Name: Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer hoe je peptide-microarrays ontwerpt en analyseert om de specificiteit van histoon-antilichamen te profileren voor chromatine-biochemie. Deze methode verbetert kwaliteitscontrole in epigenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Van Andel Research Institute en een onderzoeksbijdrage van de National Institutes of Health (CA181343) naar SBR

De auteurs hebben niets te onthullen.

De betrouwbaarheid van antilichamen in biomedische onderzoekstoepassingen is voornaamste 46 , 47 . Dit geldt met name in chromatin biochemie gezien de positie van antilichamen als belangrijke instrumenten voor de meerderheid van de technieken ontwikkeld om de overvloed en verdeling van histon PTMs te karakteriseren. Het protocol presenteerde hier details een geoptimaliseerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays om de histon ...

Genomisch DNA wordt elegant verpakt in de eukaryote celkern met histonproteïnen om chromatine te vormen. De herhalende subeenheid van chromatine is het nucleosoom, dat bestaat uit 147 basisparen DNA die rond een octamerische kern van histonproteïnen - H2A, H2B, H3 en H4 1 worden gewikkeld. Chromatine is in ruime mate georganiseerd in losgekoppelde euchromatine en strak verpakte heterochromatin domeinen. De mate van chromatine compactie regelt de mate waarin eiwit machines kunnen toegang krijgen tot het onderliggende DNA om fundamentele DNA-templated processen zoals replicatie, transcriptie en reparatie uit te voeren. Belangrijke regelgevers van de toegankelijkheid van genoom in het kader van chromatine zijn PTM&#39;s op de niet-gestructureerde staart- en kerndomeinen van histonproteïnen 2 , 3 . Histon PTM&#39;s functioneren direct door de structuur van chromatine 4 en indirecte invloed te beïnvloedenH de aanwerving van lezerproteïnen en hun bijbehorende macromoleculaire complexen die chromatine remodellerende, enzymatische en steigerwerk hebben 5 . Studies van histone PTM functie over de afgelopen twee decennia suggereren overweldigend deze markeringen spelen sleutelrollen bij het reguleren van celfate, organismeontwikkeling en ziekte-initiatie / progressie. Gevoed door de vooruitgang in de massaspectrometrie gebaseerde proteomische technologie, zijn meer dan 20 unieke histon PTM&#39;s op meer dan 80 verschillende histonenresiduen ontdekt 6 . In het bijzonder komen deze wijzigingen vaak voor bij combinaties, en in overeenstemming met de hypothese van de histoncodes, zijn tal van studies aan te geven dat lezerproteïnen gericht zijn op discrete gebieden van chromatine door herkenning van specifieke combinaties van histon PTMs 7 , 8 , 9 . Een belangrijke uitdaging voorwaarts is om functies toe te wijzen aan de grDoor een lijst van histon PTM&#39;s en om te bepalen hoe specifieke combinaties van histon PTM&#39;s de dynamische functies die geassocieerd zijn met chromatine orchestreeren. Antilichamen zijn de lynchpin reagentia voor de detectie van histon PTMs. Als zodanig zijn meer dan 1000 histon PTM-specifieke antilichamen commercieel ontwikkeld voor toepassing in chromatin biochemieonderzoek. Met de snelle ontwikkeling van DNA-sequencing technologie met hoge doorstroming worden deze reagentia extensief gebruikt door individuele onderzoekers en grootschalige epigenomische &quot;roadmap&quot; -initiatieven ( bijv . ENCODE en BLUEPRINT) in ChIP-seq (chromatine immunoprecipitatie gekoppeld aan volgende generatie sequencing ) Pijpleidingen voor het genereren van hoge-resolutie ruimtelijke kaarten van histone PTM-distributie genoom-breed 10 , 11 . Echter, recente onderzoeken hebben aangetoond dat de specificiteit van histon PTM antilichamen zeer sterk kan zijn en dat deze reagentia onbeschikbaar zijn<html> Waardevolle epitoopherkenning, sterke positieve en negatieve invloed van naburige PTM&#39;s en moeilijkheden om de modificatieorde op een bepaald residu te discrimineren ( bijvoorbeeld mono-, di- of tri-methyllysine) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Daarom is strenge kwaliteitscontrole van histon PTM-specifieke antilichaamreagentia nodig om de gegenereerde gegevens met deze waardevolle reagentia nauwkeurig te interpreteren. Microarray technologie zorgt voor gelijktijdige ondervraging van duizenden macromoleculaire interacties in een high-throughput, reproduceerbare en miniatuurformaat. Om deze reden zijn een verscheidenheid aan microarray platforms gecreëerd om eiwit-DNA 19 te analyseren ,&quot;&gt; 20, eiwit-eiwit 21 en eiwit-peptide interacties 22. Inderdaad, histone peptide microarrays zijn opgevat als een informatief ontdekkingsplatform voor chromatin biochemie onderzoek, waardoor