Identificatie en karakterisering van metastatische factoren door genenoverdracht in de roman RIP-Tag; RIP-BTW lymfkliertest Model
16 oktober 2017
We presenteren een protocol om aan te tonen van een roman somatic gene transfersysteem met behulp van RIP-Tag; RIP-BTW muismodel om te bestuderen van de functie van genen in metastase. De aviaire retrovirussen zijn intracardiacally om ervoor te zorgen genenoverdracht in pre-maligne, noninvasive laesies van de cellen van de alvleesklier β in volwassen muizen geleverd.
Het algemene doel van deze procedure is om metastatische factoren te identificeren en te karakteriseren door genoverdracht in het nieuwe RIP-Tag;RIP-tva muismodel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van kankermetastase, zoals het identificeren van de drivers en de nieuwe therapeutische doelen. Het grote voordeel van dit kankermuismodel is het identificeren van metastatische factoren door somatische genoverdracht in precursor-legioenen van pancreas bèta-cellen.
Begin met het oogsten van een 15 centimeter schaal met virusproducerende DF1 cellen per muis die geïnfecteerd moet worden. Verzamel eerst het medium van de confluente 15 centimeter schalen. Verwijder vervolgens celresten door lage snelheid centrifugatie in een voorgekoelde centrifuge gedurende 10 minuten bij 1650 keer G en vier graden Celsius.
Breng vervolgens het virale supernatant over naar polyallomer ultracentrifugebuizen. Spin in een ultracentrifuge gedurende 1,5 uur bij 9540 keer G en vier graden Celsius. Verwijder zoveel mogelijk supernatant uit de ultracentrifugebuizen.
Voeg vervolgens PBS toe aan de ultracentrifugebuis om de uiteindelijke 100 microliter virale suspensie per 15 centimeter schaal te maken. Bedek de buizen met laboratoriumfolie en suspendeer het onzichtbare virale pellet opnieuw door twee minuten op middelhoge snelheid te vortexen. Schud vervolgens de ultracentrifugebuizen gedurende één uur of een nacht bij vier graden Celsius.
Na de incubatie, breng de virale suspensie over in een microcentrifugebuis en ga door met het titreren van het virus. Begin de titratieprocedure door ervoor te zorgen dat de DF1 cellen die in 12 wel weefselkweekplaten zijn gezet, 30% confluentie hebben bereikt. Voor elke bepaling van de virale titer is één twaalf wel plaat nodig.
Begin met een tienvoudige seriële verdunning van de virale supernatanten door eerst vijf microliters van het virale supernatant te mengen met 495 microliters groeimedium in een microcentrifugebuis om een tien tot de tweede verdunning te maken. Vortex kort gedurende enkele seconden. Breng vervolgens 40 microliters van de tien tot de tweede verdunning over naar 360 microliters groeimedium in een microcentrifugebuis voor de tien tot de derde verdunning.
Vortex kort gedurende enkele seconden. Herhaal dit proces om te verdunnen tot tien tot de vierde en tien tot de vijfde. Pipetteer vervolgens 2,25 milliliter groeimedium in elk van de vijf zes milliliter polystyreenbuizen.
En label ze respectievelijk tien tot de zesde, tien tot de zevende, tien tot de achtste, tien tot de negende en tien tot de tiende. Meng 0,25 milliliter van de tien tot de vijfde verdunning met 2,25 milliliter groeimedium in de zes milliliter polystyreenbuis voor de tien tot de zesde verdunning. Vortex kort gedurende enkele seconden.
Herhaal de procedure voor tien tot de zevende, tien tot de achtste, tien tot de negende en tien tot de tiende verdunningen. Verwijder vervolgens het oorspronkelijke kweekmedium van de DF1 cellen op de 12 wel platen. Voeg een milliliter van het verdunde virus toe in elke put in duplicaat.
Laat de cellen groeien bij 37 graden Celsius en 5 CO2 gedurende minimaal zeven dagen. Begin de infectieprocedure door eerst een zeven weken oude RIP-Tag RIP-tva muis te verdoven. Breng oogsmeer aan op beide ogen om hoornvliesdroging te voorkomen.
Scheer het haar van de borstholte van de RIP-Tag RIP-tva muis, plaats de muis op zijn rug met de borst naar boven op een absorberend laboratoriumpapier bovenop een snuggly safe warmer. Voer een teenprik uit om de muis te controleren op niet-responsiefheid en om het volledige anesthesie-effect te bevestigen. Strek de voorpoten uit en zet ze vast met plakband.
