Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van In Utero Elektroporatie

Het algemene doel van deze procedure is om radiaal migrerende neuronen direct te observeren in organotypisch plakjescultuur bereid uit elektroporeerde embryonale hersenen door middel van time-lapse confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van belangrijke aspecten van neocortex ontwikkeling. Het maakt onderzoek mogelijk naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neuron polarisatie en de radiale migratie van neuronen naar hun uiteindelijke positie in de hersenen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de dynamische eigenschappen van migrerende neuronen kunnen worden geanalyseerd, inclusief snelheidsprofielen, gemiddelde migratiesnelheid en ook veranderingen in migratierichting. Begin door een goed verdoofde drachtige muis in rugligging op een verwarmingsplaat te plaatsen. Controleer op afwezigheid van de peesreflex.

En bedek vervolgens voorzichtig de ogen met petroleumgele om te voorkomen dat ze uitdrogen. Verspreid vervolgens voorzichtig de ledematen en bevestig ze met chirurgische tape aan de verwarmingsplaat. Steriliseer de buik door te doppen met 70% ethanol gevolgd door jodiumoplossing, plaats vervolgens steriele gaas, waarin een snede is gemaakt voor de buiksnede, over de buik.

Bevochtig het gaas met bacteriostatische natriumchloride-oplossing. Na herbeoordeling van de ontwikkeling van chirurgische anesthesie, door verlies van de peesreflex, gebruik gekartelde micro Adson-forceps en schuine fijne schaar om de huid ongeveer 1,5 centimeter langs de middenlijn van de buik te snijden. Snijd vervolgens de onderliggende spier langs de linea alba.

Grijp de baarmoederhoorn tussen embryo's met ringforceps en plaats deze voorzichtig op het bevochtigde gaas zonder de placenta's of toevoervaten te verstoren. Positioneer vervolgens voorzichtig een embryo om een duidelijk zicht te geven op de laterale ventrikel die zich presenteert als een halvemaanvormige schaduw parallel aan de sagittale sinus. De injectieplaats ligt in het midden van een lijn tussen het gepigmenteerde oog en de samenvloeiing van de sinussen waar de sagittale sinus zich vertakt naar twee overdrachtssinussen.

Eenmaal geïdentificeerd, duwt u de micro-injectienaald door de baarmoederwand en in de laterale ventrikel. Gebruik vervolgens een micro-injector die met een voetpedaal wordt bediend om een ​​tot twee microliters DNA-oplossing met vijf tot 10 pulsen te injecteren. Succesvolle injectie kan worden gecontroleerd door de gekleurde DNA-oplossing die het ventrikelsysteem zou moeten vullen.

Plaats vervolgens pincet-type elektroden zodat het positieve einde aan dezelfde kant ligt als de geïnjecteerde ventrikel en het negatieve einde aan de tegenoverliggende kant van de geïnjecteerde ventrikel onder het oor van het embryo's hoofd. Bevochtig de elektroporeringsplaats met een paar druppels bacteriostatische natriumchloride-oplossing en breng vijf elektrische stroompulsen van 50 milliseconden aan met tussenpozen van 950 milliseconden. Bubbels bij de negatieve elektrode geven elektrische stroom aan.

60 tot 90 milliampère zijn meestal voldoende voor succesvolle elektroporering. Lagere stromen zullen neuronen niet efficiënt transfecteren, terwijl hogere stromen tot embryonale dood kunnen leiden. Na het herhalen van de procedure voor elk embryo van de eerste baarmoederhoorn, plaatst u deze voorzichtig terug in de buikholte.

Na het hechten van de spierlaag en huid, desinfecteert u voorzichtig met jodiumoplossing en verwijdert u voorzichtig de petroleumgele van de ogen met behulp van cellulose wattenstokken. Plaats de muis onder een infraroodlamp totdat deze wakker wordt. Nadat de drachtige vrouw is geëuthanaseerd met een goedgekeurde methode, verwijdert u de baarmoeder die de embryo's bevat en plaatst deze in een 10-centimeter Petri-schaal met ijskoud compleet HBSS.

Vanaf dit punt verder, houd alle oplossingen, embryo's en hersenen op ijs. Terwijl u onder een stereomicroscoop werkt, gebruikt u fijne forceps en een paar Vannas Tubingen veerscharen om elk embryo van de baarmoeder te scheiden. Breng de embryo's over naar een andere Petri-schaal met ijskoud compleet HBSS.

Maak een incisie ter hoogte van de hersenstam en snijd langs de sagittale middenlijn. Schil de huid en kraakbeen die de hersenen bedekken af. Snijd vervolgens de hersenstam direct achter de hersenhelften af en verwijder de hersenen uit de schedel.

Breng de hersenen over met een microlepel naar een 12-welplate bevattend ijskoud compleet HBSS. Verzamel alle hersenen uit de worp in de 12-welplate. Gebruik vervolgens een fluorescente stereomicroscoop om de hersenen in de 12-welplate te screenen op helderheid van fluoresceren evenals de grootte van het elektroporeerde gebied.

Selecteer twee tot vier hersenen met heldere fluorescente signalen en de veronderstelde somatosensorische cortex voor verdere verwerking. Giet vervolgens gesmolten 3% laagsmeltpunt agarose-oplossing in een wegwerpbare inbeddingsmal. Gebruik een microlepel om de hersenen uit de 12-welplate te verwijderen en laat voorzichtig overtollig compleet HBSS van rond de hersenen afvloeien met behulp van fijn weefselpapier.

Plaats de hersenen voorzichtig in de agarose-oplossing. Gebruik vervolgens een naald van 20 gauge om het naar de bodem van de mal te duwen en pas voorzichtig de positie aan. Voor coronale secties, oriënteer de hersenen met de reukbolletjes naar boven.

Houd de mal op ijs tot de agarose-oplossing is gestold en ga dan verder met het secteren van de hersenen. Gebruik een schone scheermes om overtollig agarose rond de hersenen weg te snijden en laat ongeveer één millimeter agarose over aan alle kanten behalve bij de reukbolletjes waar twee tot drie millimeter agarose moet worden achtergelaten. Nadat u een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm op een specimen hebt aangebracht, bevestigt u de bijgesneden agaroseblok met de reukbolletjes naar beneden gericht.

Breng de monsterfase naar de snijdkamer van een vibrerend mes microtoom bevattend ijskoud compleet HBSS en positioneer de hersenen met de dorsale zijde naar de mes. Snijd 250 micron dikke hersenplakken bevattend het elektroporeerde gebied met een