Procedure en belangrijkste optimalisatie strategieën voor een geautomatiseerde capillaire elektroforetische gebaseerde Immunoassay-methode
10 september 2017
Een capillair gebaseerde-immunoassay met een commercieel platform om te meten doel eiwitten uit totaal eiwit preparaten wordt aangetoond. Daarnaast zijn assay parameters van blootstellingstijd, eiwitconcentratie en verdunning van de antilichamen geoptimaliseerd voor een model van de celcultuur.
Het algemene doel van deze procedure is om een capillaire elektroforese-immunossay te demonstreren met behulp van een commercieel platform. Dit platform zal eiwitdoelen onderscheiden en kwantificeren uit een biologische monster dat kan worden afkomstig van celkweekweefsels en biovloeistoffen. Het proces onderzoekt eiwitten op basis van grootte die variëren van twee tot 440 kilodalton.
Het voordeel van deze geautomatiseerde procedure ten opzichte van traditionele procedures, zoals een Western blot, is dat capillaire elektroforese-immunoassays de noodzaak voor gels, overdrachtsapparaten en handmatige wasbeurten elimineren. Ook is de absolute hoeveelheid eiwit die nodig is ongeveer 10 keer minder, waardoor de procedure ideaal is voor zeldzame celtypen of beperkte monsters. Bovendien worden de resultaten in slechts drie uur verkregen met behulp van geautomatiseerde systemen en zijn ze bewezen om kwantitatieve en reproduceerbare te zijn in vergelijking met conventionele Western blot-procedures.
Bereid de monsters en reagentia uit het kit voor, inclusief monstersbuffer, dithiothreitol, fluorescente mastermix en gebiotineerde ladder volgens de productbijsluiter van de fabrikant. Bereid de eiwitvellen voor met behulp van uw favoriete methode. Hier hebben we het volledige celextract geïsoleerd uit BEAS-2B celkweeks.
Verdun de eiwitvellen met monstersbuffer. Meng één deel vijf-X fluorescente mastermix met vier delen verdund monster om de gewenste eindconcentratie van eiwit te bereiken. Een voorbeeldberekening wordt getoond voor het maken van 70 microliters van 0,2 microgram per microliter eindconcentratie eiwit, beginnend met een eiwitconcentratie van 1,2 microgram per microliter.
De mastermix is 1/5 van het totale volume, in dit geval 14 microliters. Om het volume van de eiwitvoorraad te berekenen dat nodig is, vermenigvuldigt u de gewenste eindconcentratie met het totale volume en deelt u door de eiwitvoorraadconcentratie. Trek het mastermix- en voorraadvolumes af van het totale volume om het volume monstersbuffer te berekenen.
Denatureer de bereide monsters en ladder door te verhitten op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Opgelet, sommige eiwitten kunnen zachtere denatureringsomstandigheden vereisen. Bijvoorbeeld, 70 graden gedurende 10 minuten om eiwitaggregatie te voorkomen en migratie te verbeteren.
Overweeg deze optie als er zware smeersporen zijn bij de hogere molecuulgewichten. Bereid de gewenste antilichaamverdunning in het meegeleverde verdunningsmiddel. Opgelet, antilichamen worden over het algemeen gebruikt in hogere concentraties voor capillair-gebaseerde immunoassays dan voor traditionele Western blotting.
Bereid een een-op-een-mengsel van luminol en peroxide vers bij elke gebruik. Pipetteer de monsters en reagentia in de assayplaat met behulp van de volumes die in de sjabloon worden getoond. Kleurcodering vertegenwoordigt het juiste laden van reagentia en monsters naar de assayplaat.
Pipetteer gebiotineerde ladder naar put A1, bereide monsters naar putten A2 tot A25. Het meegeleverde antilichaamverdunning naar putten B1 tot B25 en put C1. Primair antilichaam naar putten C2 tot C25. Streptavidin HRP naar put D1. Secundair antilichaam naar putten D2 tot D25.
En luminol-peroxide mengsel naar putten E1 tot E25. Voeg wasbuffer toe aan de eerste drie rijen van de grotere middenplaatputten. Schakel het capillaire immunoassay-instrument in en open de bijbehorende software.
Laad de capillaire cartridge en de assayplaat in de machine volgens de instructies van de fabrikant en start de run. Wanneer de run voltooid is, controleer of de fluorescente standaarden correct zijn geïdentificeerd en corrigeer indien nodig. Controleer bovendien of de gebiotineerde ladder de juiste groottepieken toont voor het gebruikte kit.
