tijden van 18 h of langer van NCFPE weefselsecties post bereikt echter gelijkwaardige resultaten voor mensen met FFPE weefsels14.
In deze studie, wij bieden een gedetailleerd protocol en aantonen dat de gevolgen van niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatie en 24 h 4% gebufferd formaldehyde na fixatie op secties gebruikt voor HER2 vis en RNA kwaliteit uit de dezelfde primaire weefsel monster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig1.jpg"> 
Figuur 1: Diagram toont de stappen voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en RNA analyse van formaline vaste paraffine ingesloten (FFPE) en niet-Kruis-koppeling, formaline-vrije vaste paraffine ingebedde weefsels (NCFPE). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany</td><td>www.sav-lp.de</td><td>FN-200L-4-1</td><td>Weefselfixeermiddel</td></tr><tr><td>Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada</td><td>www.simport.com</td><td>M-498</td><td>Veiligheidsapparaat dat etikettering, fixatie en paraffine-inbedding voor weefselmonsters biedt.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Germany</td><td>www.qiagen.com</td><td>765112</td><td>Voor het verzamelen, fixeren en stabiliseren van weefselmonsters: 10 voorgevulde reagentiakontainers, met PAXgene Tissue FIX en PAXgene Tissue STABILIZER.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>813150</td><td>Verwerking van biologische monsters van chemische fixatie tot paraffine-infiltratie</td></tr><tr><td>Merck Millipore, Munich, Germany</td><td>www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html</td><td>MC1009834000</td><td>Dehydratie van weefselmonsters</td></tr><tr><td>VWR Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>https://at.vwr.com</td><td>10293EP</td><td>Dehydratie van weefselmonsters</td></tr><tr><td>ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria</td><td>www.herba-chemosan.at</td><td>2549662 32</td><td>Paraffine gebruikt in een weefselverwerkingsapparaat</td></tr><tr><td>Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria</td><td>www.LeicaBiosystems.com</td><td>39602004</td><td>Paraffine-inbeddingsmedium</td></tr><tr><td>Sanova Diagnostik, Vienna, Austria</td><td>www.sanova.at</td><td>5229</td><td>Paraffine-inbeddingsinstrument voor weefsels voor histologie</td></tr><tr><td>Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria</td><td>www.histocom.info</td><td>M 910010</td><td>Dit apparaat wordt gebruikt voor bijzonder geavanceerde paraffine-snijtechnieken in de biologie en geneeskunde. Alleen bekwaam of speciaal opgeleid personeel mag de microtoom bedienen, d.w.z. het monster klemmen, trimmen, snijden en de secties van het instrument verwijderen.</td></tr><tr><td>Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark</td><td>www.chem.agilent.com</td><td>K802021-2</td><td>Gecoate glazen platen, bedoeld voor het monteren van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Germany</td><td>www.qiagen.com</td><td>73504</td><td>Voor zuivering van totaal RNA uit formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Germany</td><td>www.qiagen.com</td><td>765134</td><td>Voor zuivering van totaal RNA uit PAXgene-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties</td></tr><tr><td>ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany</td><td>www.zytovision.com</td><td>Z-2015-200</td><td>Voor de detectie van ERBB2 (ook bekend als HER2) genamplificatie die vaak wordt waargenomen in solide kwaadaardige neoplasmata, bijv. borstkankermonsters.</td></tr><tr><td>3DHISTEC, Budapest, Hungary</td><td>www.3dhistech.com</td><td></td><td>Digitaal apparaat voor het scannen van weefselslides uitgerust met een 40x/1.2 NA objectief, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters en een 5.5Mpx, 16 bit, gekoelde wetenschappelijke CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4368814</td><td>Het High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit bevat alle componenten die nodig zijn voor de kwantitatieve omzetting van maximaal 2 &micro;g totaal RNA naar enkelstrengs cDNA in één 20 &micro;L reactie.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4367659</td><td>PCR Master Mix met polymerase, nucleotiden en SYBR Green voor PCR en kwantificering van amplicons.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE</td><td>www.thermofisher.com</td><td>Ser. Nr. F239</td><td>Spectrofotometer voor nucleïnezuurkwantificering.</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4485701</td><td>PCR-machine,</td></tr><tr><td>Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A</td><td>www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order</td><td>bijv. (ThermoBrite) 07J91-020</td><td>Temperatuurgeregeld dia-verwerkingssysteem voor in-situ denaturatie/hybridisatieprocedures.</td></tr></tbody></table>