high-performance profielen van de schrijvers, wisers en lezers van histone PTMs 15 mogelijk zijn. , 23, 24, en tevens voor de analyse van histon antilichaamspecificiteit 17, 25. Naast hun toepassing in chromatine en epigenetica onderzoek histonpeptide arrays potentiële bruikbaarheid als een diagnostische / prognostische test voor systemische lupus erythematosus en andere auto-immuun ziekten waarbij anti- Chromatine auto-antilichamen worden gegenereerd 26 , 27 . Hier beschrijven we een geïntegreerde pijpleiding die we hebben ontwikkeld voor het ontwerpen, fabriceren en queHistone peptide microarrays rijst om specificiteitsprofielen te genereren voor antilichamen die histonen en hun PTM&#39;s herkennen. De pijplijn wordt vergemakkelijkt door ArrayNinja, een open source, interactieve software applicatie die we onlangs hebben ontwikkeld, die de ontwerp- en analysestadia van microarray-experimenten 28 integreren. ArrayNinja werkt het best in Google Chrome. In het kort wordt een robot-contact microarray printer gebruikt om een ​​bibliotheek van biotine-geconjugeerde histonpeptiden te deponeren op bepaalde posities op streptavidine-beklede glasmicroscoopschuiven. Arrays kunnen dan in een competitief en parallel assayformaat gebruikt worden om antilichaam-epitoopinteracties te ondervragen ( Figuur 1 ). De peptidebibliotheek bestaat uit honderden unieke synthetische peptiden die PTM&#39;s bevatten (lysine acetylering, lysine / arginine methylering en serine / threonine fosforylering) en in relevante combinaties die grotendeels afkomstig zijn uit proteomische datasets. Methoden voor peptidsynthese en validatie<html> Zijn elders gedetailleerd beschreven 23 . Gegevens die worden gegenereerd uit onze lopende histone PTM antilichaam screening inspanningen gebruik maken van dit array platform worden gearchiveerd op een openbare web resource, de Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Met name zijn histonepeptidemicroarrays die zijn vervaardigd met variaties van dit protocol, uitgebreid gebruikt om de activiteit van histone PTM-lezer domeinen 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 en meer recentelijk te profileren histone PTM-schrijver- en gumwerkactiviteiten 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Beeldvertoning van de stapse procedure voor het screenen van antilichamen op een microfoon van een histonpeptide. Biotinyleerde histonpeptiden die gedefinieerde post-translationele modificaties (rode en blauwe cirkels) bevatten, worden geco-gedrukt met biotine-fluoresceïne op streptavidine-gecoat glas. Positieve interacties worden weergegeven als rode fluorescentie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

```html
<table><tbody><tr><td>Printing Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-coated glass microscope slides</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polypropylene 384 well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>contact microarray printer</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Microarray Printer</td></tr><tr><td>contact microarray printer</td><td>Gene Machines</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray Printer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic wax pen</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td></tr><tr><td>Silicon Gasket</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Vessel</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>of soortgelijk vat</td></tr><tr><td>Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-konijn)</td></tr><tr><td>Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-muis)</td></tr><tr><td>Wax Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>of equivalent microarray scanner</td></tr><tr><td>EipTitan Histone Peptide Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Peptide Array</td><td>Active Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Histone Code Peptide Microarrays</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>Wax</td><td>Royal Oak</td><td>GulfWax</td><td>voor wax imprinter</td></tr><tr><td>Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>High throughput microscope slide washing chamber</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide centrifuge</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Antibody 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Antibody 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated histone peptide</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Voorbeeldpeptide. Vergelijkbare peptiden met verschillende modificaties zijn verkrijgbaar bij verschillende commerciële bronnen.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>
```

