Name: Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor het isoleren van mannelijke kiemcellen uit zoogdiertestikels via mechanische dissociatie en FACS-sortering. Deze techniek ondersteunt moleculair onderzoek naar spermatogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken het Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) voor hondentestes; Jason Arand en Dr. Ted Cicero&#39;s lab aan de Washington University in St. Louis (WashU) voor het leveren van rat testes en Brianne Tabers voor het assisteren van de collectie; Jared Hartsock en Dr. Salt&#39;s Lab bij WashU voor de proefkonijnen; En Dr. Michael Talcott bij de afdeling Comparatieve Geneeskunde bij WashU voor de miniatuur varkens testis. De auteurs erkennen ook het Alvin J. Siteman Cancer Center aan de Washington University School of Medicine en Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, voor het gebruik van de Siteman Flow Cytometry Core, die een door de personeelsleden georganiseerde celsorteringsdienst leverde. Het Siteman Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Dit onderzoek werd gefinancierd door een FCT-doctorale gemeenschap [SFRH / BD / 51695/2011 naar ACL], subsidies van de Verenigde Staten National Institutes of Health [R01HD078641 en R01MH101810 naar DFC] en een FCT onderzoeksovereenkomst [IF / 01262/2014 naar AML].

Alle procedures die hieronder beschreven zijn, zijn in overeenstemming met de voorschriften van het Comité voor dierstudies aan de Universiteit van Washington in St. Louis. 1. Voorbereidingen voor mechanisch dissociatieprotocol <ol><li> Pre-nat een 50 μm disposable tissue disaggregation cartridge voor dissociatie van een hele muizen testis. OPMERKING: Deze disposable weefsel disaggregatie cartridge bevat microbladen ontworpen voor het snijden van weefsels en een onbeweeglijk staal gaas met ongeveer 100 zeshoekige gaten. Verschillende maten van mesh voor weefsel disaggregatie cartridge zijn beschikbaar om dit protocol aan te passen op basis van soorten en gewenste celtypes. 50 μm cartridges werden gebruikt voor alle zoogdieren die in dit document genoemd worden. <ol><li> Laad 1 ml ijskoude fenol roodvrij 1x Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) op de 50 μm disposable tissue disaggregation cartridge. OPMERKING: Fenol rood kan interfereren met detectie van rode fluorenCence tijdens FACS. </li><li> Aspireren 1x DMEM uit de weefsel disaggregatie cartridge met een 3 ml naaldloze injectiespuit uit de spuitpoort. </li></ol></li><li> Schakel het weefselafscheidingssysteem in door op &quot;ON&quot; te drukken. Dit systeem vereist geen &quot;opwarmen&quot; tijd. </li><li> Voor-nat drie 40 μm wegwerpfilters met ijskoud 1x DMEM. Plaats elk 40 μm wegwerpfilter op een 50 ml conische buis. Pipetteer 1 ml 1x DMEM en laat de vloeistof doorgaan. </li><li> Bereid een 100 mm x 15 mm Petri schotel voor het verzamelen van testicularweefsels. Pipet 500 μL van 1x DMEM op de Petri-schotel. </li></ol> 2. Bereiding van testicularweefsel voor mechanisch dissociatieprotocol <ol><li> Dissecteer een mannelijke muis om verse gehele testes of testikelfragmenten voorzichtig te verwijderen (bij het omgaan met andere zoogdieren) met chirurgische scharen en pincetjes. OPMERKING: Zorg ervoor dat weefsels vrij zijn van vet en necrose. fr<html> Esh testiculaire weefsels produceren superieure single-cell suspensie kwaliteit dan bevroren weefsels. <ol><li> Verzamel verzamelde testes / fragmenten naar de voorbereide 100 mm x 15 mm Petri schotel die 500 μL 1x DMEM bevat. </li><li> Spoel het weefsel voorzichtig in 1x DMEM om rode bloedcellen te verwijderen (indien aanwezig). </li></ol></li><li> Trek de tunica albuginea voorzichtig uit. De dikte van tunica albuginea zal variëren in verschillende soorten. <ol><li> Pak een uiteinde van testis met tang. </li><li> Puncteer het andere uiteinde van testis met een scalpel terwijl u het ene uiteinde van de testis nog steeds vasthoudt met een tang van de vorige stap. </li><li> Scrape testicular tubules met behulp van een scalpel terwijl nog het ene uiteinde van testis met tang van stap 2.2.1. </li></ol></li><li> Knip testicularbuisjes in stukken van 2-3 mm 3 met een scalpel. </li></ol> 3. Verkrijgen van eencelsuspensies door mechanische dissociatie van testicularweefsel Ontent &quot;&gt; OPMERKING: De dissociatiestappen die hieronder worden beschreven, zijn voor een volwassen muis testis. Volumes testicularweefsels van jonge muizen of niet-muizen soorten moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Juveniele dieren mogen niet alle stadia van kiemcellen bevatten. Sommige zoogdiersoorten hebben Testiculaire weefselsamenstelling verandert tijdens de broeizoenen in vergelijking met het niet-parende seizoen. <ol><li> Breng de kleine testikelbuisjes over naar de voorvervette 50 μm weefselafbraakpatroon met behulp van tang en voeg 1 ml 1x DMEM