protocol voor her2 vissen combineren van de voordelen van cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Morfologische beoordeling van formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE) is de gouden standaard voor kanker diagnostiek voor decennia als gevolg van haar uitstekende behoud van morfologie. Gepersonaliseerde geneeskunde biedt steeds meer individueel aangepast en gerichte therapieën voor gekarakteriseerd afzonderlijke ziekten ingeschakeld door gecombineerde morfologische en moleculair analytische technieken en diagnostiek. Prestaties van morfologische en moleculaire tests uit de dezelfde FFPE monster is uitdagend vanwege de negatieve impact van formaline door chemische wijziging en cross-linking van nucleïnezuren en proteïnen. Een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief heeft onlangs ontwikkeld om te voldoen aan beide eisen, dat wil zeggen, voor het behoud van de morfologie zoals FFPE en biomoleculen zoals cryo-behoud. Aangezien vis vaak in combinatie met histopathologie en moleculaire diagnostiek vereist is, testten we de toepasselijkheid van vis protocollen betreffende weefsels behandeld met deze nieuwe fixeerspray. We vonden dat na fixatie van formaline van histologische secties van niet-kruis-linking, formaline-vrije en paraffine-ingebedde (NCFPE) borst kanker weefsel gegenereerd gelijkwaardige resultaten voor mensen met FFPE weefsel in menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) FISH-analyse. Dit protocol beschrijft hoe een vis assay oorspronkelijk ontwikkeld en gevalideerd voor FFPE weefsel kan worden gebruikt voor NCFPE weefsels door een eenvoudige stap na fixatie van histologische secties.

VIS HER2 bepaling:
De HER2-vis signaal intensiteiten van FFPE en NCFPE zijn vergelijkbaar (Figuur 2). Beide gevallen in de meeste cellen tonen een duidelijke overmaat van het groene signaal (indicatief van de versterkte HER2-gen locus) in vergelijking met het rood signaal (CEN17 referentie gen). Daarom toont de zaak een versterkte HER2-gen, wat betekent dat deze patiënt verwachting inspelen op trastuzumab, een anti-HER2 gerichte therapie. Het FFPE-model diende als positieve controle. De signalen die waargenomen in niet-neoplastische cellen (zowel in FFPE en NCFPE) dienen als interne verwijzing en negatieve controle voor HER2 gene versterking. Voor elke analyse-serie, moet ten minste één sectie met bekende gene amplificatie status als positieve controle worden gebruikt voor de kruising reactie.
RNA kwaliteit:
Overeenkomstige FFPE en NCFPE samples uit twee verschillende gevallen tonen verschillen in RNA kwaliteit door gebruik te maken van real-time omgekeerde transcriptie PCR. Resultaten tonen verschillende versterking efficiëntie voor verschillende amplicon lengtes (dat wil zeggen, 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) van de GAPDH-mRNA. Alle Ct (cyclus drempel) waarden, verkregen uit FFPE monsters waren hoger dan die van NCFPE. Dit verschil toont de lagere PCR amplificability van mRNA geïsoleerd uit FFPE weefsels, suggereert een meer uitgesproken chemische modificatie. Bovendien, de hogere Ct-waarden voor lang in vergelijking met korte waarbij zijn indicatie voor mRNA fragmentatie. Ter vergelijking: de Ct waarde hellingen van de lengtes van de verschillende amplicon toont meer uitgesproken mRNA versnippering in FFPE dan NCFPE weefsels (Figuur 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2.jpg"> 
Figuur 2: representatieve resultaten van HER2 vis voor overeenkomstige formaline vaste paraffine ingesloten (FFPE) en niet-kruis-mailkoppeling, vrij van formaline vaste paraffine-ingebedde weefselsecties (NCFPE). Overeenkomstige monsters uit de dezelfde FFPE (A) en NCFPE (B) weefsels worden weergegeven. In tegenstelling tot normale interfase cellen (C), waar twee groen (HER2) en twee rode (CEN17)-signalen worden verwacht, cellen met versterkte HER2-gen locus vertegenwoordigen meerdere exemplaren van de groene signalen (HER2) (D). De status van de versterking van het HER2 was identiek in zowel FFPE als de post vaste NCFPE-secties (A, B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig3.jpg"> 
Figuur 3: resultaten van een real-time omgekeerde transcriptie PCR-test gebruikt voor de controle van de kwaliteit van het RNA. Y-as: Ct (cyclus drempel) waarden van de GAPDH-gen worden weergegeven voor verschillende amplicon lengtes (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) op de x-as. mRNA werd geïsoleerd uit FFPE en NCFPE van twee verschillende borst kanker weefselsteekproeven verwerkt in parallelle en getranscribeerde aan cDNA voor PCR. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is vaak vereist in combinatie met histopathologie en moleculaire diagnostiek voor selectie van therapie in gepersonaliseerde geneeskunde. Een nieuwe niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel-fixeerspray waarmee hoge kwaliteit morfologische, moleculaire en vis analyses van het zelfde model door toevoeging van een na fixatie stap voordat vis wordt aangeboden.

Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

Gepersonaliseerde geneeskunde vereist verschillende soorten analyses, van klassieke histologie tot moleculaire analyse, en diverse in-situ technieken worden op een tumor uitgevoerd om de beste therapie te selecteren. De onderzoekstechnieken maken diverse analysetechnologieën mogelijk vanuit één enkel monster. We tonen hier aan dat u, door gebruik te maken van een niet-crosslinkend fixatiemiddel in de eenvoudige formaline-nafixatiestap, protocollen kunt gebruiken die oorspronkelijk zijn ontwikkeld en gevalideerd voor formaline-gefixeerd en in paraffine ingebed materiaal, startend vanaf het celmonster, wat resulteert in een goede morfologie, een goede RNA-kwaliteit en goede resultaten voor fuller sense in-situ hybridisatie.De typische hybridisatiecondities zijn niet geschikt voor formalinevrij gefixeerde weefsels om FISH-resultaten te genereren. We hebben aangetoond dat niet de penetratie, maar de chemische correctietijd cruciaal is om vergelijkbare FISH-resultaten te verkrijgen uit pectine-gefixeerd weefsel. Alleen de sectie die voor FISH wordt gebruikt, is formeel en post-gefixeerd.Het overgebleven formalinevrije gefixeerde weefsel maakt een superieure moleculaire analyse mogelijk in vergelijking met FFP-weefsel, zoals aangetoond via RTPCR. De procedure is gedemonstreerd door Daniela Pabst, de technicus uit mijn laboratorium. Begin met het doorsnijden van de borstkankerweefselmonsters met een steriel scalpel in twee helften, beide vier millimeter dik, om een adequate weefselhoeveelheid te garanderen.Gebruik een maximale grootte van 4x15x15 millimeter voor fixatie via een standaard gebufferde formaline-oplossing, of via een alternatieve, niet-crosslinkende, formalinevrije weefselfixatie. Plaats één helft van het tumorbiopt in een standaard weefselcassette en dompel dit onder in SBFS. Plaats de andere helft van het tumorbiopt gedurende 24 uur in de alternatieve fixatievloeistof met een volume-per-volume ratio van vier delen fixatiemiddel en één deel weefsel.Breng vervolgens de alternatief gefixeerde monsters gedurende twee tot 72 uur over naar de stabilisatoroplossing door de houder te openen, de weefselcassette 180 graden te draaien en deze onder te dompelen. Plaats daarna de weefselcassettes met de SBFS-gefixeerde monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een houder gevuld met 70% ethanol om resterend SBFS te verwijderen. Na weefselverwerking en insluiting zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt een microtoom gebruikt om coupes van drie micron uit FFPE- en NCFPE-blokken te snijden.Plaats van elk type coupes enkele exemplaren in een koud waterbad. Neem de drijvende coupe met een fijn penseel op een fijne microscopieglasplaat en breng deze over naar een warm waterbad. Neem de uitgestrekte coupes vervolgens opnieuw met het penseel op de microscopieglasplaat, zonder rimpels.Bereid daarnaast RNA-isolatie voor om reverse transcriptie PCR op hetzelfde monster uit te voeren door van elk type sectie enkele exemplaren in een reactiebuisje te plaatsen. Voor de deparaffinering van weefselsecties hydrateren we de secties stapsgewijs bij kamertemperatuur in kleuringspotten met 250 milliliters van verschillende reagentia. Plaats de secties eerst twee keer gedurende 15 minuten in 100% xyleen en breng de secties vervolgens twee keer gedurende 15 minuten over naar 96% ethanol.Breng vervolgens de coupes stapsgewijs over naar oplossingen met een lager percentage ethanol, waarbij elke oplossing gedurende twee minuten wordt geïncubeerd. Verplaats de coupes tot slot twee keer naar gedestilleerd water voor 10 minuten. Voer de post-fixatie van de NCFPE-preparaten uit door deze 24 uur bij kamertemperatuur in een nieuw kleurpotje gevuld met SBFS te plaatsen.Laat de pot tijdens de 24-urige post-fixatiestap in de zuurkast staan. Opvallend genoeg gaven alle post-fixatietijden langer dan 18 uur resultaten die vergelijkbaar waren met die van formeel gefixeerd paraffinemateriaal. Verwijder het overtollige SPFS van de coupes door ze drie keer 10 minuten te wassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing.Volg dit met een tweede wasbeurt in gedestilleerd water gedurende 10 minuten, twee keer. Plaats vervolgens de kleurpot die 250 milliliters citroenzuur-warmtevoorbehandelingsoplossing bevat in een waterbad van 98 °C. Plaats de gehydrateerde FFPE in post-gefixeerde NCFPE-dia's in de pot en incubeer gedurende 15 minuten.Was daarna de objectglazen gedurende drie minuten bij kamertemperatuur in gedestilleerd water in een nieuwe kleurpot. Plaats de objectglazen voor proteolyse in een temperatuurgecontroleerde hybridisatie op 37 °C. Breng direct de gebruiksklare pepsine-oplossing druppelsgewijs