High-throughput analyse van Locomotor gedrag in de Drosophila eiland Assay

Het algemene doel van de Island Assay is het evalueren van het basislocomotiegedrag van Drosophila melanogaster middels automatische gegevensverwerking en objectieve kwantificering. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke regulatoren van het locomotiegedrag te identificeren, zoals genen die betrokken zijn bij bewegingsstoornissen. Het kan worden ingezet om geneesmiddelen te testen die dergelijke defecten kunnen omkeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een high-throughput kwantificering van het locomotorisch gedrag van Drosophila mogelijk maakt, waardoor deze techniek geschikt is voor grootschalige screenings. We hebben besloten deze methodologie te ontwikkelen om een groot aantal ziektemodellen te kunnen analyseren. Om dit haalbaar te maken, hadden we behoefte aan geautomatiseerde analyse van beeldgegevens.

Een visuele demonstratie van deze methode is zeer nuttig. Verschillende stappen van de bèta-verwerking zijn cruciaal en kunnen moeilijk zijn voor nieuwe gebruikers, vooral voor zij die niet bekend zijn met de gebruikte softwarepakketten. Bereid eerst minimaal drie vials per experimentele conditie voor als biologische replica's.

Elk bestand moet ongeveer 15 vliegen van hetzelfde geslacht en een vergelijkbare leeftijd bevatten. Het is essentieel dat de vliegen intacte vleugels hebben. Maak de mappen aan om de experimenten op te slaan.

Genereer deze in een mappenstructuur die is gedefinieerd door de condities en herhalingen. Als het experiment bijvoorbeeld twee genotypen heeft met elk vijf herhalingen, maak dan een hoofdmap aan met de datum van het experiment en maak binnen die map één submap per genotype. Maak vervolgens binnen de genotypemappen submappen aan voor elke herhaling.

Stel vervolgens de testapparatuur op. Voeg koud water met een kleine hoeveelheid zeep toe aan de badtray en plaats het platform in het midden van het bad, indien dit nog niet in het bad is bevestigd. Dek de tray en het platform af met een transparante box.

Om het platform te verlichten, plaatst u een koele lamp, zoals gewone 12 volt LED's, erboven. Plaats daarnaast een webcam die is verbonden met een computer direct boven het platform. Open op de computer de software voor beeldopname.

Select via het menusysteem de juiste webcam als opnameapparaat. Plaats een dode vlieg op het eiland om de video-instellingen aan te passen. Optimaliseer de helderheid, het contrast en de kleur in de software, zodat de dode vlieg zwart verschijnt tegen een witte achtergrond.

Pas vervolgens de instellingen van de time-lapse movie aan om de films als AVI-bestanden op te slaan. Blader daarna naar de directory waar de gegevens moeten worden opgeslagen en bepaal de naam van de movie. Sla deze wijzigingen op.

Kies voor de compressie van de beeldata de Intel IYUV-code. Stel de opnamesnelheid in op één frame per 0,1 seconde en pas de bijbehorende afspeelsnelheid aan naar 10 beelden per seconde. Ga tot slot naar de geavanceerde instellingen en selecteer Create a bmp image for each captured frame.

Navigeer vervolgens naar dezelfde directory die u heeft gekozen voor het hosten van de AVI-bestanden en klik op oké. Controleer voordat u begint of de island leeg en schoon is. Start vervolgens de opname in de interface voor time-lapsebeelden van de software voor beeldregistratie.

Neem een flacon met vliegen en tik deze twee of drie keer aan om alle vliegen naar de bodem te laten vallen. Verwijder vervolgens snel de stop uit de flacon en tik de vliegen krachtig op het platform. Ze moeten alledaag ongeveer op hetzelfde moment op het platform landen.

Geef de vliegen tot 30 seconden de tijd om het platform te verlaten en stop daarna de opname. Verwijder indien nodig handmatig alle overgebleven vliegen van het platform. Zorg ervoor dat u de map waarin de volgende set gegevens moet worden opgeslagen opnieuw definieert voordat u doorgaat naar het volgende experiment.

De eerste taak is het produceren van stacks en projecties van de verzamelde beeldserie. Open in Fiji de Drosophila Island Assay. Voer in het nieuwe venster de identificatie van de eerste beeldtijdserie in.

Select vervolgens alleen de sub-macro voor het maken van de stack en projectie. Klik op oké en stuur de computer naar de map die alle submappen met individuele Island Assay-experimenten bevat. Na het verwerken van de gegevens verschijnen er in elke individuele experimentele submap twee nieuwe bestanden.

De volgende taak is om de exacte locatie van het platform in de beelden te definiëren. Open de grafische interface en selecteer het selectievakje 'define platform'. Kies vervolgens de directory waarin de experimentele submappen zijn opgeslagen.

Het projectiebeeld en twee vensters zullen openen. Teken in het eerste beeld met het polygoon-selectiehulpmiddel een veelhoek over het perroneiland. Neem de randlijn aan de perimeter van het platform niet mee in deze selectie.

