Semiautomated longitudinale Microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse van een naakt-Rat Vertebrale fractuur osteoporose-gerelateerde Model
September 28th, 2017
Het doel van dit protocol is het genereren van een naakte rat Vertebrale compressie osteoporose bedrijfsgerelateerde fractuur model dat kan worden beoordeeld op overlangs in vivo met behulp van een semiautomated microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse.
Het algemene doel van dit chirurgische model en beeldanalysemethode is om de invloed van uw behandeling te observeren op een preklinisch osteoporose-gerelateerd model van wervelcompressiefracturen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in dit gebied van regeneratieve geneeskunde voor gliacellen, zoals wat een effectieve behandeling zou kunnen zijn voor osteoporose-gerelateerde wervelcompressiefracturen, en hoe zo'n behandeling zou kunnen helpen bij botregeneratie? Het grote voordeel van deze techniek is dat het naakte ratten betreft, zodat nieuwe behandelingen in vivo kunnen worden getest zonder zorgen over immuunrejetie.
Bovendien is de botregeneratie die ten grondslag ligt aan deze hier gepresenteerde methode semi-geautomatiseerd, dus het is nauwkeuriger en minder gebruikersafhankelijk dan eerder gepubliceerd. Het uitvoeren van de procedure zal worden gedaan door Doctor Wafa Tawackoli, een onderzoekswetenschapper uit ons laboratorium. Eerst induceert u anesthesie bij een osteoporetische rat met behulp van 5% isofluraange in 100% zuurstof, daarna brengt u over naar een neuskoker op twee tot 3% isofluraange voor onderhoud.
Scheer het buikgebied met een elektrische scheermachine. Veeg af met jodium-gebaseerd antisepticum in 0,5% chloorhexidine gluconaat, gevolgd door 70% ethanol. Gebruik dierlijke zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de anesthesie.
Breng een teenprikstimulus aan om een adequaat niveau van anesthesie te verzekeren. Als er geen reactie wordt opgemerkt, begint u met de procedure. Plaats de verdoofde rat in dorsale rugligging op een verwarmingskussentje ingesteld op 37 graden Celsius en strek de ledematen uit met behulp van een magnetisch fixatieretractiesysteem.
Injecteer de rat subcutaan met carprofen voordat u begint met de chirurgische procedure. Nadat u een snede van vijf tot acht centimeter in de huid hebt gemaakt, beginnend een centimeter onder het processus xiphoideus en door de middenlijn, gebruikt u chirurgische schaar om een snede in de aponeurose te maken door de linea alba om toegang te krijgen tot de buikholte. Gebruik retractoren om de buikholte bloot te leggen.
Verplaats de darmen naar de rechterkant van de rat om de buikslagader en de linker nier bloot te leggen. Gebruik steriel doorweekte gaasjes om de inwendige organen te omwikkelen om uitdroging te voorkomen. Gebruik extra retractoren indien nodig om de aorta bloot te leggen.
Palpeer de lumbale wervelkolom en ga vervolgens verder met het blootleggen. Gebruik thermocauterisatie om de voorste aspect van de lumbale wervellichamen L vier tot vijf bloot te leggen en isoleer ze van het omringende bindweefsel en spieren. Gebruik een wattenstaafje om bloed en restweefsel van de L vier wervels te verwijderen.
Gebruik vervolgens een steriele boor met een diameter van twee centimeter om een botdefect van vijf millimeter diep in het centrum van het blootgelegde voorste aspect van het wervellichaam te boren. Breng minimale druk uit om alleen door de ventrale cortex en onderliggende trabeculair bot te boren. Vermijd boren door de dorsale cortex.
Boor vervolgens de L vijf wervels op dezelfde manier om twee defecten per rat te creëren. Wanneer het boren voltooid is, brengt u de darmen terug in de buikholte en verwijdert u de retractoren. Gebruik vervolgens vicryl synthetische absorbeerbare chirurgische hechting in een continue patroon om de aponeurose te hechten.
Sluit de huid met een 4-0 monofilament nylon niet-absorbeerbare hechting in een eenvoudig onderbroken patroon. Breng vervolgens 100 microliters topische huidlijm aan bovenop en tussen de huidhechtingen om de volledige sluiting van de huid te garanderen. Nadat u de rat heeft geïnjecteerd met lactated ringer's-oplossing van 37 graden Celsius om hypothermie en uitdroging te voorkomen en buprenorfine voor pijnverlichting na de operatie, laat u het dier herstellen van de anesthesie op het verwarmingskussen.
Op de dag na de chirurgische procedure induceert u anesthesie met isofluraange zoals eerder. Scan de rat met behulp van een in vivo micro-CT-scanner. Na het scannen en herstel van de anesthesie, brengt u de rat terug naar de kooi.
Om de wervelgegevens voor analyse te scheiden, klikt u op het micro-CT-evaluatieprogramma en selecteert u het monster uit het menu. Gebruik vervolgens de muis om individuele wervels op een doorsnede te contureren. Gebruik de Z-balk om naar de volgende doorsnede te gaan en contuur de individuele wervels op dezelfde manier.
