Name: Inductie en diagnose van tumoren in Drosophila Imaginal Disc Epithelia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer tumoren induceren en classificeren in Drosophila imaginal discs met het GAL4-UAS systeem. Deze methode maakt betrouwbaar onderzoek naar tumorgenese en kankerdynamiek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken J. Vaughen voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 en The Takeda Science Foundation Research Grant aan YT

1. Vliegkruisen en kloneninductie <ol><li> Verwijder alle vliegen in de flesje 12 uur voordat u maagvliegen verzamelt. </li><li> Verdoof de vliegen in de flesje door CO 2 -gas te injecteren en vliegen op een CO 2- vliegblok te plaatsen. </li><li> Breng 10 tot 20 maagden en 10 mannetjes van het CO 2 vliegblok in een nieuwe injectieflacon en incubeer gedurende 1 dag bij 25 ° C. </li><li> Breng deze vliegen in een nieuwe fles en incubeer gedurende 12 uur bij 25 ° C. OPMERKING: Verwijder de eerste injectieflacon aangezien maagden geen voldoende eieren op de eerste dag leggen. </li><li> Voor enhancer-GAL4 lijnen, verwijder de volwassen vliegen en incubeer de injectieflacon bij 25 ° C tot dissectie. </li><li> Voor inductie van mozaïekklonen door flip-out-GAL4, verwijder de volwassen vliegen en incubeer de flesje gedurende 2 - 4 dagen bij 25 ° C. De incubatietijd voor warmtechok hangt af van het experimentele doel. Een hitte schok 2 dagen na het ei afzetting (AED) genereert mozaïekklonen in onvolwassen tweedeInstar imaginale epithelia. Een hitte schok na 3 of 4 dagen AED genereert mozaïekklonen in gedifferentieerde vroege tot midden derde instar imaginale epithelia. OPMERKING: Het is belangrijk om het effect van veranderde warmteschoktijd op tumorige fenotypes te onderzoeken. </li><li> Voor inductie van mozaïekklonen door flip-out-GAL4, schud de flesje door onderdompeling in een waterbad van 37 ° C gedurende 10 - 45 minuten, gevolgd door incubatie gedurende 2 - 3 dagen bij 25 ° C. OPMERKING: Informatie over warmteschoktijd, timing en incubatietijd in elk experiment wordt weergegeven in de figuurlegendes. </li></ol> 2. Dissectie van Larven <ol><li> Verzamel wandelende derde-instarlarven met een houten stok of stompe tangen, genotype ze door middel van geschikte fluorescerende markers ( bijv . EGFP) onder een fluorescentie stereoscopische microscoop en plaats ze in een dissectie schotel met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing). </li><li> Was de larven in PBS door pipettering met 2 ml plastic overdrachtpipetten. </li><li>Knijp het middelpunt van de larve met een pincet en scheur het lichaam in de helft met de andere pincet. </li><li> Knijp de mondhaken van de voorste helft met één pincet en duw de mond naar het lichaam met de andere pincet om het lichaam naar buiten te draaien. </li><li> Verwijder onnodige materialen zoals speekselklieren of vetlichamen met tang. </li></ol> 3. Bevestiging en antilichamenverf <ol><li> Zet de dissecteerde voorste helft van het larvenlichaam (inclusief imaginale vleugelschijven) over op een 1,5 ml plastic buis en fixeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur in 1 ml Fix oplossing (4% Formaldehyde in PBS) met zachte rotatie. VOORZICHTIG: Formaldehyde is giftig en heeft kankerverwekkend vermogen. Draag beschermende handschoenen en kleding om contact met de huid te voorkomen. OPMERKING: In dit deel vinden alle stappen plaats op een nutator bij kamertemperatuur in het donker tenzij anders vermeld. </li><li> Verwijder de Fix oplossing en weggooi. Was de weefsels met 1 ml PBT (0,3% TritOp X-100 in PBS) drie keer gedurende 15 minuten elk. </li><li> Verwijder de PBT en voeg 1 ml PBTG (0,2% runder serumalbumine en 5% normaal geiten serum in PBT toe) om 1 uur bij kamertemperatuur of nachts bij 4 ° C te blokkeren en te mengen. </li><li> Verwijder PBTG en voeg primaire antilichaamoplossing toe die geschikt is met PBTG (zie Materialetafel ) en voeg de nacht toe bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de primaire antilichaamoplossing en wrijf de weefsels met 1 ml PBT drie keer gedurende 15 minuten elk. </li><li> Verwijder PBT en voeg secundaire antilichaamoplossing toe die geschikt is met PBTG (1: 400). Meng gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder secundaire antilichaamoplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende 15 minuten elk. </li><li> Om F-actin te vlek, verwijder PBT en voeg Phalloidin-oplossing toe die geschikt is verdund in PBS (1:40). Doe dan 20 min. Verwijder de Phalloidin oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende 15 minuten elk. </li><li> Om nucleair DNA tegen te gaan, verwijder PBT en voeg DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool) oplossing (0,5 μg / ml DAPI in PBS) toe. Doe dan 10 min. VOORZICHTIG: DAPI heeft kankerverwekkend vermogen. Draag beschermende handschoenen en kleding om contact met de huid te voorkomen. </li><li> Verwijder DAPI-oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende 15 minuten elk. </li><li> Spoel eenmaal in 1 ml PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder PBS en voeg 500 μL 100% glycerol toe als het voormontagemedium. </li></ol> 4. Montage op