analyse van histone antilichaam specificiteit met peptide microarrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translationele modificaties (PTM&#39;s) op histonproteïnen worden op grote schaal onderzocht voor hun rol bij het reguleren van chromatinestructuur en genexpressie. De massaproductie en distributie van antilichamen die specifiek zijn voor histone PTM&#39;s, hebben dit onderzoek op grote schaal vergemakkelijkt. Aangezien histon PTM-antilichamen belangrijke reagentia zijn voor veel chromatin-biochemie toepassingen, is een nauwkeurige analyse van antilichaamspecificiteit noodzakelijk voor nauwkeurige data-interpretatie en voortdurende vooruitgang op het gebied. Dit protocol beschrijft een geïntegreerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays voor het profileren van de specificiteit van histonantilichamen. De ontwerp en analyse aspecten van deze procedure worden vergemakkelijkt door ArrayNinja, een open source en interactief softwarepakket dat we onlangs ontwikkeld hebben om de aanpassing van microarrayformaten te stroomlijnen. Deze pijpleiding is gebruikt om een ​​groot aantal commercieel verkrijgbare en veel gebruikte histone PTM antibodies te screenenS, en gegevens die gegenereerd worden uit deze experimenten zijn vrij beschikbaar via een online en expanderende Histone Antibody Specificity Database. Naast histonen kan de hierin beschreven algemene methodologie in grote mate toegepast worden op de analyse van PTM-specifieke antilichamen.

Dit protocol is gebruikt om een ​​peptide microarray platform te ontwerpen en fabriceren voor de analyse van histon PTM antilichaam specificiteit. De array vraagt ​​een bibliotheek met meer dan 300 unieke peptidefuncties (20 tot 40 resten in lengte), die veel van de bekende combinaties van PTM&#39;s vertegenwoordigen, gevonden op kern- en varianthistonproteïnen 38 . Deze pijpleiding is een werkhorst voor het screenen van veel veelgebruikte en in de handel verkrijg...

