Combinatie van Raman Imaging en Multivariate Analysis om Lignine, Cellulose en Hemicellulose in de Plant Cell Wall te visualiseren
June 10th, 2017
Dit protocol beoogt een algemene methode te presenteren om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden te visualiseren met behulp van Raman imaging en multivariate analyse.
Het algemene doel van dit experiment is om een algemene methode te presenteren voor het visualiseren van lignine, cellulose en hemicellulose in de plantencelbuis door middel van Raman-beeldvorming en multivariate analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van plantaardig biomassa, zoals hoe de belangrijkste chemische componenten zich distribueren in de plantencelbuis. Het grote voordeel van deze techniek is dat arbeidsvrije en niet-destructieve informatie over het monster kan worden verkregen met minimale monstervoorbereiding.
Begin door een klein weefselblok uit het plantenmonster te snijden. Dompel het weefsel gedurende 30 minuten in kokend gedeïoniseerd water. Breng het vervolgens onmiddellijk over naar gedeïoniseerd water op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Herhaal deze stap totdat het weefsel naar de bodem van de container zakt, wat aangeeft dat de lucht in het weefsel is verwijderd en dat het weefsel is verzacht. Bereid 20%50%70%en 90% aliquots van PEG en gedeïoniseerd water, evenals zuiver PEG. Bewaar de oplossingen op 65 graden Celsius.
Incubeer het weefsel in een reeks gegradueerde PEG-baden om het water te verdringen en laat het PEG infiltreren. Droog in 20%PEG gedurende een uur, 50%PEG gedurende anderhalf uur, 70%PEG gedurende twee uur, 90%PEG gedurende twee uur en 100%PEG gedurende 10 uur. Verwarm vervolgens een cassette voor op 65 graden Celsius in een oven.
Giet het weefselblok met PEG in de cassette en plaats het weefselblok vervolgens op de gewenste positie met behulp van voorverwarmde pincetten of naalden. Laat de cassette langzaam afkoelen en bewaar het weefsel op kamertemperatuur tot gebruik. Snijd het PEG-blok met het doelweefsel in een klein blokje met behulp van een scherpe scheermesje.
Montageer het kleine PEG-blok op de microtoom en snijd dunne secties van het PEG-blok. Spoel vervolgens de secties 10 keer met gedeïoniseerd water in een horlogeglas om het PEG uit het weefsel te verwijderen. Dompel vervolgens de secties zes uur lang in tolueen en ethanol om de extractieven te verwijderen.
Bereid de reactievloeistof door 65 mL gedeïoniseerd water, 0,5 mL azijnzuur en 0,6 g natriumchloride in een beker te mengen. Voeg een sectie en 3 mL reactievloeistof toe aan een 5 mL-flesje. Draai het deksel op de fles.
Verwarm vervolgens de fles in een waterbad op 75 graden Celsius gedurende twee uur om het lignine uit het weefsel te verwijderen. Spoel de sectie 10 keer met gedeïoniseerd water in een horlogeglas. Breng vervolgens de onbehandelde en delignifiseerde sectie over naar een glazen microscoopglaasje.
Ontvouw de sectie voorzichtig met behulp van borstels of naalden. Verwijder het overtollige gedeïoniseerd water met weefselpapier. Dompel vervolgens de sectie in deuteriumoxide.
Dek het monster af met een glazen dekglas. Verzegeld het dekglas met nagellak om de verdamping van het deuteriumoxide te voorkomen. Open de bedieningssoftware van het confocale Raman-microscoopinstrument.
Schakel de laser in en focus op de dienst van het kristal en silicium met een 100x microscoopobjectief. Klik op de kalibratieknop om het instrument te kalibreren. Schakel het instrument naar de optische microscoopmodus en schakel de microscooplamp in.
Plaats het microscoopglaasje op het podium, met het dekglas naar het objectief gericht. Bekijk het monster met de 20x microscoopobjectief en lokaliseer het gebied van belang. Schakel over naar het immersiemicroscoopobjectief.
Breng immersieolie aan op het dekglas en focus vervolgens op het oppervlak van het monster. Schakel vervolgens het instrument naar de Raman-testmodus en schakel de microscooplamp uit. Kies een kaartgebied door een rechthoekige tool te gebruiken.
Verander de stappengrootte om het aantal verkregen spectra te bepalen. Houd er rekening mee dat de stappengrootte groter moet zijn dan de spotdiameter, berekend door de numerieke apertuur van het objectief. Groottes hieronder zullen resulteren in oversampling.
Stel de optimale spectrale parameters in om de beste signaal-ruisverhouding en spectrale kwaliteit te verkrijgen en een geschikte acquisitietijd afhankelijk van de geschiktheid van het monster. Voer in het algemeen de beeldvormingsparameters in de instrumentsoftware in met een lasergolflengte van 532 nanometer, een filter van 100%, een gat van 300, een spleet van 100, een spectrometer van 1840 inverse centimeters, groeven van 1200T, een 60x olieobjectief en een acquisitietijd van twee seconden. Sla de spectrale gegevens op voorafgaand aan gegevensverwerking en converteer de gegevens naar een universeel formaat voordat u doorgaat naar gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol.