Microscope Slides <ol><li> Plaats de gekleurde weefsels op een microscoopschuif met een 2 ml plastic transfer pipette. </li><li> Plaats de weefsels op druppels montagemedium op een andere microscoopschuif met tang. </li><li> Houd het uiteinde van het gedissende weefsel vast met een pincet en trek de hersen- en oogantenne schijven met de andere pincet. OPMERKING: houd de gedissendeerde hersenen in de buurt van de vleugel-imaginale schijven. De hersenen fungeren als een platform waardoor de coverlip de vleugel-imaginale schijven niet vergrijst. </li><li> Om de vleugel-imaginale schijven te isoleren, houd het uiteinde van het gedissende weefsel vast met een pincet en schud de lichaamswand voorzichtig en schroef de schijven met de andere pincet af. OPMERKING: Als het moeilijk is om vleugel-imaginale schijven te vinden, schil de luchtpijp van de achterzijde naar de voorkant. Vleugelbeeldschijven houden zich aan de luchtpijp vast. </li><li> Dek de imaginale schijfjes voorzichtig af met een deklip en afdichting met nagellak; Opslaan bij 4 ° C. </li></ol> 5. Confocal Microscopie <ol><li> Confocal beelden verkrijgen met behulp van een confocale microscoop ingestelde beeldverwervingsparameters, waaronder bereik van emissiegolflengte, laserintensiteit, gain, offset, scansnelheid en beeldgrootte 24 . OPMERKING: Raadpleeg de gebruiksaanwijzing van elke microscoopfabrikant voor een gedetailleerde procedure van instellingen voor het maken van beelden. </li><li> Om single co te vangenNfocal delen van een hele vleugel imaginale schijf, gebruik een 20X objectieflens. </li><li> Verkrijg 3-dimensionale afbeeldingen door z-stapscanning in stapformaat van 0,5 - 1,0 μm met behulp van 40X of 60X objectieven. OPMERKING: Om cellulaire fenotypes in hoge resolutie te analyseren, moet een beeldformaat groter zijn dan 512 x 512 pixels. </li></ol> 6. Beeldanalyse met behulp van ImageJ <ol><li> Gebruik Fiji, een open source ImageJ software gericht op biologische beeldanalyse (https://fiji.sc/) 25 , om confocal z-stack beelden te verkrijgen en te analyseren. </li><li> Om verticale afdelingen te verwerven, open de z-stack beelden in ImageJ en selecteer het menu item &quot;Image / Stacks / Reslice.&quot; OPMERKING: De XZ-as of de YZ-as kunnen in het menu Reslice worden gekozen. Verticale sectie kan ook in arbitraire richting worden verkregen door een rechte lijn of rechthoek op de z-stapelbeeld te tekenen. </li></ol> 7. Diagnose van neoplastische fenotypes <ol><li> Open de verticaleSecties (XZ of YZ-as) verkregen uit één set van z-stapbeelden en analyseren van morfologische fenotypes en antilichamen kleuring. </li><li> Voor de diagnose van tumorfenotypen concentreert zich zich vooral op de volgende drie punten: (1) als een celmassa, inclusief klopklonen, afwijkt van de hoofdepitheliale laag, (2) als de subcellulaire lokalisatie van junctionele eiwitten in deze celmassa wordt veranderd , En (3) als de diameter van deze celmassa groter is dan 4 cellen. </li><li> Categoriseer tumorfenotypen volgens het stroomdiagram beschreven in Figuur 1 . </li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10647931">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li>
<li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+proliferation+control%3A+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li>
<li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+alterations+in+carcinoma%3A+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger%2FTNF+signaling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li>
<li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Lgl+and+Mahjong%2FVprBP+in+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422(2010).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li>
<li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li>
<li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots%2C+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537(2016).</li>
<li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li>
<li>Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li>
<li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li>
<li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li>
<li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li>
<li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC%3A+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+6%2C300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li>
<li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li>
<li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc%2C+Yorkie%2C+Wingless+and+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li>
<li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li>
<li>Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het GAL4-UAS-systeem is een van de meest krachtige genetische hulpmiddelen voor gerichte genuitdrukking in Drosophila 26 en vergemakkelijkt de tumorcelinductie en -analyse in vivo 4 sterk . Dit systeem maakt het mogelijk om klonen te genereren die afbreking van tumoronderdrukkende genen of overexpressie van oncogenen binnen het epitheliale weefsel van wildtype, een situatie die sterk overeenkomt met de initiële stadia van menselijke kanker, waar getransfo...