toe. </li><li> Laad de weefselafbraakpatroon in weefselafscheidingssysteem en verwerk deze gedurende 5 minuten door de knop van stand-by naar de &quot;run&quot; -modus te draaien. </li><li> Verwijder de weefselafbraakpatroon uit het weefselsistaggregatiesysteem en aspireer de cel suspensie met een 3 ml naaldloze injectiespuit uit de spuitpoort. <ol><li> Aspireer een paar keer om alle vloeistof te verwijderen uit weefsel disaggregatie cartridge. NietAlle 1 ml kan worden hersteld uit de weefsel disaggregatie cartridge. </li></ol></li><li> Pass de gesuspendeerde cel suspensie door twee wegwerpvaste 40 μm filters. Filter tweemaal om eventuele celaggregaten te verwijderen. <ol><li> Plaats een voorverstoken 40 μm filter in een 50 ml conische buis. Voeg aspirated cellen direct in de spuit op het 40 μm filter. Pipet-door-eenzijdige suspensie met een wegwerppipet. </li><li> Verwijder het gebruikte voorgelaste 40 μm filter en plaats een ander voorverstoken 40 μm filter in de 50 ml conische buis. Pipet de verzamelde enkelcelsuspensie op het schone 40 μm filter. </li><li> Verzamel gefilterde enkelcelsuspensie met een schone wegwerppipet. </li></ol></li><li> Pipette gefilterde cel suspensie terug naar de 50 μm weefsel disaggregatie patroon en proces gedurende nog eens 5 minuten in een weefsel disaggregatie systeem. </li><li> Herstel alle vloeistof uit de weefsel disaggregatieOp de cartridge. </li></ol> 4. Verven met Hoechst en Propidiumjodide (PI) <ol><li> Overdracht herstelde cel suspensie van de 50 μm weefsel disaggregatie cartridge naar een schone 1,5 ml buis. Ongeveer 1-1,5 ml single-cell suspensie wordt hersteld. </li><li> Verdeel de herstelde enkelcelsuspensie in vier 1,5 ml of 5 ml buizen. <ol><li> Voor de eerste drie buizen, pipette 150 μL single-cell suspensie en pipette rest van een-cel suspensie in de laatste van de vier buizen (ongeveer 550 μL single-cell suspensie). OPMERKING: Het bedrag van eencelsuspensie in de laatste buis kan variëren op basis van de efficiëntie van celsuspensieherstel bij stap 3.6. </li></ol></li><li> Zet de eerste buis van de vier buizen als een onbedekte controle voor de FACS-sessie. </li><li> Bereid enkele kleurstofkleuren (PI of Hoechst) cel suspensies als controles op. Voeg 2,5 μL Hoechst of 1 μl PI aan elke buis toe (tweede en third). </li><li> Maak een dubbelkleurige buis klaar. Dit wordt gebruikt voor het verzamelen van kiezelcel subpopulaties. Voeg 2,5 μL Hoechst en 1 μl PI toe aan de laatste buis. OPMERKING: Hoechst heeft een houdbaarheid van 2-3 maanden. Het gebruik van oudere voorraden kleurstof zorgt voor significante veranderingen tijdens de FACS-sessie. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Plaats monsters in een buisrotator of draai de 1,5 ml buizen om om de 5-10 minuten. </li><li> Filtercelsuspensie met een voorvochtige 40 μm filter en hou de gefilterde oplossing op ijs en in het donker tot de FACS sessie. OPMERKING: De filtratiestap is nodig om celcellen voor FACS te voorkomen. Daarnaast kan de behandeling met DNase (zie Figuur 1 ) of 2-Naphthol-6,8-disulfonzuur-dikaliumzout (NDA 20 ) worden gebruikt om celklontering te beperken. Langdurige wachttijden zullen invloed hebben op het fluorescerende signaal dat gedetecteerd wordt tijdens FACS en kan leiden tot een verhoogde celdood. </li&gt; </ol> 5. Fluorescentie Geactiveerde Cell Sorting (FACS) Setup en Zuivering van Testiculaire Cellen <ol><li> Bereid FACS-buizen op. <ol><li> Bedek 5 ml polypropyleen ronde bodembuizen of 1,5 ml buizen met 400 μL FBS voor celverzameling. Decant overtollig FBS na coating. </li><li> Voeg FACS verzamelmedium (1x DMEM + 10% Fetale Bovine Serum, FBS) toe aan de buizen: 1 ml voor 5 ml buizen of 100 μl voor 1,5 ml buizen. </li></ol></li><li> Stel de juiste sorteringsomstandigheden in cel sorteren en software op. OPMERKING: Andere celsorteringsmachines en analysesoftware kunnen worden gebruikt bij de hieronder beschreven vergelijkbare setup- en gateway-strategieën. De hier beschreven omstandigheden werden aangepast uit Gaysinskaya en Bortvin 2 , Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 en Getun, et al. 4 <ol><li> Laad een ultraviolette laser met 463/25 nm bandpasfilter om Hoechst blauw en 680 nm LP-bandfilter te detecteren om Hoechst rood te detecteren en PI te detecteren. </li><li> Gebruik een 555DLP dichroische spiegel om blauw te onderscheiden van rode fluorescentie. </li><li> Gebruik een 70 μm spuitmond en sorteer cellen met een snelheid van 1000-2000 cellen / seconde. OPMERKING: Sorteringsefficiëntie wordt direct beïnvloed door de stromingssnelheid. Hoge stromingssnelheden (&gt; 3500 gebeurtenissen / s) verhogen de snelheid van sorteren, maar resulteren in vervuiling van populaties. Zie referentie 12 voor verdere informatie. </li></ol></li><li> Zet poorten met controle monsters. <ol><li> Laad en run onbeschadigd monster. </li><li> Exclusief celresten