Zie de snelle referentiegids of het producthandboek van de fabrikant voor meer details. Optimalisatie van assaycondities zoals belichtingstijd, eiwitconcentratie en antilichaamverdunning zijn belangrijk voor het verkrijgen van nauwkeurige, reproduceerbare resultaten. Deze voorwaarden zijn specifiek voor elke modelsysteemantilichaamcombinatie en moeten daarom empirisch voor elke nieuwe assay worden bepaald.
Het vermogen om kwantitatieve resultaten te genereren hangt af van de analyse van een belichtingstijd waarbij het luminol-substraat niet snel wordt uitgeput, aangezien substraatuitputting resulteert in signaalverlies of signaaluitputting. Dit kan worden bepaald door de gegevens te onderzoeken bij verschillende chemiluminescentiebelichtingstijden, zoals getoond in figuur twee. Belichtingen met het gebruikte instrument varieerden van vijf tot 480 seconden.
Lane views toonden afnemende eiwitconcentraties voor BEAS-2B extracten beproefd met p53 DO-1 antilichaam in een verdunning van één op 500. Chemiluminescentie signaalcoëfficiënten gerapporteerd als piekhoogten in de instrumentsoftware zijn overgelegd. Visuele bandintensiteiten worden automatisch door het instrument aangepast en zijn niet vergelijkbaar van de ene panel naar de andere.
De signaalcoëfficiënt neemt af met opeenvolgende langere belichtingen als luminol uitgeput raakt, zoals hier te zien is. Het signaal begint te verdwijnen en de piek splitst bij de twee langste belichtingen. Vanwege dit, is een korte belichtingstijd van 15 seconden gekozen voor data-analyse.
Totale eiwitinput moet ook worden geoptimaliseerd voor elke specifieke assay en modelsysteem. Voor kwantitatieve beoordeling moeten metingen worden genomen binnen het lineaire dynamische bereik van elke assay. Waar veranderingen in signaal, zoals gemeten door piekoppervlakte, evenredig zijn aan veranderingen in de hoeveelheid eiwit in het monster.
Lysaat titratie toont de lane views van BEAS-2B lysaat wanneer beproefd met één op 500 p53 DO-1 of één op 50 alfa-Tubulin antilichaam. Lineaire regressieanalyse bevestigt dat de assays lineair zijn over het gehele bereik getest. Totale eiwitconcentraties in het midden van het lineaire bereik werden gekozen om potentiële doeleiwitvariatie in beide richtingen te accommoderen.
Als een laatste optimalisatieoverweging, moet de juiste primaire antilichaamverdunning worden beoordeeld. Het gebruik van antilichamen in saturerende concentraties helpt om ervoor te zorgen dat alle signaalveranderingen die worden gemeten alleen te wijten zijn aan veranderingen in de hoeveelheid eiwit. Twee BEAS
Overzicht
Dit artikel demonstreert een capillair-gebaseerde immunoassay met gebruik van een commercieel platform om doeleiwitten uit biologische monsters te meten. De methode optimaliseert assayparameters zoals expositietijd, eiwitconcentratie en antilichaamverdunning voor een verbeterde nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunoassay-technieken
- Capillaire elektroforese
- Proteïnekwantificering
Achtergrond
- Capillaire elektroforese-immunoassays maken het mogelijk om eiwitten uit biologische monsters te onderscheiden en te kwantificeren.
- Deze methode vereist aanzienlijk minder eiwit dan traditionele technieken zoals Western blotting.
- Resultaten kunnen snel worden verkregen, wat de efficiëntie van eiwitanalyses verhoogt.
- Optimalisatie van de assaycondities is cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van een capillair-gebaseerd immunoassayplatform aan te tonen.
- Om assayparameters te optimaliseren voor specifieke modelsystemen.
- Om een betrouwbaar alternatief te bieden voor traditionele methoden voor eiwitkwantificatie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van eiwitmonsters uit celculturen.
- Optimalisatie van antilichaamverdunningen en belichtingstijden.
- Gebruik van geautomatiseerde systemen voor verbeterde reproduceerbaarheid.
- Evaluatie van chemiluminescentiesignalen voor kwantitatieve analyse.