Epitheliale weefsels zijn hoog georganiseerde systemen die het opmerkelijke homeostatische vermogen hebben om hun organisatie te behouden door de ontwikkeling en de omzet van cellen. Dit robuuste zelforganiserende systeem wordt echter progressief verstoord tijdens de tumorontwikkeling. Bij het begin van de tumorontwikkeling ontstaan ​​individuele mutante cellen die voortkomen uit oncogene activatie of tumor-suppressor gen inactivatie binnen een epitheliale laag. Wanneer deze getransformeerde &quot;pro-tumorcel&quot; een onderdrukkende omgeving ontwricht, epitheliale organisatie verstoord en ongecontroleerde proliferatie begint, vindt tumorigenese plaats 1 . Uitstekende technologische vooruitgang in de genetica en moleculaire biologie heeft de afgelopen decennia opmerkelijke vooruitgang geboekt op het gebied van kankeronderzoek. In het bijzonder zijn recente studies met behulp van de analysemethoden voor genetisch mozaïekanalyse in Drosophila melanogaster , zoals FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target) mitotisch recombinAtion 2 en flip-out-GAL4-UAS (stroomopwaartse activerende sequentie) systemen 3 hebben veel bijgedragen tot een beter begrip van de genetische mechanismen die betrokken zijn bij de vorming en metastase van tumoren 4 , 5 , 6 . Studies van een groep geconserveerde Drosophila tumor-suppressor genen, dodelijke reuzenlarven ( lgl ), schijven groot ( dlg ) en scribble ( scrib ), benadrukte de kritische relatie tussen verlies van epitheliale organisatie en tumorontwikkeling, aangezien deze genen sleutelrollen spelen In de regulering van apical-basale celpolariteit en cel proliferatie in epitheliale weefsels 7 . Terwijl Drosophila imaginal discs normaal gesproken een gelaagde epithelia zijn, veroorzaken homozygote mutaties in elk van deze drie genen cellen om structuur en polariteit te verliezen, misluktVerhuren, overpresteren en uiteindelijk vormen multilayerige amorfe massa&#39;s die samenvoegen met aangrenzende weefsels 7 . Op soortgelijke wijze is verstoring van deze genen bij zoogdieren betrokken bij de ontwikkeling van kwaadaardige tumoren 8 , 9 . De neoplastische fenotypen die door de mutante weefsels worden tentoongesteld hebben geleid tot de indeling van deze drie genen als geconserveerde neoplastische tumor-suppressor genen (nTSG&#39;s) 7 , 8 . Wanneer echter homozygote nTSG-mutante cellen sporadisch worden gegenereerd bij het ontwikkelen van wild-type imaginale schijven met behulp van FLP-FRT-gemedieerde mitotische recombinatie, worden mutante cellen geëlimineerd uit het weefsel door middel van c-Jun N-terminale kinase (JNK) -afhankelijke apoptose 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusie 15 </suP&gt; , 16 of engulfment en fagocytose door buren 17 . In deze genetische mozaïekepithelia wordt apoptose meestal gedetecteerd in nTSG-mutante cellen die zich bevinden op de kloongrens, wat suggereert dat naastliggende normale cellen de apoptose van nTSG-mutante cellen 10 , 11 , 12 , 18 triggen. Recente studies in zoogdiercellen hebben bevestigd dat deze celcompetitieafhankelijke eliminatie van pro-tumorcellen een evolutionair bewaard epitheliaal zelfverdediging mechanisme tegen kanker 19 , 20 , 21 , 22 , 23 is . Een recente studie in Drosophila imaginal discs bleek echter dat mozaïek nTSG-knockdown klonen neoplastische tumoren in specifiekeIc regio&#39;s van vleugel imaginale schijven 16 . Aanvankelijke tumorvorming werd altijd gevonden in het perifere &quot;scharnier&quot; gebied en werd nooit waargenomen in het centrale &quot;pouch&quot; gebied van het vleugelplatenepithelium, wat suggereert dat het tumorigene potentieel van nTSG-knockdowncellen afhankelijk is van de lokale omgeving. De centrale zakstreek fungeert als een &quot;tumorkoolspot&quot; waar pro-tumorcellen geen dysplastische overgroei vertonen, terwijl het perifere scharniergebied zich gedraagt ​​als een &quot;tumor hotspot&quot; 16 . In de &quot;koude spleten&quot; -zakkenregio&#39;s delamineren de NTSG-knockdown-cellen van de basale zijde en ondergaan apoptose. Daarentegen, als &quot;hotspot&quot; scharniercellen beschikken over een netwerk van robuuste cytoskeletale structuren op hun basale zijkanten, delamineren nTSG-knockdowncellen van de apicale kant van het epithelium en initiëren tumorigenische overgroei 16 . Daarom vereist analyse van tumorfenotypen in imaginale schijven zorgvuldige consiAfwijking van de regio-specifieke gevoeligheid voor tumorigenische stimuli. Hier beschrijven we een protocol om neoplastische tumorvorming op te wekken in de Drosophila- vleugelbeeldschijven die gebruik maken van het GAL4-UAS- RNAi- systeem waardoor nTSG-knockdown-cellen worden gegenereerd in normale vleugelplaten epithelia. Hoewel deze experimentele systemen nuttig zijn om de vroege stadia van kanker te bestuderen, is een duidelijke classificatiemethode om de stadia van tumorprogressie in imaginale disc epithelia te evalueren nog niet duidelijk beschreven. Daarom stellen we ook een diagnose-methode voor om pro-tumorklonale fenotypes te classificeren die in de vleugelplatenepithelia geïnduceerd zijn in drie categorieën: hyperplasie (accumulatie van een te groot aantal normale verschijnende cellen met verhoogde proliferatie), dysplasie (premalignant weefsel dat bestaat uit abnormaal verschijnen Cellen) en neoplasie (goedaardige of kwaadaardige tumor samengesteld uit cellen die een abnormale verschijning hebben en abnormaal proliferatiepatroon).