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Het doel van deze video is om een geïntegreerde pijplijn te beschrijven voor het ontwerp, de fabricage en het gebruik van peptide-microarrays voor het profileren van de specificiteiten van histon-antilichamen. Antilichamen die histonen en hun diverse post-translationele modificaties herkennen, zijn cruciale reagentia in chromatinum biochemisch onderzoek. We vertrouwen op deze instrumenten om ons begrip van de functie van histonmodificaties te verdiepen.Recente studies tonen inconsistenties aan in het gedrag van histon-antilichamen. Aangezien de keuze van het antilichaam het meest kritieke element is in epigenetica-experimenten, zijn strikte en uitgebreide kwaliteitscontrolemaatregelen voor deze reagentia vereist. Hier presenteren wij een geïntegreerde pipeline die wij hebben ontwikkeld voor het ontwerpen, fabriceren en analyseren van peptide-microarrays om specificiteitsprofielen te genereren voor antilichamen die histonen en hun posttranslationele modificaties herkennen.De pipeline wordt gefaciliteerd door Array Ninja, een door ons ontwikkelde interactieve softwareapplicatie met open source, die de ontwerp- en analysefasen van microarray-experimenten integreert. Om met het ontwerpen van de array-dia te beginnen, selecteert u onder de kop 'plan a slide layout' de microarray-printer die gebruikt zal worden. Typ vervolgens 'empty' in het veld 'load plate' en druk op enter.Stel de spotdiameter in op 275 micrometers en de spotafstand op 100 micrometers. Vul de overige parameters naar behoren in voor het experiment, waarbij u ervoor zorgt dat de lay-out voldoende herhalingen toestaat. Ga in de resulterende voorvertoning van de lay-out met de muis over elke unieke peptidefeature op de slide en voer een feature-identificatie in het pop-uptekstvak in.Zodra elk uniek kenmerk is gelabeld, klikt u op populate. Geef de dia-indeling een naam en klik op commit your plate om de indeling op te slaan en een kaart te genereren van de fysieke locaties van elk kenmerk in de bronplaten. Laad, geleid door de kaart van de bronplaat, één tot twee microliters van elk peptidekenmerk in de aangewezen putjes van één of meer 384-wells platen met klein volume, en verdun elk kenmerk 10-voudig met 1x protein microarray printing buffer, aangevuld met 1% bovine serum albumin en vijf micrograms per microliter fluorescine-gelabelde biotine.Centrifugeer de platen vervolgens 2 minuten bij 500 x G op kamertemperatuur. Leeg daarna de afvalbak van de microarray-printer. Vul de bevochtigingsbakken van de gewassen oplossing aan met steriel gedestilleerd water.Voer de parameters voor de array-dia in de software van de microarray-printer in. Stel de wasprocedure in op een wasbeurt van één seconde met een enkele onderdompeling, de nawas op vijfmaal het herhaaldelijk onderdompelen van de pinnen en de luchtvochtigheid op 60%. Plaats vervolgens de gecoate glazen dia's in de substraatplatina's. Laad de platina's in de platina-lift.Plaats de bronplaten in de platenhouders en zet de houders in de lift voor bronplaten. Start het printproces en verwijder vervolgens de substraatplatinums uit het instrument. Blokkeer de geprinte slides gedurende 30 minuten met 1x proteïne-microarray-blokkeringsbuffer onder schudcondities.Was daarna de objectglazen gedurende 10 minuten in fosfaatgebufferde saline (PBS) met een pH van 7,6 bij kamertemperatuur. Herhaal het wassen met een nieuwe batch PBS. Droog de objectglazen door 30 seconden te centrifugeren bij kamertemperatuur.Verwarm vervolgens een microarray-wasstempelaar voor op 85 °C gedurende 30 minuten, of totdat de was is gesmolten. Plaats daarna een objectglas met de geprinte zijde naar beneden in de houder en lijn de houder uit met de mal van de stempelaar. Breng de mal in contact met het objectglas en houd dit twee seconden vast; verwijder vervolgens snel het objectglas uit de houder en inspecteer de wasranden om te controleren of de arrays correct zijn omsloten.Bewaar de gepartitioneerde objectglazen bij 4 °C in een droge, donkere ruimte. Om de hybridisatieprocedure te starten, plaatst u een gepartitioneerde array-slide in een plastic schaal en bedekt u de slide met hybridisatiebuffer. Laat de slide 30 minuten equilibreren bij 4 °C onder lage schudintensiteit.Droog de slide door deze te centrifugeren in een microarray-slidecentrifuge bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens vijf microliters van elke histone PTM-antilichaamoplossing toe aan ten minste twee wells van de array en incubeer gedurende één uur bij vier graden Celsius. Verwijder na de incubatie de antilichaamoplossing en was de array drie keer met koude PBS, telkens vijf minuten bij vier graden Celsius.Incubeer vervolgens de array in een oplossing van een secundair antilichaam dat is geconjugeerd met een fluorescerende kleurstof. Gedurende 30 minuten bij vier graden celsius, in het donker. Was de slide drie keer met koud PBS zoals voorheen.Dompel de array in 0,1x PBS op kamertemperatuur om overtollig zout te verwijderen en droog de slide door korte centrifugatie bij kamertemperatuur. Maak beelden van de slide met een microarray-scanner met een resolutie van ten minste 25 microns. Gebruik voor de start van de analyse beeldverwerkingssoftware om de enkelkanaalsbestanden van de microarray-scanner samen te voegen.Open vervolgens Array Ninja en selecteer de juiste microarray-printer onder de kop 'to quantify images'. Vul in het dialoogvenster 'load plate' de naam van dezelfde dia-indeling in en druk op enter. Laad het samengevoegde beeldbestand en pas het contrast, de helderheid en het middelpunt naar wens aan.Vul de resolutie van de array-scanner in en pas de boven- en zijmarges aan om het raster van de slide-indeling af te stemmen op de afbeelding. Om een set putjes als replica's te analyseren of andere selectieve analyses uit te voeren, vult u de coördinaten van de putjes in de velden iPin, jPin en subA in en drukt u op enter. Klik om de zoomfunctie te activeren, zodat er een vergrote afbeelding van het gebied onder de cursor wordt weergegeven.Klik vervolgens op spot seek en wacht tot het proces is voltooid. Herhaal de zoekfunctie indien nodig om de cirkels van het raster te centreren op de spots van de array. Referentie-spots kunnen worden geselecteerd door op de R-toets te drukken, en spots die debris vertonen of een afwijkende morfologie hebben, kunnen worden gedeactiveerd door op de A-toets te drukken terwijl u over de spot zweeft.Zodra de achtergrondreferentiestippen zijn geselecteerd en stippen met poriemorfologie of contaminatie zijn gedeactiveerd, klikt u op populate en vervolgens op submit om de kwantificering uit te voeren. Een staafdiagram en een tabel worden op een nieuwe pagina weergegeven. De bindingsspecificiteiten van twee histon-PTM-antilichamen werden met deze methode geëvalueerd.Een histon PTM-antilichaam, ontworpen om getrimethyleerde lysine 9 op histon H3 te targeten, bleek ook te binden aan drie andere getrimethyleerde lysinegroepen. Er werd waargenomen dat silylering van naburige lysineresiduen een positieve invloed had op de targeting van lysine 9 op H3. Een histon PTM-antilichaam dat getrimethyleerde lysine 4 op histon H3 targette, bleek ook te interageren met enkelvoudig gemethyleerde en gedimethyleerde lysine 4 op H3. Fosforylering van de naburige alanine zes bleek in deze assay een negatief effect te hebben op de binding bij lysine vier.Deze pijplijn is gebruikt om veel van de meest gebruikte, commercieel verkrijgbare histon-antilichamen te screenen en de gegevens die uit deze experimenten zijn voortgekomen, zijn vrij beschikbaar via de database voor histon-antilichaamspecificiteit. Variaties van deze pijplijn zijn eerder beschreven voor de analyse van histon-readers, writers en erasers; deze aanpassingen aan het platform maken het eenvoudig om deze buiten het epigenetisch onderzoek te gebruiken voor elke gewenste printbare library. Er zijn verschillende commercieel verkrijgbare histon-peptide microarray-platforms beschikbaar voor gebruikers die geen toegang hebben tot de gespecialiseerde apparatuur die nodig is om peptiden te synthetiseren en arrays te vervaardigen.

