Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van

Het algemene doel van deze procedure is om radiaal migrerende neuronen in organotypische plakculturen, bereid uit geëlektroporeerd embryonaal brein, direct te observeren middels time-lapse confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van cruciale aspecten van de ontwikkeling van de neocortex. Het maakt onderzoek mogelijk naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de polarisatie van neuronen en de radiale migratie van neuronen naar hun uiteindelijke positie binnen de hersenen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de dynamische eigenschappen van migrerende neuronen geanalyseerd kunnen worden, waaronder snelheidsprofielen, de gemiddelde migratiesnelheid en veranderingen in de migratierichting. Begin met het plaatsen van een correct geanestheseerde zwangere muis in rugligging op een warmteplaat. Controleer op de afwezigheid van de pedaalreflex.

Dek vervolgens de ogen zorgvuldig af met vaseline om uitdroging te voorkomen. Verspreid daarna voorzichtig de ledematen en fixeer deze met chirurgische tape aan de verwarmingsplaat. Steriliseer de buik door deze af te nemen met 70%ethanol gevolgd door een jodiumoplossing, en plaats vervolgens steriel gaas, waarin een inkeping is gemaakt voor de abdominale incisie, over de buik.

Bevochtig het gaas met bacteriostatische natriumchlorideoplossing. Nadat de ontwikkeling van de chirurgische anesthesie is gecontroleerd aan de hand van het verlies van de pedaalreflex, worden gekartelde micro Adson-pincetten en gehoekte fijne scharen gebruikt om de huid ongeveer 1,5 centimeter langs de middenlijn van de buik open te snijden. Snijd vervolgens de onderliggende spier langs de linea alba door.

Pak de uterinehoorn tussen de embryo's vast met ringforceps en plaats deze voorzichtig op het bevochtigde gaas zonder de placenta's of bloedvaten te verstoren. Positioneer vervolgens een embryo zorgvuldig om een duidelijk zicht te krijgen op de laterale ventrikel, die verschijnt als een sikkelvormige schaduw parallel aan de sinus sagittalis. De injectieplaats bevindt zich in het midden van een lijn tussen het gepigmenteerde oog en de confluentia sinuum, waar de sinus sagittalis zich splitst in twee transfer-sinussen.

Zodra geïdentificeerd, wordt de micro-injectienaald door de uterine wand in het laterale ventrikel geduwd. Gebruik vervolgens een micro-injector die met een voetpedaal wordt bediend om één tot twee microliters DNA-oplossing te injecteren met vijf tot 10 pulsen. Een succesvolle injectie kan worden gecontroleerd aan de hand van de gekleurde DNA-oplossing, die het ventriculaire systeem moet vullen.

Plaats vervolgens pincetvormige elektroden zodanig dat de positieve pool zich aan dezelfde zijde bevindt als het geïnjecteerde ventrikel en de negatieve pool zich aan de tegenovergestelde zijde van het geïnjecteerde ventrikel bevindt, onder het oor van de kop van het embryo. Bevochtig de electroporatieplaats met enkele druppels bacteriostatische natriumchlorideoplossing en dien vijf elektrische stroompulsen toe met een duur van 50 milliseconden en intervallen van 950 milliseconden. Bellen bij de negatieve elektrode duiden op de aanwezigheid van elektrische stroom.

Een stroomsterkte van 60 tot 90 milliamperes is gewoonlijk voldoende voor een succesvolle elektroporatie. Lagere stroomsterktes zullen neuronen niet efficiënt transfecteren, terwijl hogere stroomsterktes kunnen leiden tot embryonale sterfte. Nadat de procedure voor elk embryo van de eerste uterine horn is herhaald, wordt deze voorzichtig teruggeplaatst in de buikholte.