op basis van FSC vs SSC plot patroon. Cell puin komt in het linker linker kwadrant van het plot op. Stel de drempel voor celresten willekeurig door de gebruiker of de cel sorteren technicus. </li><li> Poort op enkele cellen door de drempel voor FSC en pulsbreedte aan te passen. Verschillende celsorterers hebben verschillende manieren om te onderscheidenGuish singlets. Aangezien de pulsbreedte de tijdscellen weerspiegelt om de laser over te gaan, hebben enkele cellen lagere waarden in vergelijking met multicellulaire aggregaten. Het instellen van drempel op een plot voor FSC versus pulsbreedte kan gebruikt worden voor singlets. </li><li> Stel optimale fotomultiplierbuis (PMT) spanningen in. </li><li> Gebruik zowel onbeschadigde als enkelkleuren gekleurde cellen om de drempel van PI of Hoechst fluorescentiesignaal vast te stellen. OPMERKING: Het is belangrijk om de basislijn PTM spanningen te optimaliseren voor de cellen van belang om het juiste fluorescentiebereik voor elke kleurstof te bepalen. Dit is cruciaal voor optimale signaaldetectie en gevoeligheid. De onbeschadigde en enkelgekleurde controlecellen worden gebruikt om een ​​reeks van negatief en positief gekleurde cellen te bepalen met PI- en / of Hoechst-kleurstoffen en minimaliseert ruis in signalen. Voor nadere uitleg over de optimalisatie van PMT-spanning met behulp van controlecellen, verwijzen wij u naar Gaysinskaya en Bortvin 2 </li><li> Poort op levende celS gebaseerd op PI-kleuring (PI-negatief) en FSC-plot. Dode cellen zullen positief zijn voor PI-fluorescentie. </li><li> Stel de DNA-inhoudshek in door een histogram van celtellingen te berekenen op basis van Hoechst Blue Fluorescence. 3 pieken met toenemende concentraties Hoechst blauwe fluorescentie zouden moeten verschijnen, die haploïde (1C), diploïde (2C) en tetraploïde (4C) cellen vertegenwoordigen. Stel 3 poorten in, één voor elke piek. </li><li> Let op minstens 500.000 gebeurtenissen op FSC vs SSC plot voordat u verder gaat naar de kiemcelpopulaties. </li></ol></li><li> Poort verschillende kiemcel populaties. <ol><li> Laad Hoechst / PI bevlekte monster. </li><li> Stel de eerste 3 ouderpoorten vast die gemeenschappelijk zijn voor alle populaties. <ol><li> Exclusief celresten op basis van de FSC vs SSC plot. Selecteer singlets op basis van de FSC vs pulsbreedte plot. Selecteer levende cellen door PI negatieve cellen te geven. </li></ol></li><li> Definieer spermatogonia gate. </li><li> Plot PI negatieve cellen op basis van Hoechst blauwe en rode fluorescentieintensiteiten. Spermatogonia verschijnt als een zijpopulatie (zie figuur 1 ). </li><li> Definieer poorten voor de overgebleven kiemcelpopulaties. OPMERKING: Raadpleeg figuur 1 en aanvullende figuur 2 voor visuele details. </li><li> Plot PI negatieve cellen in de DNA-inhoudshek. <ol><li> Voor spermatiden poort de piek met de laagste Hoechst fluorescentie (1C). </li><li> Voor spermatocyten II, poort de piek met intermediaire Hoechst fluorescentie (2C). </li><li> Voor spermatocyten ga ik de piek met hoogste Hoechst fluorescentie (4C). </li></ol></li><li> Plot Hoechst blauwe en rode fluorescentie-intensiteit om spermatocyten en spermatidenpopulaties uit DNA-inhoudshekken te verfijnen. </li></ol></li><li> Verzamel de geselecteerde subpopulatie poorten in de eerder verzamelde collectiebuizen. Elke testis zal gemiddeld 45 minuten tot 1,5 uur nemen om ongeveer 0,5-6,0 x 10 6 cellen te verzamelen voor elke subpopulatie. OPMERKING: Langdurige celblootstelling bij Hoechst maY verplaats de locatie van de populaties met de tijd iets. Vernieuw de instellingen na 20-30 minuten FACS. Maximale opbrengst voor elke subpopulatie zal afhankelijk zijn van de efficiëntie van dissociatiestap. </li></ol> 6. Microscopische evaluatie van gezuiverde cellen <ol><li> Spin verzamelde cellen bij 500-600 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Cel-pellet opnieuw opschorten met 1 ml ijskoude 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) of 1x DMEM. OPMERKING: Het re-suspension volume kan worden aangepast aan het aantal gesorteerd cellen en de gewenste eindconcentratie. </li><li> Pipetteer 40 μl gewassen cellen op een schone glijschuif en plaats een deksel. </li><li> Bevestig de resterende cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) en zet vast cellen bij 4 ° C in het donker voor toekomstige verwijzing. <ol><li> Pipet 100 μL 4% PFA direct in de verzamelbuizen. </li><li> Vortex de buizen of pipet kortstondig om ervoor te zorgen dat de cel suspensie goed gemengd wordt. </li></ol></li><li> Visualiseer de voorbereide dia&#39;s in een microscoop uitgerust met een UV-lamp om Hoechst-fluorescentie te detecteren onder een 63X-doelstelling. Raadpleeg de sectie Resultaten - Morfologische evaluatie van gesorteerde kiemcellenpopulaties - voor meer informatie over het identificeren van specifieke kiemceltypes. </li></ol>