De originele Raman-spectra van de populierencelwand worden hier getoond. Twee belangrijke ruissignalen, inclusief baselinedriften en kosmische spikes, stromen samen met de werkelijke signalen over in de kanalen. Deze moeten worden verwijderd vóór gegevensanalyse.
Een ruisonderdrukkingstechniek zoals de Savitzky-Golay-algoritme of het wavelet-algoritme kan worden toegepast om deze ruissignalen te elimineren. Voor ligninebeeldvorming, overweeg de spectrale piek rond 1600 inverse centimeters vanwege de aromatische ring symmetrische rekkingsswibrati.
Voor polysacharidebeeldvorming gebruikt u de spectrale piek rond 2889 inverse centimeters vanwege de CH- en CH2-strekken. Echter, Raman-beelden van cellulose en hemicellulose kunnen niet direct worden gegenereerd. Delignificatie is een noodzakelijke procedure om de spectrale kenmerken ervan bloot te leggen. Over het algemeen zijn we nieuw voor deze methode.
We worstelen, omdat het training vereist in het hanteren en het uiterlijk van monstersneden en de gegevensanalyse. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u chemische informatie over de plantencelbuis kunt verkrijgen met behulp van in-situ methoden. Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals chemische voorbehandeling worden uitg
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelmuren te visualiseren met behulp van Raman-beeldvorming en multivariate analyse. Deze techniek biedt niet-destructieve inzichten in de chemische samenstelling van plantenbiomassa.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantenbiologie
- Biomassaonderzoek
- Analytische Chemie
Achtergrond
- Het begrijpen van de samenstelling van plantencelmuren is cruciaal voor het gebruik van biomassa.
- Raman-beeldvorming maakt gedetailleerde chemische kartering van plantenweefsels mogelijk.
- Multivariate analyse helpt bij het interpreteren van complexe gegevens uit beeldvorming.
- Deze methode minimaliseert monstervoorbereiding en is niet-destructief.
Doel van het onderzoek
- Om de verdeling van de belangrijkste chemische componenten in plantencelmuren te visualiseren.
- Om een arbeidsvrije methode te bieden voor het analyseren van plantenbiomassa.
- Om de begrip van de structuur en samenstelling van plantencelmuren te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Kleine weefselblokken uit plantenmonsters snijden.
- Weefsel in kokend gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten onderdompelen.
- Weefsel overbrengen naar gedeïoniseerd water op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Gebruik van Raman-beeldvorming voor visualisatie en multivariate analyse voor data-interpretatie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle visualisatie van lignine, cellulose en hemicellulose.
- Aangetoonde verdelingspatronen van chemische componenten in celmuren.
- Een niet-destructieve methode voor het analyseren van plantenweefsels geleverd.
- Verder onderzoek naar toepassingen van plantenbiomassa mogelijk gemaakt.
Conclusies
- De methode is effectief voor het bestuderen van de samenstelling van plantencelmuren.
- Raman-beeldvorming gecombineerd met multivariate analyse biedt waardevolle inzichten.
- Deze aanpak kan onderzoek naar plantenbiologie en biomassa-gebruik bevorderen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables non-destructive, label-free visualization of lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls, supporting mechanistic de-risking in biomass conversion and bio-based material development. By providing spatially resolved chemical composition data, it aids in target validation for enzyme engineering and pretreatment optimization. The approach reduces reliance on destructive assays and enhances predictive confidence in early-stage biomass screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plant cell wall architecture to inform hypotheses about biomass recalcitrance and enzyme accessibility.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating chemical distribution with enzymatic digestibility outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spectral outputs that can be standardized for high-throughput screening of biomass variants.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through reproducible sample preparation and minimal operator-dependent variability after training.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking cell wall composition to phenotypic traits in biomass yield and processing efficiency.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical scaling by delivering consistent, label-free compositional data across sample sets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early biomass characterization and enabling data-driven decisions in enzyme and pretreatment development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on structural barriers to biomass deconstruction through direct visualization of lignin-polysaccharide networks.
- Screening: Delivers assay-ready, spatially resolved chemical maps that allow comparison of genetic or treatment-induced changes in cell wall composition.
- Analytics: Generates multivariate outputs that quantify component distribution and co-localization, enabling objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing compositional benchmarks for assessing biomass suitability in biofuel or bioproduct pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across multiple biomass feedstocks and project stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity in biomass recalcitrance.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined spectral acquisition and data processing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in biomass strain or pretreatment development by providing early compositional risk assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of biomass targets based on validated structural and compositional profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Raman spectroscopy, multivariate data analysis, and plant tissue handling.
- Dependent on access to confocal Raman microscopes with appropriate laser wavelengths and objectives.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, sectioning, and data interpretation to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse plant species or tissue types with varying cell wall complexity.
- Limited by the need for delignification to resolve cellulose and hemicellulose signals, adding procedural steps and potential variability.