Ontinfect na het hechten van de spierlaag en de huid zorgvuldig met jodiumoplossing en verwijder voorzichtig de vaseline van de ogen met cellulosewatten. Plaats de muis onder een infraroodlamp totdat deze wakker wordt. Na het euthanaseren van het drachtige vrouwtje volgens een goedgekeurde methode, verwijdert u de baarmoeder met de embryo's en plaatst u deze in een Petri-schaal van 10 centimeter met ijskoud compleet HBSS.

Houd vanaf dit punt alle oplossingen, embryo's en hersenen op ijs. Gebruik tijdens het werken onder een stereomicroscoop fijne pincetten en een Vannas Tubingen veerschaar om elk embryo van de baarmoeder te scheiden. Breng de embryo's over naar een andere Petrischaal met ijskoud compleet HBSS.

Maak een incisie op het niveau van de hersenstam en snijd langs de sagittale middellijn. Pel de huid en het kraakbeen weg die de hersenen bedekken. Snijd vervolgens de hersenstam vlak achter de hemisferen door en verwijder de hersenen uit de schedel.

Verplaats de hersenen met een microspatel naar een 12-well plaat met ijskoud compleet HBSS. Verzamel alle hersenen van het nest in de 12-well plaat. Gebruik vervolgens een fluorescent stereomicroscoop om de hersenen in de 12-well plaat te screenen op fluorescentie-intensiteit en de grootte van het ge-electroporeerde gebied.

Selecteer twee tot vier hersenen met heldere fluorescentiesignalen en de vermoedelijke somatosensorische cortex voor verdere verwerking. Giet vervolgens gesmolten 3% laag-smeltende agarose-oplossing in een wegwerpbare embedding-vorm die afgepeld kan worden. Gebruik een micro-lepelspatel om de hersenen uit de 12-wellplaat te verwijderen en dep voorzichtig overtollig compleet HBSS rondom de hersenen weg met fijn weefselpapier.

Plaats de hersenen voorzichtig in de agarose-oplossing. Gebruik vervolgens een naald van 20 gauge om deze naar de bodem van de mal te duwen en pas de positie zorgvuldig aan. Voor coronale doorsneden dient u de hersenen zo te oriënteren dat de bulbi olfactorii naar boven wijzen.

Houd de mal op ijs totdat de agarose-oplossing is gestold en ga vervolgens over tot het sectieeren van de hersenen. Gebruik een schoon scheermesje om overtollige agarose rond de hersenen weg te snijden, waarbij ongeveer één millimeter agarose aan alle zijden overblijft, behalve bij de olfactory bulbs, waar twee tot drie millimeter agarose moet blijven. Nadat er een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm op een objectglas is aangebracht, wordt het getrimde agaroseblok vastgezet met de olfactory bulbs naar beneden gericht.

Verplaats de objecthouder naar de snijkamer van een vibratiemicrotoom die ijskoud compleet HBSS bevat en positioneer het brein met de dorsale zijde naar het mes. Snijd hersensecties van 250 micron dik die het geëlektroporeerde gebied bevatten, met een lage tot matige amplitude en een zeer lage snijsnelheid. Gewoonlijk worden er vier tot zes secties met een helder fluorescent signaal verkregen uit elk succesvol geëlektroporeerd brein.

Pak de agarose-rand van een sectie vast met fijne pincetten en trek de plak op een gebogen micro-lepelspatel. Breng de hersenschijfjes op deze manier voorzichtig over naar een zes-wellplaat met ijskoud compleet HBSS. Bevochtig laminine-gecoate membraaninserts met 100 microliters compleet HBSS.

Breng vervolgens de plakjes voorzichtig over naar de membranen met behulp van de gebogen micro-lepelspatel en een pincet. Duw het plakje voorzichtig van de spatel op het membraan en positioneer het daarna met het pincet. Herhaal dit voor de overige plakjes.

Er kunnen tot vijf plakjes op één membraaninsert worden geplaatst. Verwijder het overtollige complete HBSS met een pipet. Plaats vervolgens, met behulp van een pincet, de membraaninserts met de plakjes voorzichtig in een six-well plaat met 1,8 milliliter kweekmedium voor plakjes.