<ol><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li>
<li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Curr Protoc Cytom. 72, (2015).</li>
<li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+Mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biol Reprod. , (2016).</li>
<li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
<li>Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Sertoli%2C+Leydig%2C+and+spermatogenic+cells+from+the+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis.</a> Biotechniques. 51 (5), (2011).</li>
<li>Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+transcriptome+analysis+of+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis.</a> BMC Genomics. 15, 39(2014).</li>
<li>Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://flowbook.denovosoftware.com/">http://flowbook.denovosoftware.com/</a> (2008).</li>
<li>Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+analysis+and+sorting+of+viable+mouse+testis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells.</a> J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).</li>
<li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+spermatogonia%2C+spermatocytes%2C+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li>
<li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+fluorescence+emission+spectrum+analysis+of+Hoechst-33342-stained+DNA+in+chicken+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes.</a> Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).</li>
<li>Lassalle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131 (2), 479-487 (2004).</li>
<li>Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+integrity+is+a+critical+molecular+indicator+for+the+assessment+of+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility.</a> Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).</li>
<li>Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+technique+for+the+preparation+of+testicular+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).</li>
<li>Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+DNA+damage+response+by+the+supravital+probes+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids.</a> Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).</li>
<li>Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+activated+cell+sorting+allows+isolation+of+spermatogonia+from+adult+primate+testes+and+reveals+distinct+GFRa1-positive+subpopulations+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Primatol%22%5BJournal%5D)">Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men.</a> J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).</li>
<li>Hayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+selection+methods+for+rat+and+mouse+round+spermatids+without+DNA+staining+by+flow+cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting.</a> Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Gezien de sterk geconserveerde chromatin dynamiek tijdens spermatogenese bij zoogdieren, was het doel van dit werk een protocol te ontwikkelen om mannelijke kiemcellen in afzonderlijke stadia van differentiatie van verschillende zoogdier testulaire weefsels te isoleren ( Figuur 1 ). Een van de belangrijkste obstakels bij het toepassen van een enkele workflow op verschillende diermodellen is de behoefte aan soortspecifieke aanpassingen, met name wat betreft weefseldissociatieprotocollen. Hui...

