Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief
25 december 2017
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is vaak vereist in combinatie met histopathologie en moleculaire diagnostiek voor selectie van therapie in gepersonaliseerde geneeskunde. Een nieuwe niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel-fixeerspray waarmee hoge kwaliteit morfologische, moleculaire en vis analyses van het zelfde model door toevoeging van een na fixatie stap voordat vis wordt aangeboden.
Gepersonaliseerde geneeskunde vereist verschillende soorten analyses, van klassieke histologie tot moleculaire analyse, en verschillende in-situ technieken worden uitgevoerd op een tumor om de beste therapie te selecteren. De onderzoekstechnieken maken verschillende analytische technologieën mogelijk vanuit een enkele monster. We tonen hier, door het gebruik van een niet-kruisbindend fixatief in de eenvoudige formalin post-fixatiestap, dat u protocollen kunt gebruiken die oorspronkelijk zijn ontwikkeld en gevalideerd voor formeel en gefixeerd paraffine-ingebed materiaal, die kunnen worden gebruikt vanuit het celmonster en goede morfologie, goede RNA-kwaliteit en goede resultaten voor volledige zin in-situ hybridisatie opleveren.
De typische hybridisatiecondities zijn niet geschikt voor formalin-vrije gefixeerde weefsels om FISH-resultaten te genereren. We onthulden dat het niet de penetratie is, maar de chemische correctietijd die cruciaal is om vergelijkbare FISH-resultaten van pectine-gefixeerd weefsel te bereiken. Alleen de sectie die voor FISH wordt gebruikt, is formeel en post-gefixeerd.
Het resterende formalin-vrije gefixeerde weefsel maakt superieure moleculaire analyse mogelijk in vergelijking met FFP-weefsel, zoals aangetoond door RTPCR. De procedure die we hebben aangetoond door Daniela Pabst, de technicus van mijn laboratorium. Om te beginnen, snijdt u de borstkankerweefselmonsters met een steriele scalpel in twee helften, elk vier millimeter dik om voldoende weefselhoeveelheid te garanderen.
Gebruik een maximale grootte van 4x15x15 millimeter voor fixatie door standaard gebufferde formalineoplossing, of door alternatieve niet-kruisbindende, formalin-vrije weefselfixatie. Plaats de ene helft van het tumormonster in een standaard weefselcassette en dompel deze onder in SBFS. Plaats de andere helft van het tumormonster gedurende 24 uur in de alternatieve fixatiefoplossing met een volume-per-volume verhouding van vier delen fixatief en één deel weefsel.
Breng vervolgens de alternatief gefixeerde monsters over in de stabilisatoroplossing gedurende twee tot 72 uur door de container te openen, de weefselcassette 180 graden te draaien en deze onder te dompelen. Plaats vervolgens de weefselcassettes met de SBFS-gefixeerde monsters in een container gevuld met 70%ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om resterend SBFS te verwijderen. Na weefselverwerking en inbedding zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruikt u een microtoom om drie micronsneden van FFPE en NCFPE-blokken te snijden.
Plaats enkele van elk type sectie in een koud waterbad. Neem de drijvende sectie op met een fijne penseel op een fijne microscoopslide en breng deze over in een warm waterbad. Neem de uitgerekte secties opnieuw op met het penseel op de microscoopslide zonder enige rimpels.
Bereid ook voor RNA-isolatie om omgekeerde transcriptie PCR uit te voeren op hetzelfde monster door enkele van elk type sectie in een reactiebuisje te plaatsen. Voor deparaffinisatie van weefselsecties, hydrateren we de secties stap voor stap bij kamertemperatuur in de kleefpotjes met 250 milliliter van verschillende reagentia. Plaats de secties eerst twee keer gedurende 15 minuten in 100%xyleen, breng de secties vervolgens twee keer gedurende 15 minuten over naar 96%ethanol.
Vervolgens beweegt u de secties door steeds lagere percentages ethanol, waarbij u elke oplossing gedurende twee minuten incubeert. Breng de secties tenslotte twee keer gedurende 10 minuten over naar gedistilleerd water. Voer post-fixatie van NCFPE-slides uit door ze 24 uur lang in een nieuw kleefpotje gevuld met SBFS bij kamertemperatuur te plaatsen.
Laat het potje tijdens de 24 uur durende post-fixatiestap in de afzuigkap. Verrassend genoeg gaven alle post-fixatietijden van langer dan 18 uur resultaten die vergelijkbaar waren met die verkregen met formeel en gefixeerd paraffine materiaal. Verwijder het overtollige SPFS van de slides door ze driemaal gedurende 10 minuten te wassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing.
