Combinatie van Raman Imaging en Multivariate Analysis om Lignine, Cellulose en Hemicellulose in de Plant Cell Wall te visualiseren
10 juni 2017
Dit protocol beoogt een algemene methode te presenteren om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden te visualiseren met behulp van Raman imaging en multivariate analyse.
Het algemene doel van dit experiment is om een algemene methode te presenteren voor het visualiseren van lignine, cellulose en hemicellulose in de plantencelbuis door middel van Raman-beeldvorming en multivariate analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van plantaardig biomassa, zoals hoe de belangrijkste chemische componenten zich distribueren in de plantencelbuis. Het grote voordeel van deze techniek is dat arbeidsvrije en niet-destructieve informatie over het monster kan worden verkregen met minimale monstervoorbereiding.
Begin door een klein weefselblok uit het plantenmonster te snijden. Dompel het weefsel gedurende 30 minuten in kokend gedeïoniseerd water. Breng het vervolgens onmiddellijk over naar gedeïoniseerd water op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Herhaal deze stap totdat het weefsel naar de bodem van de container zakt, wat aangeeft dat de lucht in het weefsel is verwijderd en dat het weefsel is verzacht. Bereid 20%50%70%en 90% aliquots van PEG en gedeïoniseerd water, evenals zuiver PEG. Bewaar de oplossingen op 65 graden Celsius.
Incubeer het weefsel in een reeks gegradueerde PEG-baden om het water te verdringen en laat het PEG infiltreren. Droog in 20%PEG gedurende een uur, 50%PEG gedurende anderhalf uur, 70%PEG gedurende twee uur, 90%PEG gedurende twee uur en 100%PEG gedurende 10 uur. Verwarm vervolgens een cassette voor op 65 graden Celsius in een oven.
Giet het weefselblok met PEG in de cassette en plaats het weefselblok vervolgens op de gewenste positie met behulp van voorverwarmde pincetten of naalden. Laat de cassette langzaam afkoelen en bewaar het weefsel op kamertemperatuur tot gebruik. Snijd het PEG-blok met het doelweefsel in een klein blokje met behulp van een scherpe scheermesje.
Montageer het kleine PEG-blok op de microtoom en snijd dunne secties van het PEG-blok. Spoel vervolgens de secties 10 keer met gedeïoniseerd water in een horlogeglas om het PEG uit het weefsel te verwijderen. Dompel vervolgens de secties zes uur lang in tolueen en ethanol om de extractieven te verwijderen.
Bereid de reactievloeistof door 65 mL gedeïoniseerd water, 0,5 mL azijnzuur en 0,6 g natriumchloride in een beker te mengen. Voeg een sectie en 3 mL reactievloeistof toe aan een 5 mL-flesje. Draai het deksel op de fles.
Verwarm vervolgens de fles in een waterbad op 75 graden Celsius gedurende twee uur om het lignine uit het weefsel te verwijderen. Spoel de sectie 10 keer met gedeïoniseerd water in een horlogeglas. Breng vervolgens de onbehandelde en delignifiseerde sectie over naar een glazen microscoopglaasje.
Ontvouw de sectie voorzichtig met behulp van borstels of naalden. Verwijder het overtollige gedeïoniseerd water met weefselpapier. Dompel vervolgens de sectie in deuteriumoxide.
Dek het monster af met een glazen dekglas. Verzegeld het dekglas met nagellak om de verdamping van het deuteriumoxide te voorkomen. Open de bedieningssoftware van het confocale Raman-microscoopinstrument.
Schakel de laser in en focus op de dienst van het kristal en silicium met een 100x microscoopobjectief. Klik op de kalibratieknop om het instrument te kalibreren. Schakel het instrument naar de optische microscoopmodus en schakel de microscooplamp in.
Plaats het microscoopglaasje op het podium, met het dekglas naar het objectief gericht. Bekijk het monster met de 20x microscoopobjectief en lokaliseer het gebied van belang. Schakel over naar het immersiemicroscoopobjectief.
Breng immersieolie aan op het dekglas en focus vervolgens op het oppervlak van het monster. Schakel vervolgens het instrument naar de Raman-testmodus en schakel de microscooplamp uit. Kies een kaartgebied door een rechthoekige tool te gebruiken.
Verander de stappengrootte om het aantal verkregen spectra te bepalen. Houd er rekening mee dat de stappengrootte groter moet zijn dan de spotdiameter, berekend door de numerieke apertuur van het objectief. Groottes hieronder zullen resulteren in oversampling.
Stel de optimale spectrale parameters in om de beste signaal-ruisverhouding en spectrale kwaliteit te verkrijgen en een geschikte acquisitietijd afhankelijk van de geschiktheid van het monster. Voer in het algemeen de beeldvormingsparameters in de instrumentsoftware in met een lasergolflengte van 532 nanometer, een filter van 100%, een gat van 300, een spleet van 100, een spectrometer van 1840 inverse centimeters, groeven van 1200T, een 60x olieobjectief en een acquisitietijd van twee seconden. Sla de spectrale gegevens op voorafgaand aan gegevensverwerking en converteer de gegevens naar een universeel formaat voordat u doorgaat naar gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol.
De originele Raman-spectra van de populierencelwand worden hier getoond. Twee belangrijke ruissignalen, inclusief baselinedriften en kosmische spikes, stromen samen met de werkelijke signalen over in de kanalen. Deze moeten worden verwijderd vóór gegevensanalyse.
Een ruisonderdrukkingstechniek zoals de Savitzky-Golay-algoritme of het wavelet-algoritme kan worden toegepast om deze ruissignalen te elimineren. Voor ligninebeeldvorming, overweeg de spectrale piek rond 1600 inverse centimeters vanwege de aromatische ring symmetrische rekkingsswibrati.