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulin</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>dilute in PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular probes</td><td>A22283</td><td>dilute in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td><td>Molecular probes</td><td>A11030</td><td>dilute in PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Vliegenstammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>gerecombineerd met UAS-EGFP</td></tr><tr><td>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>gerecombineerd met UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>gerecombineerd met UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X-chromosoom</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>derde chromosoom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>tweede chromosoom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>derde chromosoom</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP-eiwitval</td></tr></tbody></table>

inductie en diagnose van tumoren in<em&gt; drosophila</em&gt; imaginal disc epithelia

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

In de vroege stadia van kanker vertoont getransformeerde mutante cellen cytologische abnormaliteiten, beginnen ongecontroleerde overgroei en weefselorganisatie progressief verstoren. Drosophila melanogaster is ontstaan ​​als een populair experimenteel model systeem in kankerbiologie om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Met name maken genetische hulpmiddelen voor Drosophila imaginale schijven (ontwikkelende epithelia in larven) het mogelijk om getransformeerde pro-tumorcellen in een normaal epitheliaal weefsel te creëren, een situatie die vergelijkbaar is met de initiële stadia van menselijke kanker. Een recente studie van tumorigenese in Drosophila vleugel-imaginale schijven heeft echter aangetoond dat tumorinitiatie afhankelijk is van de weefsel-intrinsieke cytoarchitectuur en de lokale micro-omgeving, wat suggereert dat het belangrijk is om de regio-specifieke vatbaarheid voor tumorigenische stimuli te overwegen bij het evalueren van tumorfenotypes in imaginal discs. Om fenotypische analyse van tumorprogressie te vergemakkelijkenOp imaginale schijven beschrijven we hier een protocol voor genetische experimenten die het GAL4-UAS-systeem gebruiken om neoplastische tumoren in vleugel-imaginale schijven te induceren. We introduceren verder een diagnose methode om de fenotypen van klonale laesies die in imaginale epithelia zijn geïnduceerd te classificeren, aangezien een duidelijke classificatie methode om verschillende stadia van tumorprogressie te discrimineren (zoals hyperplasie, dysplasie of neoplasie) niet eerder is beschreven. Deze methoden kunnen in grote mate van toepassing zijn op de klonale analyse van tumorfenotypes in verschillende organen in Drosophila .