Gezien het gebrek aan een in vitro systeem dat representatief is voor de progressie van spermatogenese en de aanwezigheid van grote cellulaire heterogeniteit in testis, vereist studies van mannelijke kiemcelbiologie robuuste technieken om verrijkte populaties van specifieke celsoorten te isoleren. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is algemeen gebruikt voor dit doel 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , omdat het hoge opbrengst en zuiverheid levert en andere isolatiemethoden overschrijdt in het aantal soorten kiemcellen die het kan identificeren en Selecteer 6 , 7 , 8 . Het principe van flow cytometry analyse is gebaseerd op de detectie van differentiële lichtpatronen na laserstraal excitatie van enkele cellen. Als een cel door de laser gaat, weerspiegelt / verspreidt het lichtIn alle hoeken, evenredig met de celgrootte (forward scatter; FSC) en intracellulaire complexiteit (side scatter; SSC). Zie Ormerod 9 voor gedetailleerde informatie over flowcytometrie. Mannelijke kiemcellen ondergaan specifieke modificaties in DNA-inhoud, chromatinstructuur, grootte en vorm gedurende verschillende fases van spermatogenese. Dergelijke afzonderlijke celpopulaties kunnen worden geïdentificeerd en gescheiden door het combineren van lichtverstrooiing en DNA-kleuring met fluorescerende kleurstoffen 10 , 11 . Verschillende kleurstoffen kunnen hiervoor worden gebruikt (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), zoals Hoechst-33342 (Hoechst), die in de loop van het decennium 1 , 2 , 4 , 10 vaak gebruikt is in de flowcytometrie analyse van testiculaire cellen. , 12 . upoN excitatie met UV-licht, geeft Hoechst blauwe fluorescentie die evenredig is aan het cellulaire DNA-gehalte, terwijl de verre rode fluorescentie de variabiliteit in chromatinstructuur en verdichting 1 , 13 , 14 weerspiegelt. Als gevolg hiervan vertoont mannelijke kiemcellen in verschillende stadia van differentiatie specifieke patronen tijdens FACS van Hoechst-gekleurde enkele cel suspensies (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant is dat de intensiteit van Hoechst-blauwe fluorescentie niet in verhouding staat tot het chromatinegehalte in deze cellen, doordat het een effectieve kleurstofuitvloeisel is die alleen actief is tijdens het spermatogonale stadium, en ze clusteren als zijpopulatie tijdens Ho-FACS 15 . Bovendien combineert het combineren van Hoechst-kleuring met het niet-permeante kleurstofpropidiumjodide (PI) gebruikers de mogelijkheid om live (PI-negatief) te onderscheiden van dode (PI positieve) cellen tijdens FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Deze strategie is eerder gebruikt in flowcytometrische analyses van testische kiemcellen en is uitgebreid geoptimaliseerd in de muis om maximaal 9 kiemcellen te onderscheiden, waaronder cellen in 4 verschillende stadia van meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Voor dit werk heeft Hoechst-kleuring drie voornaamste voordelen. Ten eerste is Ho-FACS succesvol toegepast op de isolatie van mannelijke kiemcellen in het muismodel 1 , 2 , 12 en andere knaagdieren zoals rat en cavia 17 , 18 , 19 . Ten tweede, Hoechst is een celdoorlatende kleurstof en vereist geen membraanpermeabilisatie, zodat het zich voordoetVes celintegriteit. Tenslotte is geen RNase-behandeling nodig, aangezien Hoechst bij voorkeur aan poly (d [AT]) DNA-sequenties 1 , 20 bindt, wat betekent dat RNA bewaard blijft en naast DNA en eiwitten kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse moleculaire studies van kiem Celdifferentiatie. Ondanks de gelijkenis in DNA-ploïdie en / of vlekkelijkheid waargenomen in flowcytometrie-analyses van zoogdiersoorten (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), is er een grote mate van variabiliteit in de protocollen beschreven voor mannelijke kiemcelisolatie door flowcytometrie. Verschillende studies hebben specifieke protocols toegepast voor weefseldissociatie, en gebruikten afzonderlijke DNA-bindende kleurstoffen (alleen of in combinatie) en FACS-gatingstrategieën in verschillende modelorganismen, vooral de muis, de rat en de cavia. Bijgevolg kan directe vergelijking van gegevens verzameld voor verschillende soorten worden beïnvloed door unaccoUnted technische artefacten die voortvloeien uit variabiliteit tussen methodologieën. Belangrijk is dat het opvallende behoud van chromatin dynamiek door middel van zoogdierspermatogenese (2N-4N-2N-1N) suggereert dat een gestandaardiseerd protocol transversaal toegepast kan worden op een verscheidenheid aan zoogdieren. Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een enkele workflow die van toepassing is op verschillende zoogdieren, door het combineren en aanpassen van eerder gepubliceerde technieken 2 , 20 . Standaardisatie van een werkwijze voor weefselverwerking werd bereikt door mechanische dissociatie te verrichten om de behoefte aan speciesspecifieke aanpassingen die nodig zijn voor enzymatische vertering 5 te overwinnen. Het is opmerkelijk dat mechanische dissociatie van knaagdiertesticulaire weefsels is aangetoond dat ze beter presteren dan enzymatisch weefselvertering 20 en Ho-FACS van enkelcelsuspensies die worden gegenereerd door beide methodenHet vergelijkbare resultaat 5 . Als principieel bewijs beschrijft dit protocol de instellingen die worden gebruikt om tot 5 kiemcelpopulaties te isoleren: spermatogonia (SPG); Primaire (SPC I) en secundaire spermatocyten (SPC II) en spermatiden (SPD) - ronde (rSPD) en verlenging (eSPD). Belangrijk is dat het gemakkelijk in het laboratorium kan worden geïmplementeerd, waarbij de belangrijkste vereisten het systeem zijn voor weefseldissociatie en toegang tot een celsoort uitgerust met een UV-laser. Deze workflow ( Figuur 1 ) is snel en eenvoudig en maakt het mogelijk dat 4 kiemcellenpopulaties tegelijkertijd uit vers testikelweefsel in minder dan 2 uur worden verwijderd. De verminderde verwerkingstijd is van cruciaal belang om de cellulaire integriteit te behouden voor verdere downstream procedures. Bovendien suggereert de succesvolle prestatie in 5 verschillende soorten dat het in het zoogdierklauw in grote mate kan worden toegepast, waardoor het de ideale methode is om kiemcellen te isoleren voor vergelijkende studies van zoogdieren mannelijke voortplantingsbiolgie. Dit protocol bestaat uit drie hoofdafdelingen, afgezien van voorbereidende stappen: (1) de mechanische dissociatie van testicularweefsel en (2) kleuring van testiculaire cellen met Hoechst en PI, gevolgd door (3) FACS-sortering van relevante spermatogene cellen. Eenmaal verzameld, kunnen deze verrijkte bevolkingen van verschillende zoogdier testulaire kiemcellen gebruikt worden voor een breed scala aan toepassingen. Dit protocol beschrijft een dissociatiemethode met een grootte van één maat, om mannelijke kiemcellen van veel verschillende zoogdieren te zuiveren. Afhankelijk van het type studie dat gebruikers met de geïsoleerde kiemcellen willen uitvoeren, kunnen andere media of buffers worden gebruikt. De volgende protocol stappen zijn voor het opwekken van enkel-cel suspensies van één hele murine testis.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>#15710</td><td>4% PFA, Voor het fixeren van gesorteerd cellen</td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>BD Biosciences</td><td>#340588;</td><td>Systeem voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>1X Dulbecco gemodificeerd Eagle medium</td><td>Life Technologies</td><td>#31053</td><td>DMEM, voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>Medicon</td><td>BD Biosciences</td><td>#340591</td><td>Disaggregatie cartridge voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>#10082139</td><td>FBS, voor FACS verzameling</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>#H3570</td><td>Hoechst, Voor FACS kleuring</td></tr><tr><td>40 µm cel strainer</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>#89508-342</td><td>Voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>100x 15 mm petrischaal</td><td>Falcon</td><td>#351029</td><td>Voor testis dissectie</td></tr><tr><td>5 mL polypropyleen buisjes met ronde bodem</td><td>Falcon</td><td>#352063</td><td>Voor FACS verzameling</td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf buisjes</td><td>VWR</td><td>#20170-650</td><td>Voor FACS verzameling</td></tr><tr><td>3 mL naaldloze spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>#309657</td><td>Voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>50 mL conische buis</td><td>MIDSCI</td><td>#C50R</td><td>Voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>Propidium Jodide</td><td>Invitrogen</td><td>#L7011</td><td>PI, Voor FACS kleuring</td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Voor FACS</td></tr><tr><td>Summit Cell Sorting software</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Voor FACS</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline</td><td>Thermo Scientific</td><td>#AM9625</td><td>PBS, Voor microscopie</td></tr><tr><td>Microscopische glazen plaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-544-4</td><td>Voor microscopie</td></tr><tr><td>Glazen dekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-548-87</td><td>Voor microscopie</td></tr><tr><td>Weggeef pipet (3 mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>#225</td><td>Voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>#10104159001</td><td>Voor testis dissociatie</td></tr><tr><td>Koolstofstaal chirurgisch mes</td><td>Miltex</td><td>#4-111</td><td>Voor testis dissectie</td></tr><tr><td>Countess geautomatiseerde celteller</td><td>Invitrogen</td><td>#C10227</td><td>Voor automatische celtelling</td></tr><tr><td>Trypan blauw oplossing (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>#T8154</td><td>Voor levensvatbaarheidskleuring</td></tr></tbody></table>