Markeer de borst van de muis voor injectie. Markeer de locatie halverwege tussen de sternaal notch en de top van het xiphoïdproces, en iets links anatomisch van het borstbeen. Schrob vervolgens de voorste borstwand met een povidone jodium scrub of een chloorhexidine scrub, gevolgd door een 70% isopropyl alcohol of een 70% ethanol gedrenkte gaasje.
Zuig 50 microliters lucht op in een steriele 28,5 gauge insulinesyringe om ruimte te creëren tussen de plunjer en het meniscus van een 500 microliters spuit. Trek 100 microliters virus op. De luchtrui m zonder enige vloeistof op de wand is cruciaal om de hartslag te zien.
Houd de naald rechtop, houd de huid van de muis strak met één hand en steek de naald in de gemarkeerde locatie. Wanneer een felrode bloedpuls in de spuit verschijnt, stop met het vooruit bewegen van de naald en fixeer de diepte van de naald in de muis met één hand. Gebruik de andere hand om voorzichtig en langzaam de plunjer te duwen om de virale suspensie over een periode van ongeveer 60 seconden af te geven.
Breng 10-20 microliters toe wanneer een felrode bloedpuls in de spuit verschijnt. Het continue binnenkomen van rood zuurstofrijk bloed in de transparante naaldhuid geeft de juiste positionering van de naald in het linker ventrikel aan. Na de laatste duw van de plunjer om de virale suspensie af te geven en voordat de volgende rode bloedpuls wordt gezien, trek de naald snel uit de borstholte.
Breng zachte druk uit over de injectieplaats gedurende minimaal één minuut om de bloeding te verminderen. Breng vervolgens de muis voorzichtig op een verwarmingskussen of onder een lichtlamp totdat deze volledig bij bewustzijn is. RIP-Tag RIP-tva muizen werden geïnfecteerd met de aangegeven RCASBP-Bcl-xL retrovirus op zeven weken leeftijd en geëuthanaseerd op zestien weken leeftijd.
Deze foto toont representatieve synaptofysinekleuring van metastatische pancreatische neuro-endocriene tumoren in pancreaslymfeklieren. Hier werden de RIP-Tag RIP-tva muizen geïnfecteerd met de aangegeven RCASBP-RHAM B. Deze foto toont de representatieve synaptofysinekleuring van metastatische pancreatische neuro-endocriene tumoren in pancreaslymfeklieren. Hier wordt de synaptofysinekleuring gezien in de lever na injectie van het RCASBP-RHAMM B virus.
Het is belangrijk om te onthouden dat een titel van me
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor een nieuw somatisch gentransfer-systeem met gebruik van het RIP-Tag; RIP-tva muismodel om genfuncties bij metastase te onderzoeken. De methode omvat intracardiale toediening van aviaire retrovirussen om premaligne pancreatische β-cel laesies bij volwassen muizen te targeten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Gentherapie
Achtergrond
- Het begrijpen van kankermetastase is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
- Het RIP-Tag; RIP-tva muismodel maakt gerichte genoverdracht mogelijk.
- Aviaire retrovirussen kunnen worden gebruikt voor efficiënte genoverdracht.
- Deze aanpak richt zich op precursorlaesies van pancreasaβ-cellen.
Doel van de studie
- Het identificeren en karakteriseren van metastatische factoren via gentransfer.
- Het verkennen van potentiële therapeutische doelwitten voor de behandeling van kanker.
- Het verdiepen van het begrip van de mechanismen die metastase aansturen.
Gebruikte methoden
- Oogsten van DF1-cellen voor virusproductie.
- Opvangen en centrifugeren van celkweekmedium.
- Intracardiale toediening van retrovirussen aan doellaesies.
- Karakterisering van genfunctie in metastatische processen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gentransfer in pancreas β-cel laesies.
- Identificatie van sleutelfactoren die betrokken zijn bij metastase.
- Potentiële nieuwe therapeutische doelwitten voor kankerbehandeling.
- Validatie van het RIP-Tag; RIP-tva model voor kankeronderzoek.
Conclusies
- Het protocol demonstreert een effectieve methode voor het bestuderen van metastase.
- De bevindingen kunnen leiden tot vooruitgang in kankertherapieën.