Volg met de tweede wasbeurt in gedistilleerd water gedurende 10 minuten twee keer. Plaats vervolgens het kleefpotje met 250 milliliter voorverwarmde citroenzuuroplossing in een waterbad van 98 graden Celsius. Plaats het gehydrateerde FFPE in post-gefixeerde NCFPE-slides in het potje en incubeer gedurende 15 minuten.
Was vervolgens de slides gedurende drie minuten bij kamertemperatuur in gedistilleerd water in een nieuw kleefpotje. Voor proteolyse, plaats de slides in een temperatuurgestuurde hybridisatie bij 37 graden Celsius. Breng onmiddellijk de kant-en-klare pepsinoplossing druppelsgewijs aan op de weefselsecties totdat ze volledig bedekt zijn.
Vervolgens incubeert u gedurende negen minuten bij 37 graden Celsius in het hybridisatiesysteem. Plaats vervolgens de slides in een potje met SSC-wasbuffer en incubeer gedurende vijf minuten. Plaats de slides een minuut in gedistilleerd water bij kamertemperatuur.
Voer dehydratatie van de secties uit in een reeks gegradeerde alcoholen, elk gedurende een minuut. Na de dehydratatiereeks, laat de secties aan de lucht drogen. Voor hybridisatie, pipet 10 microliters van de gecombineerde HER2 en sun 17 sonde op de gedroogde weefselsecties, bedek elk monster met een dekglas en verzegel het met rubbercement.
Code denatureer de sonde en specimen DNA in het hybridisatiesysteem bij 75 graden Celsius gedurende 10 minuten. Het hybridisatiesysteem daalt automatisch naar 37 graden Celsius, en hybridisatie gaat door de nacht heen. De volgende dag verwijdert u voorzichtig het rubbercement en de dekglazen met pincetten voor post-hybridisatie en bescherming.
Incubeer de monsters in een kleefpotje met 37 graden Celsius voorverwarmde 1X buffer A gedurende vijf minuten. Was vervolgens de slides twee keer gedurende vijf minuten bij 27 graden Celsius met voorverwarmde 1X wasbuffer. Droog vervolgens de slides in 70%, 90% en 100% ethanol gedurende één minuut voor elke concentratie.
Laat de monsters aan de lucht drogen en bescherm ze tegen licht. Voor kleuring, breng 30 microliters DAPI-oplossing aan op het ge
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw niet-crosslinkend, formalinevrij weefselfixeermiddel dat hoogwaardige morfologische, moleculaire en FISH-analyses mogelijk maakt vanuit hetzelfde preparaat. De methode maakt gepersonaliseerde geneeskundige benaderingen mogelijk door verschillende analytische technieken te integreren vanuit één enkel tumor monster.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Moleculaire Diagnostiek
Achtergrond
- Gepersonaliseerde geneeskunde vereist diverse analyses voor een optimale selectie van de therapie.
- Fluorescentie in-situ hybridisatie (FISH) is cruciaal voor moleculaire diagnostiek.
- Traditionele fixatiemethoden kunnen de weefselkwaliteit voor diverse analyses in gevaar brengen.
- Er wordt een nieuwe fixatiemethode voorgesteld om de kwaliteit van de resultaten te verbeteren.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van een niet-crosslinkend fixatief voor FISH aan te tonen.
- Om resultaten van formaline-gefixeerde en formaline-vrije gefixeerde weefsels te vergelijken.
- Om een protocol te bieden dat meerdere analyses vanuit een enkel specimen integreert.
Gebruikte methoden
- Weefselmonsters van borstkanker werden verdeeld en gefixeerd met behulp van verschillende methoden.
- Postfixatiestappen werden toegepast om de FISH-resultaten te verbeteren.
- Standaardprotocollen voor RNA-isolatie en hybridisatie werden aangepast.
- Confocale microscopie werd gebruikt voor de beeldvorming en analyse van de resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Het niet-crosslinkende fixatiemiddel resulteerde in een goede morfologie en RNA-kwaliteit.
- De FISH-resultaten waren vergelijkbaar met die verkregen uit met formaline gefixeerde weefsels.
- Er werd aangetoond dat de nieuwe fixatiemethode een superieure moleculaire analyse mogelijk maakte.
- Post-fixatietijden langer dan 18 uur leverden optimale resultaten op.
Conclusies
- De nieuwe fixatiemethode maakt hoogwaardige analyses mogelijk vanuit hetzelfde weefselmonster.
- Deze aanpak ondersteunt gepersonaliseerde geneeskunde door meerdere diagnostische technieken te integreren.