aan op de weefselcoupes totdat deze volledig bedekt zijn.Incubeer vervolgens gedurende negen minuten bij 37 °C in het hybridisatiesysteem. Plaats de coupes daarna in een pot met SSC-wasbuffer en incubeer gedurende vijf minuten. Plaats de coupes gedurende één minuut in gedestilleerd water bij kamertemperatuur.Voer de dehydratie van de coupes uit in een reeks graduele alcoholen, telkens gedurende één minuut. Laat de coupes na de dehydratieserie aan de lucht drogen. Pipetteer voor de hybridisatie 10 µL van de gecombineerde HER2- en sun 17-sonde op de gedroogde weefselcoupes, dek elk monster af met een dekglas en verzegel dit met rubbercement.Denatureer de probe en het specimen-DNA in het hybridisatiesysteem bij 75 °C gedurende 10 minuten. Het hybridisatiesysteem verlaagt automatisch de temperatuur naar 37 °C, waarna de hybridisatie gedurende de nacht doorgaat. Verwijder de volgende dag voorzichtig de rubbercement en de dekglasjes met een pincet voor de post-hybridisatie en bescherming.Incubeer de coupes in een kleurpot met voorverwarmde 1X buffer A bij 37 °C gedurende vijf minuten. Was vervolgens de coupes twee keer gedurende vijf minuten bij 27 °C met voorverwarmde 1X wasbuffer. Dehydrateer de coupes daarna in 70%, 90% en 100% ethanol gedurende één minuut per concentratie.Laat de monsters aan de lucht drogen en bescherm ze tegen licht. Breng voor de kleuring 30 µL DAPI-oplossing aan op het gehybridiseerde gebied, waarbij luchtbellen worden vermeden. Dek de coupes af met een dekglas voordat de coupes gedurende 15 minuten worden geïncubeerd, beschermd tegen licht.Verwijder voorzichtig overtollige DAPI-oplossing door de objectglaasjes zachtjes tussen filterpapieren te drukken. Bewaar de objectglaasjes bij twee tot acht graden celsius in het donker gedurende maximaal twee weken tot de evaluatie via confocale microscopie. Leg de beelden vast met filters voor de groene en oranje kanalen.Ga over tot de interpretatie van de gegevens en de beoordeling van de RNA-kwaliteit zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier wordt de directe vergelijking getoond tussen het resultaat verkregen uit het formeel gefixeerde monster en het niet-crosslinkend gefixeerde monster dat nabehandeld is met fixatie. De signalen vertonen een vergelijkbare intensiteit en de achtergrond is even tevoren vergelijkbaar.In normale interfasecellen is er een gelijk aantal rode en groene signalen dat correspondeert met de HER2-locus en de sen 17-referentielocus, wat aantoont dat er geen amplificatie van het HER2-gen is. Hier wordt het resultaat getoond van een andere casus waarin het HER2-gen is geamplificeerd, waarbij er een veel sterker en breder signaal voor de HER2-locus is dan voor het referentiegen. Dit fenomeen is duidelijk zichtbaar in het formaldehyde-gefixeerde weefsel en in het weefsel dat met een niet-crosslinkende methode is gefixeerd.Deze grafiek toont de amplificatie-efficiëntie voor de verschillende ampliconlengtes van het GAPDH mRNA. Voor formaline zijn ongeveer 23 cycli noodzakelijk, en voor materiaal dat is gefixeerd zonder crosslinking is dit afgenomen tot 20 cycli. Het verschil wordt duidelijker bij langere amplicons, wat aangeeft dat zowel fragmentatie als chemische modificatie aanzienlijk worden verminderd door het gebruik van fixatiemiddelen zonder crosslinking.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe men een door de FDA goedgekeurde sleutel voor FFPN-materiaal kan gebruiken op niet-crosslinkend gefixeerd materiaal door een eenvoudige stap van na-fixatie toe te voegen aan de pre-analytische procedure. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat alleen de sectie die wordt gebruikt voor full sense in-situ hybridisatie wordt na-gefixeerd met formaline, terwijl het resterende blok is gefixeerd in het niet-crosslinkende fixatiemiddel en daarom kan worden gebruikt voor een breed spectrum aan moleculaire analyses. Dit protocol is bijzonder nuttig in de context van moderne gepersonaliseerde geneeskunde wanneer er meerdere analyses moeten worden uitgevoerd op relatief kleine tumoren en het verwerken van weefselmonsters via verschillende protocollen niet haalbaar is.Bovendien heeft het gebruik van een niet-crosslinkend fixatiemiddel het voordeel dat het weefseleigenschappen behoudt, vergelijkbaar met cryopreservatie. Dit voorkomt de noodzaak van bevriezing met vloeibare stikstof en het handhaven van een koelketen in een chemische context. Deze verschillen in RNA-kwaliteit zijn niet direct duidelijk bij het gebruik van klassieke assays voor RNA-kwaliteitscontrole, zoals RNA-integriteitsnummers, aangezien deze assays niet volledig informatief zijn voor de RNA-kwaliteit van RNA dat is geïsoleerd uit gefixeerd en in paraffine ingebed materiaal.

