Met resolutie muis optische coherentie tomografie steun intraoculaire injectie in het netvlies gentherapie onderzoek

Het algemene doel van deze subretinale injectieprocedure is om een vector op een minimaal invasieve en reproduceerbare manier aan het netvlies te leveren die in real-time waarneembaar is. Hallo, deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen te beantwoorden in gentherapie onderzoek over vector levering werkzaamheid en therapeutische agent toxiciteit. Enkele voordelen van deze techniek zijn minimale schade aan het netvlies en andere oogstructuren, nauwkeurige injectie site mapping, en rigoureuze kwantitatieve in vivo metingen die solide statistische gevolgtrekking mogelijk te maken.

Voor intraoculaire transgene injectie, eerst plaats een verdoofde muis op het kijkstadium van een retinale imaging systeem microscoop en plaats de uiteinden van een steriele stompe iris tang op de zeven en 10 uur posities van het ooglid, terwijl het duwen van de tangen open en omlaag om voorzichtig te induceren proptose. Gebruik de tangen om de oogleden onder de oogbol te overhalen en het puntje van de naald te leiden tot ongeveer een tot 1,5 millimeter onder de rand van het hoornvlies limbus. Breng vervolgens een druppel steriele PBS-oplossing aan op het oog en bedek het oog met een steriele afdekbrief.

Rijd de naald voorzichtig in het oog door het bindvlies totdat een sclerale depressie is gemaakt. Gebruik de micro manipulator om het oog omhoog te draaien totdat de sclerale depressie scherp is, dan rijden de naald naar voren om een scherpe piek in het netvlies te creëren met het puntje van de naald. Met behulp van de naaldhouder draait u de naald tot het puntje van de naald door de sclera en de RPE wordt geboees, zodat de meelescein in de punt van de naald zichtbaar is onder het netvliesweefsel in de directe nabijheid van de subretinale ruimte en het retinale pigment epitheelcelmonolaag.

Drijft de punt van de naald naar beneden, zodat het raakvlakken is met de aardbol en activeer vervolgens de injectiepomp met de voetpedaalschakelaar. Nadat 0,5 tot 1 microliter transgene oplossing is geleverd aan de subretinale ruimte, trek de naald en bevestig dat het bloed stabiel is en dat vloeistof niet lekt uit de injectiekanaal site. Om het succes van de injectie te bevestigen, registreert u een rechthoekig volume OCT en vergelijkt u de afbeeldingen met afbeeldingen van de verschillende soorten potentiële injectieresultaten.

Na bevestiging van de juiste injectieplaatsing, gebruikt u die rechthoekige OCT-afbeelding om de omvang van de bleb in kaart te brengen op de fundus-afbeelding. Als u de omvang van de subretinale bleb in kaart wilt brengen, opent u een rechthoekig volume OCT-afbeelding van de bleb, zodat een herkenbaar oriëntatiepunt in het oog in de afbeelding is opgenomen. Voeg zoveel remklauwen toe als nodig is om de positie van de linker- en rechterranden van de B-scan te identificeren, evenals het oog met de oogzenuw, ONH, indien aanwezig, en het buigpunt waar het netvlies loskomt van de RPE en choroïde en sla de gegevens op.

Compileer vervolgens de opgeslagen bestanden en plot de gegevens, effectief het creëren van een kaart van de injectie bleb op de en face OCT afbeelding. Belay de geploste gegevens op de fundusafbeelding met de injectieplaats en sla de samengevoegde afbeelding op. Gebruik deze afbeelding om gebieden te vinden die van belang zijn tijdens de follow-up OCT-beeldvorming.

Als u de retinalededegeneratie van na de injectie wilt beoordelen, opent u eerst een opgenomen spectrale domein OCT of HRSD OCT-rechthoekige volumeafbeelding en selecteert u een B-scan die moet worden gemeten. Vergroot de geselecteerde afbeelding totdat deze het scherm vult en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding. Klik op remklauwen om het juiste aantal remklauwen te selecteren en gebruik vervolgens de functie remklauw configureren om de remklauwen als verticaal in de kolom van het hoekblok toe te wijzen en schakel de remklauwlocatie in om een uniforme remklauwplaats over het netvlies te vergemakkelijken.