- Het RIP-Tag; RIP-tva model is een waardevol instrument voor toekomstig onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol maakt de systematische identificatie van genen mogelijk die metastase aansturen in een goed gedefinieerd model voor pancreatische neuroendocriene tumoren, waarmee een kritisch hiaat in de preklinische targetvalidatie wordt opgevuld. Door somatische gentransfer in premaligne laesies mogelijk te maken, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie van kandidaat-therapeutische targets voorafgaand aan kostbare in vivo studies. De 100% tumorpenetrantie van het model en de gedefinieerde progressiestadia bieden een reproduceerbaar platform voor het beoordelen van genfuncties bij metastasering, wat direct bijdraagt aan de betrouwbaarheid van targets en beslissingen over portfoliotriage in de oncologische geneesmiddelenontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door te testen of specifieke genen metastase in vivo bevorderen of onderdrukken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van somatische gentransfer om kiemlijnbeperkingen te omzeilen, wat het snel testen van meerdere kandidaten binnen dezelfde genetische achtergrond mogelijk maakt.
- Voorspellende waarde: Identificeert metastase-bevorderende factoren onafhankelijk van apoptose, zoals aangetoond met BCL-xL, waardoor niet-canonieke mechanismen aan het licht komen die bij standaardassays over het hoofd kunnen worden gezien.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert metastatische en niet-metastatische isogene cellijnen vanuit dezelfde tumorachtergrond, waardoor een gecontroleerde vergelijking van genfuncties bij invasie en kolonisatie mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Aviaire retrovirale vectoren bereiken een hoogefficiënte infectie van TVA-expresserende cellen, wat de schaalbare productie van gemodificeerde cellijnen voor downstream-assays ondersteunt.
- Klaarheid voor assay: Virale titers >1x10^8 IU/mL waarborgen een consistente in vivo infectie, wat een kwantitatieve benchmark biedt voor de experimentele reproduceerbaarheid over verschillende studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Karakteriseert metastatische factoren in een model dat de stadia van menselijke tumorigenese recapituleert, van hyperplasie tot invasief carcinoom, wat de translationele relevantie vergroot.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale tracking van metastasering naar organen zoals de lever en lymfeklieren mogelijk via immunohistochemie, wat de histopathologische validatie van geneffecten ondersteunt.
- Risicobeperking: Identificeert genen die metastasering aansturen zonder dat de vorming van een primaire tumor vereist is, waardoor middelen kunnen worden gefocust op bonafide regulatoren van metastasering.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het genereren van hypothese-targets tot preklinische validatie, en maakt specifiek de functionele validatie mogelijk van metastase-geassocieerde genen die zijn geïdentificeerd via omics of screeningcampagnes.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door gain- of loss-of-function-studies in metastatische paden binnen een gedefinieerd tumormodel mogelijk te maken.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, genetisch gemodificeerde cellijnen die kunnen worden gebruikt in invasie-, migratie- of kolonisatie-assays om hits uit primaire screenings te prioriteren.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve readouts van de metastatische last via tumorincidentie in organen en histopathologische scoring, wat statistische vergelijking tussen condities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genfunctie met metastatische progressie in een klinisch relevante orgaanlocatie, wat de afstemming van biomarkers voor downstream validatie ondersteunt.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het RIP-Tag;RIP-tva-model en het DF1-gebaseerde retrovirale systeem kunnen in meerdere projecten worden hergebruikt, waardoor de herontwikkelingskosten voor metastasestudies worden verlaagd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de metastatische functie van genen te isoleren van hun effecten op de primaire tumorgroei of apoptose.
- Operationele waarde: Standardiseert de genoverdracht via intracardiale injectie met gedefinieerde virale titers, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert en de variabiliteit in metastase-assays vermindert.
- Strategische waarde: Onderbouwt go/no-go-beslissingen door echte drijvers van metastase te onderscheiden van passagiersalteraties, waardoor investeringen in foutpositieven worden voorkomen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde metastase-bevorderende of -onderdrukkende activiteit, wat de kapitaalefficiëntie in oncologie-pipelines verbetert.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muizenchirurgie, de omgang met virussen en protocollen voor biosafety level 2 voor het gebruik van aviaire retrovirussen.
- Afhankelijk van ultracentrifugatie-apparatuur voor virale concentratie en titering via infectie-assays in DF1-cellen.
- Vereist standaardisatie van de virale titer (>1x10^8 IU/mL) en het injectievolume (100 µL) over alle experimenten om een consistente targeting van laesies te waarborgen.
- Beperkt tot TVA-expressiemodellen; adaptatie naar andere systemen vereist de generatie van corresponderende receptor-positieve lijnen.
- De beoordeling van metastase is afhankelijk van histologie bij het eindpunt, wat gespecialiseerde pathologische ondersteuning vereist voor de detectie van laesies in organen zoals de lever en lymfeklieren.