Sla het gecontureerde wervellichaam op als een afzonderlijk bestand door op bestand te klikken en elke paar plakjes GOBJ op te slaan. Nadat u de referentiewervel heeft ingesteld, importeert u deze naar een micro-CT-omgeving. Pas de voor de referentiewervel gedefinieerde VOI toe op de geregistreerde doelwervel door op micro-CT-evaluatieprogramma, bestand, GOBJ laden te klikken en de eerder gemaakte GOBJ te selecteren.
Stuur ten slotte de VOI voor evaluatie met behulp van een micro-CT-evaluatieprogramma. Deze frontale 3D-afbeelding toont een representatief werveldefect op een dag na degeneratie van het defect. Botformatie in het defect wordt in rood weergegeven.
Dit is een sagittale 2D-afbeelding van hetzelfde gebied, en tenslotte een axiale 2D-afbeelding. Zoals hier te zien is, vindt botformatie in de loop van de tijd plaats en wordt gedetecteerd met longitudinaal beeldvormen. Botvolumedichtheid en schijnbare dichtheid werden berekend en vergeleken met behulp van een herhaalde metingen two-way ANOVA met Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen.
Zoals hier te zien is, nemen de botvolumedichtheid en schijnbare dichtheid significant toe vanaf twee weken na het ontstaan van het werveldefect. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals histologie en immunohistochemie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke cellen aanwezig zijn en welke eiwitten in het defect worden aangemaakt. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u meerdere werveldefecten in naakte ratten kunt creëren en botregeneratie over tijd in deze defecten kunt analyseren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het creëren van een naakt-ratmodel van osteoporose-gerelateerde wervelcompressiefracturen, waardoor een in vivo evaluatie mogelijk is met behulp van semi-geautomatiseerde microcomputed tomografie. Deze aanpak vergemakkelijkt het onderzoek naar mogelijke behandelingen voor botregeneratie in osteoporotische omstandigheden.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschappelijke discipline
- Neurowetenschappen
- Botregeneratie
- Osteoporose onderzoek
Achtergrond
- Osteoporose leidt tot een verhoogd risico op fracturen, met name in de wervelkolom.
- Naakt-ratten worden gebruikt om immuunafstoting bij behandelingsstudies te voorkomen.
- Microcomputed tomografie biedt een gedetailleerde structurele analyse van botten.
- Het begrijpen van botregeneratiemechanismen is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
Doel van het onderzoek
- Een betrouwbaar model opzetten voor het onderzoek van osteoporose-gerelateerde fracturen.
- De effectiviteit van nieuwe behandelingen op botregeneratie evalueren.
- De nauwkeurigheid van structurele analyse verbeteren door middel van semi-geautomatiseerde methoden.
Gebruikte methoden
- Inductie van anesthesie met isofluraangebruik in zuurstof.
- Creatie van wervelcompressiefracturen bij naakt-ratten.
- Longitudinale evaluatie van botgenezing met behulp van microcomputed tomografie.
- Beoordeling van behandelingseffecten op botregeneratie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van wervelcompressiefracturen in het model.
- De haalbaarheid van semi-geautomatiseerde analyse voor structurele evaluatie is aangetoond.
- Mogelijke behandelingen tonen belofte in het verbeteren van botregeneratie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de effectiviteit van osteoporosebehandelingen.
Conclusies
- Het naakt-ratmodel is effectief voor het onderzoek van osteoporose-gerelateerde fracturen.
- Semi-geautomatiseerde microcomputed tomografie verbetert de nauwkeurigheid van de analyse.
- Dit onderzoek ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor osteoporose.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Longitudinal semiautomated microcomputed tomography (μCT) enables precise, reproducible quantification of bone regeneration in preclinical osteoporosis-related vertebral fracture models. This approach supports predictive confidence in evaluating novel bone regenerative therapies and de-risks translational advancement by standardizing structural outcome measures. The method is positioned to inform early discovery, target validation, and preclinical decision-making for osteoporosis and bone tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of bone regeneration hypotheses in a controlled, immunodeficient in vivo system.
- Supports functional target validation by quantifying new bone formation over time in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating treatment effects from immune confounders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, semiautomated workflow for generating and analyzing vertebral defects across cohorts.
- Delivers reproducible, quantitative μCT outputs suitable for comparative screening of regenerative compounds or biomaterials.
- Enables high-content, longitudinal assessment of bone volume and density changes, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for osteoporosis and vertebral fracture repair.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by using clinically relevant imaging and analysis metrics.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated in vivo efficacy in a reproducible model.
Pipeline & Workflow Integration
This semiautomated μCT-based analysis integrates from early discovery through preclinical evaluation, enabling seamless transition of candidates from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Quantitative imaging supports hypothesis-driven assessment of bone regeneration mechanisms.
- Screening: Standardized defect creation and imaging facilitate reproducible, scalable compound evaluation.
- Analytics: Automated registration and volume-of-interest analysis yield robust, comparable structural metrics.
- Translational Research: Longitudinal imaging aligns with clinical endpoints and supports biomarker development.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other longitudinal imaging-based bone and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone regeneration studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of in vivo imaging analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, μCT imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to in vivo μCT scanners and compatible analysis software for automated registration and VOI definition.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to other bone or tissue defect models where longitudinal imaging is beneficial.
- Dependent on animal model suitability and imaging infrastructure availability.