Klik op toepassen en verplaats elke remklauw naar de juiste locatie 0,1 tot 0,2 millimeter uit elkaar over de B-scan, waarbij u ervoor zorgt dat u een remklauw in het midden van het oogzenuwkop plaatst, indien van toepassing. Wanneer alle remklauwen zijn geplaatst, klikt en sleept u elke remklauw naar de lengte van het gebied van belang, waarbij willekeurig remklauwen worden ingesteld die meetbare gebieden van de B-scan niet tot maximale lengte overlayen. Om de buitenste kernlaagdikte te meten, plaatst u de bovenkant van elke remklauw op het externe beperkende membraan en de onderkant van elke remklauw aan de onderkant van de buitenste plexiforme laag op 0,1 tot 0,2 millimeter stappen over het netvlies.

Nadat alle remklauwen zijn geplaatst en aangepast aan de grootte, klikt u met de rechtermuisknop op de afbeelding en klikt u op remklauwgegevens",herhaal vervolgens de metingen zoals die voor elke tiende B-scan zijn aangetoond, waarbij de remklauwen open en op dezelfde locatie op de x-as blijven en de lengtes van de remklauwen zo nodig worden aangepast, zonder ze in de x-richting te verplaatsen. Wanneer alle scans zijn gemeten, opent u de opgeslagen gegevensbestanden en klikt u op gewijzigde datum om de bestanden te rangschikken op basis van de opgeslagen tijd. Open alle bestanden voor elke gemeten B-scan en compiler de ruwe gegevens van elke B-scan in één bestand van het laagste tot het hoogste framenummer en selecteer de kolommen met gegevens, inclusief de naam van de remklauw, de lengte en de x-kolommen in het midden.

Zorg ervoor dat het centrum X hetzelfde is voor alle B-scans gemeten voor elke rechthoekige volume OCT-afbeelding verwerkt en verwijder alle gegevens uit de remklauwen die niet zijn gebruikt om metingen op te nemen. Stel de remklauw in het midden van de oogzenuwkop op nul en zet de gegevens voor X versus meerdere Y-gegevenssets in om een 3D-plotfunctie te krijgen voor de dikte van de buitenste kernlaag of een andere gemeten netvlieslaag. Vergelijk vervolgens de buitenste kernlaagmetingen tussen de controle en proefdieren met overeenkomstige leeftijden om de snelheid en uniformiteit van eventuele netvliesdegeneratie te bepalen.

Voor 3D-mapping van de retinale metingen, bekijk de post-injectie OCT beelden en let op alle identificeerbare oriëntatiepunten, dan positie van het dier om een follow-up SDO CT-beeld te verkrijgen uit dezelfde regio, waarbij ervoor wordt gezorgd dat dezelfde identificeerbare oriëntatiepunten, en het verwerken van de opgenomen beelden zoals net aangetoond. Het is zeer belangrijk om hoogwaardige OCT-beelden te verkrijgen die identificeerbare oriëntatiepunten bevatten om de eerder geïnjecteerde netvliesgebieden te vergemakkelijken. Om de veranderingen in os lengte te meten, werden remklauwen geplaatst van het externe beperkende membraan tot het Brooks membraan, waardoor betrouwbare metingen mogelijk zijn omdat deze lagen gemakkelijk te herkennen zijn in OCT-beelden.

Verschillen in de metingen tussen deze lagen van verschillende muislijnen werden toegeschreven aan kortere buitenste segmentlengtes. Als de subretinale injectie met succes wordt uitgevoerd, veroorzaakt de opening van de subretinale ruimte de productie van een bleb die duidelijk kan worden gevisualiseerd, zowel in de en face view van de HRSD OCT imager als in de B-scanbeelden. Het overhouden van de randkaart van de injectieplaats maakt segmentatie van de retinale weefselmetingen en remklauwpositiegegevenssets mogelijk om latere statistische tests van de effecten van specifieke therapeutische middelen op retinale degeneratie mogelijk te maken.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden voltooid in tien minuten indien goed uitgevoerd. Tijdens een poging deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de chirurgische omgeving schoon en steriel te houden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van gentherapie om het volledige subretinale chirurgische injectieproces in real-time te monitoren en creëerde een manier om onmiddellijk chirurgisch succes in vivo te bepalen.

Na deze injectieprocedure kunnen OCT en andere methoden zoals elektroretinografie worden uitgevoerd om aanvullende vragen over transgene functionele redding en/of toxiciteit te beantwoorden. Na het bekijken van deze video, moet u een begrip hebben hoe transsclerale en transchoroidale subretinale injecties uit te voeren, hoe de omvang van de injectie bleb kaart op de OCT van dit beeld, en het verkrijgen van rigoureuze metingen van de buitenste retinale lagen. Vergeet niet dat het werken met gentherapie vectoren gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen altijd moeten worden gebruikt tijdens het uitvoeren van deze procedure.