Selecteer een hersensectie voor beeldvorming door de secties via een omgekeerde microscoop te bekijken. Kies een sectie met heldere, individuele neuronen in de bovenste SVZ die radiaal migreren naar het pioppiloppervlak van de sectie. De aanwezigheid van fijne fluorescerende uitlopers van radiale gliacellen die de gehele conjugaatplaat overspannen, wijst op een intact radiaal gliaal steunend raamwerk dat wordt gebruikt door migrerende conjugaatneuronen.

Breng de membraaninsert met een geselecteerde slice over naar een glazen bodemschaal met een diameter van 50 millimeter die twee milliliter slice-kweekmedium bevat. Plaats de schaal in de klimaatkamer van de confocale microscoop. Stel de resolutie in op 512 bij 512 pixels.

Verhoog de scansnelheid van 400 hertz naar 700 hertz om de framerate te verhogen van ongeveer 1,4 naar ongeveer 2,5 frames per seconde. Gebruik maximaal twee keer middeling. Definieer een Z-stack door het geelektroporeerde gebied met een stapgrootte van 1,5 microns.

Start de time-lapse serie door elke 30 minuten een Z-stack op te nemen. De beschreven instellingen maken een voldoende resolutie en helderheid van het beeld mogelijk, terwijl de fotovernietiging tijdens de acquisitie laag blijft. Deze video laat corticale neuronen van E16.5 zien die migreren van de ventriculaire en subventriculaire zones naar de corticale plaat.

In de Bcl11a floxed conditionele transgene muis na electroporatie van het IRES-GFP controleplasmid op embryonale dag 14.5. De film bestaat uit 108 frames met een snelheid van vijf frames per seconde. De schaalbalk vertegenwoordigt 100 microns.

Elektroporatie van een DNA-plasmidevector die Cre-IRES-GFP bevat, beïnvloedde de migratie van corticale neuronen in conditionele Bcl11a floxed hersenen. Zoals hier te zien is, bewegen zeer weinig neuronen voorbij de intermediaire zone om de corticale plaat te bereiken. Deze film toont de polarisatie van corticale neuronen van een GFP-gelabelde controle links, vergeleken met neuronen van een Bcl11a-mutant rechts.

Deze geanimeerde sporen van representatieve controles in Bcl11a-mutante neuronen zijn verkregen uit time-lapse series van E16.5 slice-culturen met een resolutie van intervallen van één uur. Opnieuw worden de gegevens van het controlebrein links getoond en de gegevens van het Cre-IRES-GFP-elektroporeerde brein rechts. Zoals blijkt uit deze verzameling representatieve sporen van controle- en Bcl11a-mutante slice-culturen, ondergaan de Bcl11a-mutante neuronen frequent herhaalde fasen van verminderde migratiesnelheid en willekeurig veranderde oriëntatie, zoals aangegeven door de rode pijlpuntjes.

Snelheidsprofielen kunnen worden berekend op basis van de sporen van migrerende neuronen. Zoals hier te zien is, heeft een groter aandeel Bcl11a-mutante neuronen lagere migratiesnelheden vergeleken met de controles. De afwijkingshoek kan worden berekend uit de sporengegevens.

Zoals te zien is in dit histogram, vertonen de Bcl11a-mutante neuronen, weergegeven door de zwarte balken, grotere afwijkingshoeken in vergelijking met de controles. Zodra deze techniek onder de knie is, kan zowel de in utero elektroporatie als de preparatie van organotypische hersensnijplculturen in minder dan twee uur per procedure worden uitgevoerd. Deze procedure kan eenvoudig worden aangepast voor fractionele analyse van genen van belang in radiaal migrerende corticale neuronen via gain- en loss-of-function, evenals voor vasculaire experimenten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u radiaal migrerende neuronen in organotypische coupesculturen, bereid uit ge-elektroporeerde embryonale hersenen, direct kunt observeren met time-lapse confocale microscopie.