een gestandaardiseerde benadering voor multispecies zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een van de methoden van keuze om verrijkte populaties van zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Momenteel staat het voor de discriminatie van maximaal 9 muizenkiemcelpopulaties met een hoge opbrengst en zuiverheid. Deze hoge resolutie in discriminatie en zuivering is mogelijk door unieke veranderingen in de chromatinstructuur en de hoeveelheid door middel van spermatogenese. Deze patronen kunnen worden gevangen door stromingscytometrie van mannelijke kiemcellen die zijn gekleurd met fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen, zoals Hoechst-33342 (Hoechst). Hierin is een gedetailleerde beschrijving van een recent ontwikkeld protocol om zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Kortom, enkelvoudige cel suspensies worden gegenereerd uit testiculair weefsel door mechanische dissociatie, dubbel gekleurd met Hoechst en propidiumjodide (PI) en verwerkt door flowcytometrie. Een seriële gate strategie, inclusief de selectie van levende cellen (PI negatief) met verschillende DNA-inhoud (Hoechst intensiteit), iS gebruikt tijdens het sorteren van FACS om maximaal 5 soorten kiemcel te onderscheiden. Deze omvatten, met bijbehorende gemiddelde zuiverheden (bepaald door microscopie-evaluatie): spermatogonia (66%), primaire (71%) en secundaire (85%) spermatocyten, en spermatiden (90%), verder gescheiden in ronde (93%) en verlenging (87%) subpopulaties. Uitvoering van de gehele workflow is eenvoudig, het is mogelijk om tegelijkertijd 4 cellen te isoleren met de betreffende FACS-machine en kan binnen 2 uur uitgevoerd worden. Aangezien verminderde verwerkingstijd cruciaal is om de fysiologie van ex vivo cellen te behouden, is deze methode ideaal voor downstream high-throughput studies van mannelijke kiemcelbiologie. Bovendien elimineert een gestandaardiseerd protocol voor het zuiveren van zoogdierkiemcellen door middel van multispecies methodologische bronnen van variabelen en maakt het mogelijk om een ​​enkele reeks reagentia te gebruiken voor verschillende diermodellen.