- Verdere validatie van de methode zou de toepassing ervan in klinische settings kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt de gelijktijdige conservering van weefselmorfologie en moleculaire integriteit uit één enkel specimen mogelijk, waarmee een belangrijk knelpunt in workflows voor gepersonaliseerde geneeskunde wordt aangepakt, waarbij meerdere diagnostische assays concurreren om beperkt tumorgeweefsel. Door FISH-analyse mogelijk te maken op met formaline gepostfixeerde coupes, terwijl de rest van het blok behouden blijft voor RNA-gebaseerde assays, ondersteunt dit parallelle histopathologie en moleculaire diagnostiek zonder monstersplitsing. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door pre-analytische variabiliteit te verminderen en een directe vergelijking van de HER2-status met transcriptomische gegevens van dezelfde tumor mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gelijktijdige beoordeling van HER2-genamplificatie en RNA-kwaliteit uit aangrenzende weefselcoupes mogelijk, wat bijdraagt aan de mechanistische risicoreductie van therapeutische hypothesen.
- Operationele waarde: Vermindert het weefselverbruik door de behoefte aan afzonderlijke FFPE- en vriesblokken voor histopathologie en moleculaire analyse weg te nemen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerde, FISH-compatibele workflow die de signaalintensiteit en achtergrondequivalentie ten opzichte van FFPE-controles behoudt, wat de reproduceerbaarheid van de assay waarborgt.
- Operationele waarde: Maakt aanpassing van bestaande FISH-protocollen mogelijk via een eenvoudige stap na de fixatie, waardoor revalidatie-inspanningen voor diagnostische laboratoria worden geminimaliseerd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Beoudt een RNA-kwaliteit die superieur is aan FFPE, waardoor downstream-applicaties zoals RT-PCR voor biomarkerbevestiging naast FISH-resultaten mogelijk worden.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale moleculaire profilering van archiefweefsel door cross-linking van nucleïnezuren, die de amplificatie-efficiëntie belemmert, te voorkomen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door FISH-gebaseerde targetvalidatie vroeg in de pijplijn mogelijk te maken, terwijl materiaal voor downstream -omics toepassingen behouden blijft, waardoor een naadloze overgang ontstaat van hypothesetoetsing naar lead-identificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt het toetsen van hypothesen door een directe correlatie mogelijk te maken tussen HER2 FISH-signalen en genexpressiegegevens uit hetzelfde specimen.
- Screening: Levert kwantitatieve FISH-uitkomsten die vergelijkbaar zijn met FFPE, waardoor een betrouwbare beoordeling van de amplificatiestatus van het doelwit in preklinische modellen mogelijk is.
- Analytics: Verschaft HER2/chromosoom 17-signaalratio's en metrieken voor RNA-integriteit die bijdragen aan go/no-go-beslissingen bij de prioritering van doelwitten.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen discovery- en preklinisch werk door de moleculaire analyseerbaarheid van weefsel na FISH te behouden, wat biomarker-gestuurde stratificatie faciliteert.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor weefselpreparatie dat toepasbaar is op diverse oncologische indicaties waarbij gecombineerde FISH en moleculaire profilering vereist zijn.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door het verminderen van fout-negatieven als gevolg van RNA-degradatie en maakt multimodale dataintegratie mogelijk.
- Operationele waarde: Verbetert de efficiëntie van weefselgebruik, wat cruciaal is voor zeldzame of kleine tumorbiopten in de vroege fase van discovery.
- Strategische waarde: Vermindert de risico's bij targetselectie door histopathologie, FISH en moleculaire data uit één enkele biologische context op elkaar af te stemmen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via concordante diagnostische resultaten die biologische ambiguïteit verminderen.
Overwegingen voor de Implementatie
- Vereist expertise in histologie, FISH en moleculaire biologie voor het beheren van duale fixatieworkflows.
- Afhankelijk van toegang tot formaline, niet-crosslinkend fixatief en standaard hybridisatieapparatuur.
- Noodzaakt standaardisatie van de duur van de post-fixatie (>18 uur) tussen teams om vergelijkbare FISH-resultaten te garanderen.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten de validatie van sonde-penetratie en signaalstabiliteit in niet-crosslinkend gefixeerd weefsel voorafgaand aan de post-fixatie met formaline.
- Praktische beperking: Alleen de sectie die voor FISH wordt gebruikt ondergaat post-fixatie met formaline; het resterende deel van het blok blijft ongeschikt voor FFPE-geoptimaliseerde assays die uitgebreide crosslinking vereisen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Tissue Fixation
3:54
Post-fixation of NCFPE Specimens and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)
7:37
Results: Data Analysis of FISH and Real-time Reverse Transcription PCR for Corresponding FFPE and NCFPE Tissue Sections
8:53
Conclusion
