Isolatie van Menselijke Myoblasten, Beoordeling van Myogene Differentiatie, en Opslag Met Calcium Ingangsmeting

Het algemene doel van deze procedure is om een pure populatie van humane myoblasten uit volwassen skeletspier te verkrijgen. Deze cellen worden gebruikt voor functionele studies zoals beoordeling van myogene differentiatie en meting van door store geactiveerde calciumtoetreding. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een snelle, eenvoudige en reproduceerbare isolatie van humane primaire myoblasten mogelijk maakt.

Deze myoblasten zijn de nieuwe ex-vivo om de calciumsignalering tijdens spierregeneratie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het spierveld, zoals het identificeren van de ionische kanalen en de transcriptiefactoren die betrokken zijn bij spierdifferentiatie. Deze methode kan inzicht bieden in genfuncties tijdens humane myogene differentiatie.

Het kan ook worden toegepast op andere studies, zoals het potentieel voor het gebruik van myogene stamcellen om spierdystrofieën te behandelen. Breng het spiermonster over in een steriele zes centimeter plaat, was het monster twee keer met PBS. Verwijder eventueel overgebleven vetweefsel en weeg het monster.

Voeg vervolgens trypsine toe en snijd de spier in stukken kleiner dan twee millimeter groot. Gebruik een 10 milliliter pipette om het weefsel over te brengen naar een 200 milliliter dissociatiebotel met een roerder, en vervolg het verzamelen van gesneden weefsel in trypsine-oplossing totdat de dissociatiebotel tot 90 milliliter gevuld is. Incubeer het weefsel nu in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 60 minuten met zacht roeren.

Na een uur, voeg 10 milliliter FCS toe om de reactie te stoppen en homogeniseer het mengsel met behulp van trituratie. Laad nu 70 micron zeefjes op twee 50 milliliter buisjes en pipet de helft van de celsuspensie door elk zeefje in de filters. Maak vervolgens een suspensie van de cellen in groeimedium en plateer 200.000 cellen op zes centimeter platen met vier milliliter medium.

Incubeer de platen, ververs het medium om de derde dag. Na vijf tot zeven dagen zouden de cellen 70% tot 80% confluërend moeten zijn, bekleur ze dan. Om te beginnen, spoel de plaat van confluëre cellen af met PBS.

Voeg vervolgens één milliliter trypsine-oplossing toe en laat het enzym drie minuten werken. Stop de reactie door twee milliliter medium toe te voegen en verzamel de cellen in een 15 milliliter buisje. Spuit de cellen vervolgens naar beneden en suspendeer ze in één milliliter medium.

Neem vervolgens een celtelling terwijl de cellen op ijs worden bewaard. Voor de feitenanalyse, laad zeven buisjes met 100.000 cellen per buisje. Laad de overgebleven cellen in een achtste buisje voor sortering.

Was de cellen met één milliliter koude fax-buffer, centrifugeer de buisjes en aaspibeer en gooi het supernatant weg. Voeg 200 microliter fax-buffer met de juiste antilichamen terug toe en laat de cellen gedurende 30 minuten op ijs incuberen. Na 30 minuten, was de cellen opnieuw en suspendeer ze in 500 microliter fax-buffer, en sorteer de cellen vervolgens met behulp van een flowcytometer.

Na uitsluiting van de CD45 positieve hematopoëtische cellen, scheid de CD45 negatieve cellen op basis van CD56 expressie. Gate vervolgens de CD56 positieve populatie voor CD34, CD144 en CD146. Heranalyseer een fractie van de gesorteerd populatie, om de zuiverheid te controleren.

Trek nu de humane myoblasten en was ze met vijf milliliter medium. Suspendeer ze vervolgens in één milliliter medium. Breng de suspensie over naar een zes centimeter plaat met vier milliliter medium en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 7% koolstofdioxide.

Voor deze procedure, moet u gecultiveerde myoblasten hebben en vers transvectiemedium maken. Incubeer het medium op kamertemperatuur gedurende 15 tot 20 minuten. Tijdens de medium incubatie, bereidt u de myoblasten voor.

Spoel ze eerst eenmaal met PBS. Trypsineer vervolgens de adherente cellen. Stop de reactie door twee milliliter medium toe te voegen.

Verzamel vervolgens de cellen in een 50 milliliter buisje. Spuit ze naar beneden en suspendeer ze in één milliliter medium. Bereid voor elke transvectie 500.000 cellen in 200 microliter medium voor.

Voeg voor elke 500 microliter transvectiemedium een 200 microliter aliquot cellen toe en meng vervolgens met slechts twee slagen van de pipettenpistool. Laat de reacties vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur doorgaan. Na vijf minuten, breng de reacties over naar 3,5 centimeter kweekschotels, elk met een glazen dekglas.

Voeg vervolgens 1,3 milliliter medium toe voor een eindvolume van twee milliliter en incubeer de schotels. Na 48 uur differentiatie, kunnen de cellen worden geïmmunostreept of geanalyseerd met behulp van calcium beeldvorming. Voor beide opties, was de cellen eerst zorgvuldig twee keer met één milliliter PBS op kamertemperatuur om te wassen.

Probeer de myobuizen los te maken. Voor calciumbeeldvorming, bedek de gewassen cellen met twee micromolair fura-2 AM plus één micromolair threoninezuur in calcium bevattend medium. Laat ze vervolgens ongeveer 30 minuten incuberen voordat u mengt.

Was de cellen vervolgens twee keer met ongewijzigd calcium bevattend medium en incubeer ze vervolgens gedurende 10 tot 15 minuten voor de esterificatie. Verwijder nu het dekglas van een kweekplaat en installeer het in de experimentele kamer. Laad de kamer met calcium bevattend medium, plaats het onder een microscoop en begin met het vastleggen van gegevens.

Fura-2 wordt afwisselend bij 340 en 380 nanometer opgewonden. Het emissielicht wordt verzameld bij 510 nanometer. Het delen van de 340 nanometer beelden door de 380 beelden, levert de beeldverhoudingen op, aangezien de fluctuaties en calciumconcentratie relatief laag zijn, neem elke twee seconden een beeldverhouding op.

Vervang na twee of drie minuten het medium door calciumvrij medium. Bewaak vervolgens gedurende één of twee minuten de activiteit van de door store geactiveerde calcium in de cellen. Voeg vervolgens één micromolair thapsigargine toe