Enkelvoudige cel suspensies van mechanische dissociatie van testiculair weefsel Figuur 2 vergelijkt enkele cel suspensies verkregen door mechanische dissociatie van muis testicular weefsel onder verschillende omstandigheden. Monsters verkregen door het verwerken van vers weefsel, onbeschadigd ( Figuur 2A ) of gekleurd met Hoechst ( Figuur 2B...

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Het algemene doel van deze gestandaardiseerde procedure is om verschillende typen mannelijke kiemcellen uit diverse zoogdiersoorten te isoleren met behulp van één enkel protocol. Deze methode kan de moleculaire studie van spermatogenese vergemakkelijken door middel van high-throughput analyse van verschillende kiemceltypen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat één set reagentia kan worden toegepast op diverse zoogdiersoorten voor de gelijktijdige isolatie van vier verschillende populaties mannelijke kiemcellen.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we besloten de evolutie van specifieke patronen van genexpressieregulatie bij verschillende zoogdieren te onderzoeken. Chris Holley, een medisch technoloog van de Siteman Flow Cytometry Core, zal demonstreren hoe de cel sorter moet worden bediend en hoe de gates moeten worden ingesteld. Begin met het decapsuleren van een enkele murine testis en snijd het weefsel in kleine stukjes.Gebruik vervolgens een pincet om kleine stukjes weefsel over te brengen naar een vooraf bevochtigde weefseldissaggregatiecartridge van 50 micrometer. Voeg één milliliter DMEM-medium toe aan de cartridge en plaats de weefseldissaggregatiecartridge in het weefseldissaggregatiesysteem. Draai de knop van stand-by naar run en verwerk het weefsel gedurende vijf minuten.Verwijder vervolgens de cartridge en gebruik een wegwerpspuit van 3 mL om de celsuspensie via de spuitpoort op te zuigen. Wanneer alle vloeistof is teruggewonnen, worden de cellen gefilterd door twee afzonderlijke, wegwerpbare, vooraf bevochtigde 40 µm filters om celaggregaten te verwijderen, waarna de suspensie wordt teruggebracht naar de disaggregatiecartridge. Verwerk de cellen vervolgens nog eens vijf minuten.Om de cellen te kleuren voor fluorescentie-geactiveerde cel sortering, verzamelt u de gedissocieerde celsuspensie in een buisje van 1,5 milliliter. Draag vervolgens 150 microliters cellen over naar elk van drie nieuwe buisjes van 1,5 milliliter en voeg het resterende volume toe aan een vierde buisje van 1,5 milliliter. Gebruik het eerste buisje als ongekleurde controle; voeg 2,5 microliters Hoechst toe aan het tweede buisje, één microliter propidiumjodide aan het derde buisje, en zowel Hoechst als propidiumjodide aan het vierde buisje.Na 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker met rustige rotatie, worden de cel-suspensies door individuele, vooraf bevochtigde 40 micron zeefjes gefilterd in ronde bodembuisjes van vijf milliliter. Plaats vervolgens vier opvangbuisjes met DMEM aangevuld met FBS onder de sorteermonden van de flowcytometer en laad het ongestuifde controlebuisje voor analyse. Gebruik een forward versus side scatter-plot om celdebris uit te sluiten en pas de forward scatter-drempelwaarde en polsbreedte aan om gating van de enkelvoudige cellen mogelijk te maken.Strenge gating is essentieel om de kwaliteit van het verzamelde monster te optimaliseren. Zorg voor de selectie van enkelvoudige cellen door cellulair debris en multicellular aggregaten uit te sluiten. Gebruik de enkelvoudig gekleurde cellen om de drempelwaarde voor de fluorescentie-intensiteit van Hoechst en propidiumjodide vast te stellen in relatie tot het ongekleurde monster.Laad vervolgens het dubbelgekleurde experimentele monster en stel de drie parent gates in zoals zojuist gedemonstreerd. Wanneer de drie parent gates zijn ingesteld, selecteer dan de levende cellen op basis van de afwezigheid van propidiumjodide-kleuring, en stel de DNA-inhoud in door een histogram van celaantallen te plotten op basis van de Hoechst blue-fluorescentie. Stel een gate in voor elk van de drie pieken van toenemende Hoechst blue-fluorescentieconcentratie, die de haploïde, diploïde en tetraploïde cellen vertegenwoordigen, en observeer ten minste 500 000 events op de forward versus side scatter plot.Plot de propidiumjodide-negatieve cellen op basis van hun Hoechst blauwe en rode fluorescentie-intensiteiten. De spermatogonia zullen verschijnen als een side population. De Hoechst blauwe fluorescentie-intensiteit correleert met het DNA-gehalte.Daarom zorgt het instellen van deze gate voorafgaand aan het genereren van de Hoechst blauwe en rode plots voor de selectie van de cellen met de gewenste ploidie. Voor de isolatie van spermatiden wordt de haploïde piek gegatet en wordt de populatie geselecteerd die verschijnt wanneer de Hoechst blauwe en rode fluorescentie worden uitgezet. Voor de isolatie van spermatocyten II wordt de diploïde piek gegatet en wordt de populatie geselecteerd die verschijnt wanneer de Hoechst blauwe en rode fluorescentie worden uitgezet.Voor de isolatie van spermatocyten I wordt de tetraploïde piek gegated en wordt de populatie geselecteerd die verschijnt wanneer de Hoechst blauwe en rode fluorescentie tegen elkaar worden uitgezet. Sorteer vervolgens de geselecteerde subpopulaties in individuele opvangbuisjes om ongeveer 0,5 tot 6 × 10⁶ cellen voor elke celsubset te verzamelen. Celsuspensies verkregen door mechanische dissociatie van vers weefsel, ongekleurd of gekleurd met Hoechst, tonen de aanwezigheid van individuele cellen in verschillende stadia van differentiatie.Belangrijk is dat de cellulaire structuren behouden lijken te blijven, inclusief de flagellen van de spermatozoön. Na uitsluiting van cellulair debris zijn 95 tot 98% van de cellen singlets, waarvan 86 tot 93% levend is. Het uitzetten van de functie van blauw-rode Hoechst-fluorescentie tijdens FACS vergemakkelijkt de identificatie van specifieke populaties testiculaire kiemcellen.Zoals verwacht is de populatie haploïde spermatiden het meest overvloedig, gevolgd door diploïde spermatocyten II en tetraploïde primaire spermatocyten, een patroon dat over verschillende soorten heen behouden blijft. Microscopische analyse van de gesorteerde cellen onthult dat spermatogonia duidelijk, klein, rond, pericentrisch heterochromatine vertonen dat helder kleurt met Hoechst. Spermatocyten zijn grotere, gegranuleerde cellen met gemakkelijk identificeerbare kernen die chromatinevariaties vertonen die kenmerkend zijn voor meiotische cellen in de subpopulatie van spermatocyten I, en door genucleerde of diakinetische kernen in de subpopulaties van spermatocyten II.Spermatiden zijn kleine haploïde cellen met een ronde of langwerpige vorm die van spermatogonia kunnen worden onderscheiden door de aanwezigheid van gelokaliseerde chromocentra. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat Hoechst zowel zeer gevoelig als genotoxisch is en dat de resolutie van de celpopulaties indien nodig kan worden verbeterd door langere incubatieperioden.Na deze procedure kunnen high-throughput omics-methoden worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over epigenetische modificaties of de abundantie en diversiteit van transcripten en eiwitten binnen zoogdiersoorten in een evolutionaire context. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de mannelijke reproductieve biologie om de regulerende mechanismen te verkennen die de progressie van de spermatogenese in verschillende zoogdiersoorten aansturen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe testikelmonsters moeten worden verwerkt voor Hoechst FACS en hoe verschillende typen mannelijke kiemcellen kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd op basis van hun Hoechst-signaal.DNA-bindende kleurstoffen zoals Hoechst en propidiumjodide kunnen zeer gevaarlijk zijn. Draag altijd persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met deze reagentia.