Voeg de selectie toe aan het ROI-manager-venster door op 'add' in het ROI-manager-venster te klikken. Nadat de selectie aan de ROI-manager is toegevoegd, verschijnt deze als een set waarden. Klik vervolgens op 'okay' in het venster 'define the platform'.

De software gaat over naar de volgende projectieafbeelding die in de map is opgeslagen. Pas dezelfde ROI voor het platform toe op de volgende projectieafbeelding door de in de ROI-manager opgeslagen ROI te selecteren en deze ROI te bevestigen in het venster 'platform definiëren'. Controleer voordat u naar de volgende projectieafbeelding gaat of het platform tijdens het experiment niet is verschoven.

Indien de positie van het platform is verschoven, klik dan met de linkermuisknop in het midden van de selectie en sleep deze naar de gewenste positie. Als het selectievak niet overeenkomt met het platform, klik dan met de linkermuisknop buiten de selectie en baken met de polygoontool een nieuwe selectie voor het platform af. Voeg deze nieuwe selectie toe aan de ROI-manager.

Verifieer vervolgens de nieuwe selectie door op oké te klikken in het venster 'define platform' en zet de procedure voort totdat alle afbeeldingen correct gedefinieerde platforms hebben. De laatste taak vóór het verwerken van de gegevens is het definiëren van de minimale grootte voor een vlieg. Dit wordt toegelicht in het tekstprotocol.

Om de vliegen die van het platform ontsnappen te kwantificeren, stelt u eerst de minimale vlieggrootte in. Geef vervolgens het grootste aantal vliegen in een bestand binnen de experimentele serie aan. Start de analysefunctie en selecteer, wanneer u daarom wordt gevraagd, de hoofdmap voor het experiment.

Let na het uitvoeren van de macro op het feit dat er in elke map een nieuw resultatenbestand en een nieuwe beeldstack zijn verschenen. Open deze bestanden om te controleren of de procedure correct is verlopen. Start het softwarepakket R of RStudio en open het analysescript voor de Island Assay om alle experimenten gelijktijdig te verwerken.

Het script moet correct worden bewerkt om de analyse te laten slagen. Voeg in rij 16 van het script het pad in naar de hoofdmap die de te analyseren experimenten bevat. Voeg in rij 19 het pad in naar de map waarin de outputbestanden van de analyse moeten worden opgeslagen.

Dat laatste moet een locatie zijn die verschilt van de map waarin de te analyseren beeldengegevens zich bevinden. Voer nu het script uit via de werkbalk en ga verder met het analyseren van de resultaten. Het script Island Assay analysis exporteert een lijngrafiek voor elke experimentele conditie.

De grafiek toont het percentage vliegen dat na verloop van tijd op het platform is gebleven voor elke herhaling van die conditie. De geëxporteerde lijngrafiek, escape response:all conditions, vat het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde van de vluchtontsnappingsrespons samen voor de eerste 12 experimentele condities in de hoofdmap. De oppervlakte onder de curve voor elke experimentele herhaling wordt berekend om te bepalen of de experimentele condities significant van elkaar verschillen.

De oppervlakte onder de curve en de mediaanwaarde voor elke experimentele conditie worden geëxporteerd als een grafiek. Afhankelijk van het aantal condities in de hoofdmap voert het script ofwel een tweezijdige ongepaarde Welch T-test uit voor twee condities, of een ANOVA met Tukey-correctie voor meer dan twee condities. Alle numerieke gegevens die door de Island Assay-analyse van het script zijn berekend, worden tevens geëxporteerd en opgeslagen als csv- of txt-bestanden in de map voor gegevensuitvoer.

Ataxia telangiectasia is een autosomaal recessieve bewegingsstoornis die wordt veroorzaakt door mutaties in het ATM-gen. De ziekte kenmerkt zich door een vroegtijdige onset van cerebellaire ataxie. Het effect van een ubiquitaire knockdown van de vliegenortholoog van ATM werd onderzocht in de Island Assay en vergeleken met controles.

Over het algemeen leidde een alomtegenwoordige knock-down van Tefu, de ortholoog van ATM in de vlieg, tot een significante afname van de locomotorische prestaties in de Island Assay in vergelijking met de genetische achtergrondcontroles. Handmatige analyse van de opgenomen Island Assay-gegevens gaf hetzelfde resultaat als de geautomatiseerde analyse. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de Island Assay uitvoert, hoe u de Drosophila Island Assay-macro draait en hoe u het Island Assay-analysescript bedient.

Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de beeldsegmentatie correleert met de kwaliteit van de video's. Hoe beter het contrast, hoe soepeler de analyse verloopt. Na de ontwikkeling van deze techniek is het voor onderzoekers mogelijk om de locomotorische vaardigheden van Drosophila op een high-throughput wijze te onderzoeken.

Na het uitvoeren van deze assay kunnen andere assays, zoals die voor het testen van negatieve geotaxis, worden gebruikt om locomotorische defecten verder te onderzoeken.