Belangrijkste resultaten
- Capillaire immunoassays leveren kwantitatieve resultaten met gereduceerde monstervolumes.
- Optimalisatie van de belichtingstijden is essentieel om signaaluitputting te voorkomen.
- Lineair dynamisch bereik bevestigd voor diverse proteïneconcentraties.
- Juiste antilichaamverdunning garandeert een nauwkeurige meting van proteïneniveaus.
Conclusies
- De capillaire immunoassay is een levensvatig alternatief voor traditionele methoden.
- Geoptimaliseerde condities leiden tot betrouwbaardere en reproduceerbare resultaten.
- Deze methode is bijzonder nuttig voor het analyseren van zeldzame celtypen of beperkte monsters.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Capillaire immunoassays bieden een kwantitatief, geautomatiseerd alternatief voor traditionele Western blotting, waardoor de benodigde hoeveelheid eiwit afneemt en de doorlooptijd wordt verkort. Dit maakt een efficiëntere targetvalidatie en leadidentificatie mogelijk in de vroege ontdekkingsfase, met name voor beperkte of zeldzame monstertypen. Optimalisatie van assayparameters zorgt ervoor dat de gegevens binnen het lineaire dynamische bereik vallen, wat betrouwbare mechanistische risicoanalyse en voorspellend vertrouwen in de modulatie van het eiwitdoel ondersteunt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via kwantitatieve meting van target-proteïneniveaus in ziekterelevante systemen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door reproduceerbare, op grootte gebaseerde eiwitscheiding en detectie zonder artefacten uit gels.
- Voorspellende waarde: Bevestiging van het lineaire dynamische bereik maakt een nauwkeurige beoordeling van target-modulatie mogelijk, wat bijdraagt aan portfolie-triage en go/no-go-beslissingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door de lineariteit van de assay en de optimale antilichaamverdunning vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via geautomatiseerde capillaire elektroforese, waardoor gebruikersvariabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Schaalbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk met een high-throughput capaciteit (25 monsters in ~3 uur) en hergebruik van het platform voor verschillende doelproteïnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Ondersteunt de voortgang van ontdekking naar preklinische validatie door consistente, kwantitatieve eiwitmetingen over verschillendest soorten monsters te behouden.
- Risico-gecorrigeerde Voortgang: Optimalisatie van de expositietijd en antilichaamconcentratie voorkomt signaalverzadiging en uitbranding, waardoor de data-integriteit voor biomarker-afstemming wordt gewaarborgd.
- Mechanistische Risicoreductie: Focus op het lineaire bereik en verzadigingscurven vergroot het voorspellende vertrouwen in target-engagement en padmodulatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege ontdekking (Early Discovery) tot lead-identificatie en preklinisch werk, waardoor hypothesetoetsing, verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie mogelijk worden via kwantitatieve eiwitanalyse.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking via op grootte gebaseerde eiwitkwantificering in cellulaire lysaten.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door geoptimaliseerde belichtingstijden, eiwitconcentraties en antilichaamverdunningen die kwantitatieve, reproduceerbare resultaten garanderen.
- Analytics: Levert chemiluminescentie-signaalmetingen (piekoppervlak/hoogte) die vergelijking van eiwitniveaus tussen verschillende condities en behandelingen mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door consistente eiwitkwantificering mogelijk te maken van celkweek tot biofluïdummonsters.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor meerdere targets en modelsystemen zodra assay-specifieke parameters empirisch zijn bepaald.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Predictieve betrouwbaarheid bij targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit en een verbeterd kwantitatief karakter van de gegevens.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door automatisering en een vermindering van de benodigde handmatige tijd.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium via vroege, betrouwbare gegevens over targetmodulatie.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van lineaire, saturatie-bevestigde eiwitmetingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp van immunoassays, principes van capillaire elektroforese en chemiluminescentie-detectie.
- Afhankelijk van instrumentatie die in staat is tot geautomatiseerde monsterbelading, scheiding en detectie (bijv. ProteinSimple Wes platform).
- Vereist standaardisatie tussen teams van protocollen voor monsterpreparatie, antilichaambehandeling en data-analyse.
- Houdt rekening met adaptaties bij overdracht tussen modelsystemen of monsterbronnen vanwege matrixeffecten en eiwitstabiliteit.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van empirische optimalisatie per antilichaam-targetcombinatie en mogelijke signaalinterferentie door zeer overvloedige eiwitten.