a-standardized-approach-for-multispecies-purification-mammalian-male

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video beschrijft een eenvoudige, tijdsbesparende techniek voor automatische weefsel dissociatie met behulp van de gentleMACS Dissociator naar single-cell suspensies van de muis splenocyten voor te bereiden.

Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse Spleen met de gentleMACS Dissociator

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel opwinding tot het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op longweefsel wordt uitgelegd.

Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Een nieuw protocol voor de mechanische voorbehandeling van testiculaire celsuspensies van knaagdieren materiaal vermijden enzymen en wasmiddelen wordt beschreven. De methode is eenvoudig, snel, reproduceerbaar en maakt goede kwaliteit celsuspensies, die geschikt zijn voor flow sorteren en RNA-extractie zijn.

Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.

Scheiding van spermatogene Cell typen met behulp van STA-PUT Velocity Sedimentatie

De novo mutaties in de mannelijke kiemcellen kunnen bijdragen aan nadelige gezondheidsuitkomsten in volgende generaties. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van een transgenisch knaagdiermodel voor het kwantificeren van mutaties in mannelijke geslachtscellen die worden veroorzaakt door omgevingsfactoren.

Transgene knaagdieren Assay voor het kwantificeren van Male Germ Cell Mutant Frequency

We beschrijven een sorteerstrategie voor muis spermatiden met behulp van flowcytometrie. Spermatiden worden ingedeeld in vier zeer zuivere populaties, waaronder ronde (spermiogenetische stappen 1-9), vroege verlengende (spermiogenetische stappen 10-12), late verlengende (spermiogenetische stappen 13-14) en langwerpige spermatiden (spermiogenetische stappen 15-16). DNA-kleuring, grootte en korreligheid worden gebruikt als selectieparameters.

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

We presenteren een flow flowcytometrieonderzoeken methode om te identificeren gelijktijdig verschillende celtypen opgehaald uit muis hersenen of ruggenmerg. Deze methode kan worden benut om zuivere celpopulaties in neurodegeneratieve ziekten te isoleren of te karakteriseren of om de mate van celtargeting te kwantificeren bij in vivo toediening van virale vectoren of nanodeeltjes.

Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Leer een gestandaardiseerde methode voor het isoleren van mannelijke kiemcellen uit zoogdiertestikels via mechanische dissociatie en FACS-sortering. Deze techniek ondersteunt moleculair onderzoek naar spermatogenese.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie (Video) | JoVE Journal

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Meer video's verkennen