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody's specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Methoden voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties worden cruciaal voor elk aspect van genomisch onderzoek, maar ze zijn arbeidsintensief, duur en tijdrovend. Hier wordt een commercieel verkrijgbaar robotsysteem voor vloeistofbehartiging gepresenteerd dat chromatine-immunoprecipitatie automatiseert voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties met beperkte hoeveelheden cellen.

Automatiseren van ChIP-seq Experimenten om Genereer Epigenetische Profielen op 10.000 HeLa-cellen

Peptidarrays gesynthetiseerd door de SPOT-methode kunnen worden gebruikt om de substraatspecificiteit van proteïne lysine methyltransferases (PKMTs) te analyseren en om het substraatspectrum van PKMTs te definiëren om hun biologische rol te begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe peptidearrays te synthetiseren, ze te methyleren met PKMTs en de resultaten te analyseren.

Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Incongruenties in menselijke leukocyten antigeen (HLA) sequenties tussen organ donor en ontvanger paren zijn de belangrijkste oorzaak van antilichaam-gemedieerde afwijzing in orgaantransplantatie. Hier presenteren we het gebruik van aangepaste antigeen arrays die zijn gebaseerd op individuele donoren HLA sequenties sonde anti-donor HLA alloantibodies orgel geadresseerden.

Gepersonaliseerd Peptide Arrays voor detectie van HLA Alloantibodies in orgaantransplantatie

Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van MHC klasse I en klasse II peptidecomplexen uit muis- en menselijke cellijnen die hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens leveren. Het protocol richt zich op monstervoorbereiding met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.

Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Genetische varianten in menselijke Spindlin Family Member 4 (SPIN4) zijn recentelijk vastgesteld bij patiënten met botovergroei, een nieuwe ontwikkelingsstoornis. Een protocol en nieuwe resultaten die de biochemische identificatie van gemodificeerde histonen in de context van nucleosomen als SPIN4-bindende substraten beschrijven, worden gepresenteerd.

Identificatie van gemodificeerde histonen als bindende substraten van het menselijke Spindlin-familielid 4 (SPIN4) door middel van peptidearrays en native nucleosoompulldown

Leer hoe je peptide-microarrays ontwerpt en analyseert om de specificiteit van histoon-antilichamen te profileren voor chromatine-biochemie. Deze methode verbetert kwaliteitscontrole in epigenetisch onderzoek.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Meer video's verkennen