Om een ​​neoplastische tumorvorming te demonstreren die door RNAi- gemedieerde nTSG-knockdown in Drosophila- vleugel-imaginale schijven werd geïnduceerd, werden drie verschillende GAL4-stuurprogramma&#39;s gebruikt om UAS-RNAi voor lgl of scrib uit te drukken : (1) sd-GAL4, die sterke UAS-expressie in de Vleugelzakje en milde expressie in de scharniergebieden ( figuur 2 en figuur 3A</...

Mozaïek kloon analyse in Drosophila imaginal disc epithelia is een krachtig model systeem om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om tumoren te induceren in Drosophila- vleugel-imaginale schijven met behulp van het GAL4-UAS-systeem, en introduceert een diagnose-methode om de tumorfenotypen te classificeren.

Inductie en diagnose van tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van tumorigene mozaïekklonen in ontwikkelende imaginale schijven van Drosophila, om vervolgens de clonale laesies te classificeren in verschillende stadia van tumorontwikkeling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag in kanker modellering, zoals hoe tumoren consistent kunnen worden geïnduceerd en hoe het stadium van progressie kan worden geclassificeerd.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat tumorinjectie in de vleugelimaginale schijven van de Drosophila wordt gerealiseerd met behulp van eenvoudige vlieggenetica, en dat de classificatie van de stadia van tumorontwikkeling een eenvoudige diagnose is. Samen met Kenta Morimoto, die de procedure demonstreert, zal Kimiko Morimoto, een technicus uit mijn laboratorium, aanwezig zijn. Begin met het opzetten van de genetische kruising.Verwijder 12 uur voor het verzamelen van virgins voor de kruising alle volwassen vliegen uit de vials met rijpe pupae. Zet de volgende dag een kruising op om genetisch mozaïek-nakomelingen te genereren. Breng 12 tot 20 virgins en 10 mannetjes over naar een nieuwe vial en incubeer deze gedurende één dag bij 25 °C.Verpla

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit protocol laat de dissectie techniek die wordt gebruikt voor het isoleren van verbeelding schijven van Drosophila larven in de 3e instar stadium. Methoden voor de vaststelling van het weefsel na het zeggen en het verwijderen van de vleugel, poot, en ogen schijven worden gedemonstreerd direct op een objectglaasje voor verdere visualisatie.

Dissectie van de imaginaire Discs uit 3e Instar Drosophila Larven

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Bij het kleuren van Drosophila imaginal schijven, vaak een ruwe dissectie wordt uitgevoerd waar de schijven worden blootgesteld, maar blijven bevestigd aan het lichaam. Eenmaal bevlekt, worden de schijven van belang geïsoleerd en gemonteerd. Het voorbeeldprotocol demonstreert een procedure voor vleugel imaginaire schijfdissectie en montage.

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissectie: Een methode om de ontwikkeling van Epithelia te observeren

Samenwerking tussen een geactiveerd oncogen zoals RAS V12 en mutaties in cel polariteit genen zoals gekrabbeld, leiden tot tumorgroei in Drosophila waar tumorcellen ook weergeven invasief gedrag. Hier een eenvoudig protocol voor de inductie en observatie van de goedaardige en invasieve tumoren wordt gepresenteerd.

Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Hier beschrijven we een procedure om live beelden te maken van Drosophila gastrulatie. Dit heeft ons in staat gesteld om de apicale constrictie die betrokken is bij vroege ontwikkeling beter te begrijpen en verder mechanismen te analyseren die cellulaire bewegingen regelen tijdens modificatie van weefselstructuur.

Imaging van de Cel Shape Wijziging en Cell Mutatie Drosophila Gastrulatie gebruik van DE-cadherine Reporter Transgene Flies

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

We beschrijven een protocol voor het meten van contacten tussen cellen in aangrenzende epitheellagen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel met behulp van een op GFP-reconstitutie gebaseerde benadering.

Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer tumoren induceren en classificeren in Drosophila imaginal discs met het GAL4-UAS systeem. Deze methode maakt betrouwbaar onderzoek naar tumorgenese en kankerdynamiek mogelijk.

Inductie en diagnose van tumoren in

Meer video's verkennen