protocol-for-her2-fish-using-non-cross-linking-formalin-free-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een combinatie van verschillende technieken om het verzamelen van gegevens te maximaliseren van muis weefsel wordt gepresenteerd.

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Wij presenteren hier een geoptimaliseerd, gedetailleerd protocol voor dubbele immunokleuring in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties van het centrale zenuwstelsel (CZS) en perifere lymfeklieren (LK) van ratten.

Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

De indirecte immunofluorescentie protocol beschreven in dit artikel laat de detectie en de lokalisatie van eiwitten in de muis borstklier. Een complete methode wordt gegeven voor te bereiden borstklier monsters, om immunohistochemie uit te voeren, om de afbeelding van het weefsel secties met behulp van fluorescentie microscopie, en om beelden te reconstrueren.

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

In dit manuscript presenteren we een hoogdoorvoerige, semi-geautomatiseerde cryohistologieplatform om gealignde composietbeelden te produceren van meerdere responsmaatregelen uit verschillende rondes van fluorescentiebeeldvorming op bevroren secties van gemineraliseerde weefsels.

High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels

Wij protocollen ontwikkeld en ontworpen een aangepaste apparatuur om insluiten van millimeter-schaal specimens. We presenteren monsterbereidingsprocedures met de nadruk op het insluiten in acryl hars en polyimide buizen om rigide immobilisatie en langdurige opslag van specimens voor de ondervraging van architectuur en cel morfologie van weefsels door micro-CT.

Stijve inbedding van vaste en gekleurd, geheel Millimeter-schaal Specimens voor sectie-gratis 3D histologie door Micro-berekend tomografie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC).  Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Hier wordt een geoptimaliseerd stap-voor-stap protocol verstrekt voor fixatie, immunostaining en sectie van embryo's om gespecialiseerde signalering filopodia genaamd cytonemen in ontwikkelende muizenweefsels te detecteren.

Fixatie van embryonaal muisweefsel voor cytoneme-analyse

Leer een nieuwe niet-kruislinkende, formalinevrije weefselfixatiemethode voor HER2 FISH-analyse in borstkankerweefsel. Dit protocol combineert cryobehoud met eenvoudige formaline nabehandeling voor superieure moleculaire diagnostiek.

Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief (Video) | JoVE Journal

Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief

Meer video's verkennen