Voor polysacharidebeeldvorming gebruikt u de spectrale piek rond 2889 inverse centimeters vanwege de CH- en CH2-strekken. Echter, Raman-beelden van cellulose en hemicellulose kunnen niet direct worden gegenereerd. Delignificatie is een noodzakelijke procedure om de spectrale kenmerken ervan bloot te leggen. Over het algemeen zijn we nieuw voor deze methode.
We worstelen, omdat het training vereist in het hanteren en het uiterlijk van monstersneden en de gegevensanalyse. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u chemische informatie over de plantencelbuis kunt verkrijgen met behulp van in-situ methoden. Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals chemische voorbehandeling worden uitg
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden te visualiseren met behulp van Raman-imaging en multivariate analyse. Deze techniek biedt niet-destructieve inzichten in de chemische samenstelling van plantenbiomassa.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Plantbiologie
- Biomassaonderzoek
- Analytische chemie
Achtergrond
- Inzicht in de samenstelling van de plantcelwand is essentieel voor het benutten van biomassa.
- Raman-imaging maakt gedetailleerde chemische mapping van plantenweefsels mogelijk.
- Multivariate analyse helpt bij het interpreteren van complexe gegevens uit imaging.
- Deze methode minimaliseert de monstervoorbereiding en is niet-destructief.
Doel van de studie
- Om de distributie van belangrijke chemische componenten in plantencelwanden te visualiseren.
- Om een arbeidsbesparende methode te bieden voor het analyseren van plantenbiomassa.
- Om het begrip van de structuur en samenstelling van de plantencelwand te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het snijden van kleine weefselblokjes uit plantmonsters.
- Het onderdompelen van weefsel in kokend gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten.
- Het overbrengen van weefsel naar gedeïoniseerd water op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Het gebruik van Raman-imaging voor visualisatie en multivariabele analyse voor datainterpretatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van lignine, cellulose en hemicellulose.
- Aangetoonde distributiepatronen van chemische componenten in celwanden.
- Biedt een niet-destructieve methode voor het analyseren van plantenweefsels.
- Faciliteert verder onderzoek naar toepassingen van plantenbiomassa.
Conclusies
- De methode is effectief voor het bestuderen van de samenstelling van de plantcelwand.
- Raman-imaging in combinatie met multivariate analyse biedt waardevolle inzichten.
- Deze aanpak kan het onderzoek naar plantbiologie en biomassa-benutting verder bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt niet-destructieve, labelvrije visualisatie van lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden mogelijk, wat bijdraagt aan het mechanistisch minimaliseren van risico's bij biomassaconversie en de ontwikkeling van bio-gebaseerde materialen. Door ruimtelijk opgeloste gegevens over de chemische samenstelling te verschaffen, ondersteunt het de validatie van targets voor enzymengineering en de optimalisatie van voorbehandelingen. Deze benadering vermindert de afhankelijkheid van destructieve analyses en vergroot het voorspellende vertrouwen in workflows voor biomassascreening in een vroeg stadium.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de architectuur van de plantencelwand te onderzoeken om hypothesen over de recalcitrantie van biomassa en de toegankelijkheid van enzymen te onderbouwen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets door de chemische distributie te correleren met de resultaten van de enzymatische verteerbaarheid.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve spectrale outputs die kunnen worden gestandaardiseerd voor high-throughput screening van biomassa-varianten.
- Operationele waarde: Faciliteert de gereedheid van de assay door middel van reproduceerbare monstervoorbereiding en minimale operatorafhankelijke variabiliteit na training.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verschaft ziekterelevante systeeminzichten door de samenstelling van de celwand te koppelen aan fenotypische kenmerken in biomassaopbrengst en verwerkingsefficiëntie.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische schaling door consistente, labelvrije compositionele gegevens over verschillende monstersets te leveren.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking naar prekliniek, ondersteunt de vroege karakterisering van biomassa en maakt datagestuurde beslissingen mogelijk in ontwikkelingspipelines voor enzymen en voorbehandelingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over structurele barrières voor biomassadeconstructie door middel van directe visualisatie van lignine-polysacharidenetwerken.
- Screening: Levert assay-klare, ruimtelijk opgeloste chemische kaarten die vergelijking mogelijk maken van genetisch of behandelingsgeïnduceerde veranderingen in de celwandsamenstelling.
- Analytica: Genereert multivariate outputs die de componentverdeling en co-lokalisatie kwantificeren, wat objectieve vergelijking tussen experimentele condities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie door compositionele benchmarks te bieden voor het beoordelen van de geschiktheid van biomassa voor biobrandstof- of bioproductpaden.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform dat toepasbaar is op meerdere biomassagrondstoffen en projectfasen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door mechanische ambiguïteit in biomassa-recalcitrantie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door gedefinieerde protocollen voor spectrale acquisitie en gegevensverwerking.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van biomassestammen of voorbehandelingen door een vroege compositionele risicobeoordeling te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van biomassatargets mogelijk op basis van gevalideerde structurele en compositionele profielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in Raman-spectroscopie, multivariate data-analyse en het behandelen van planteweefsel.
- Afhankelijk van toegang tot confocale Raman-microscopen met passende lasergolflengten en objectieven.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor monstervoorbereiding, sectonering en data-interpretatie om de reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op diverse plantensoorten of weefseltypes met variërende complexiteit van de celwand.
- Beperkt door de noodzaak van delignificatie om cellulose- en hemicellulosesignalen te scheiden, wat extra procedurele stappen en potentiële variabiliteit toevoegt.
