Semiautomated longitudinale Microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse van een naakt-Rat Vertebrale fractuur osteoporose-gerelateerde Model
28 september 2017
Het doel van dit protocol is het genereren van een naakte rat Vertebrale compressie osteoporose bedrijfsgerelateerde fractuur model dat kan worden beoordeeld op overlangs in vivo met behulp van een semiautomated microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse.
Het algemene doel van dit chirurgische model en beeldanalysemethode is om de invloed van uw behandeling te observeren op een preklinisch osteoporose-gerelateerd model van wervelcompressiefracturen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in dit gebied van regeneratieve geneeskunde voor gliacellen, zoals wat een effectieve behandeling zou kunnen zijn voor osteoporose-gerelateerde wervelcompressiefracturen, en hoe zo'n behandeling zou kunnen helpen bij botregeneratie? Het grote voordeel van deze techniek is dat het naakte ratten betreft, zodat nieuwe behandelingen in vivo kunnen worden getest zonder zorgen over immuunrejetie.
Bovendien is de botregeneratie die ten grondslag ligt aan deze hier gepresenteerde methode semi-geautomatiseerd, dus het is nauwkeuriger en minder gebruikersafhankelijk dan eerder gepubliceerd. Het uitvoeren van de procedure zal worden gedaan door Doctor Wafa Tawackoli, een onderzoekswetenschapper uit ons laboratorium. Eerst induceert u anesthesie bij een osteoporetische rat met behulp van 5% isofluraange in 100% zuurstof, daarna brengt u over naar een neuskoker op twee tot 3% isofluraange voor onderhoud.
Scheer het buikgebied met een elektrische scheermachine. Veeg af met jodium-gebaseerd antisepticum in 0,5% chloorhexidine gluconaat, gevolgd door 70% ethanol. Gebruik dierlijke zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de anesthesie.
Breng een teenprikstimulus aan om een adequaat niveau van anesthesie te verzekeren. Als er geen reactie wordt opgemerkt, begint u met de procedure. Plaats de verdoofde rat in dorsale rugligging op een verwarmingskussentje ingesteld op 37 graden Celsius en strek de ledematen uit met behulp van een magnetisch fixatieretractiesysteem.
Injecteer de rat subcutaan met carprofen voordat u begint met de chirurgische procedure. Nadat u een snede van vijf tot acht centimeter in de huid hebt gemaakt, beginnend een centimeter onder het processus xiphoideus en door de middenlijn, gebruikt u chirurgische schaar om een snede in de aponeurose te maken door de linea alba om toegang te krijgen tot de buikholte. Gebruik retractoren om de buikholte bloot te leggen.
Verplaats de darmen naar de rechterkant van de rat om de buikslagader en de linker nier bloot te leggen. Gebruik steriel doorweekte gaasjes om de inwendige organen te omwikkelen om uitdroging te voorkomen. Gebruik extra retractoren indien nodig om de aorta bloot te leggen.
Palpeer de lumbale wervelkolom en ga vervolgens verder met het blootleggen. Gebruik thermocauterisatie om de voorste aspect van de lumbale wervellichamen L vier tot vijf bloot te leggen en isoleer ze van het omringende bindweefsel en spieren. Gebruik een wattenstaafje om bloed en restweefsel van de L vier wervels te verwijderen.
Gebruik vervolgens een steriele boor met een diameter van twee centimeter om een botdefect van vijf millimeter diep in het centrum van het blootgelegde voorste aspect van het wervellichaam te boren. Breng minimale druk uit om alleen door de ventrale cortex en onderliggende trabeculair bot te boren. Vermijd boren door de dorsale cortex.
Boor vervolgens de L vijf wervels op dezelfde manier om twee defecten per rat te creëren. Wanneer het boren voltooid is, brengt u de darmen terug in de buikholte en verwijdert u de retractoren. Gebruik vervolgens vicryl synthetische absorbeerbare chirurgische hechting in een continue patroon om de aponeurose te hechten.
Sluit de huid met een 4-0 monofilament nylon niet-absorbeerbare hechting in een eenvoudig onderbroken patroon. Breng vervolgens 100 microliters topische huidlijm aan bovenop en tussen de huidhechtingen om de volledige sluiting van de huid te garanderen. Nadat u de rat heeft geïnjecteerd met lactated ringer's-oplossing van 37 graden Celsius om hypothermie en uitdroging te voorkomen en buprenorfine voor pijnverlichting na de operatie, laat u het dier herstellen van de anesthesie op het verwarmingskussen.
Op de dag na de chirurgische procedure induceert u anesthesie met isofluraange zoals eerder. Scan de rat met behulp van een in vivo micro-CT-scanner. Na het scannen en herstel van de anesthesie, brengt u de rat terug naar de kooi.
Om de wervelgegevens voor analyse te scheiden, klikt u op het micro-CT-evaluatieprogramma en selecteert u het monster uit het menu. Gebruik vervolgens de muis om individuele wervels op een doorsnede te contureren. Gebruik de Z-balk om naar de volgende doorsnede te gaan en contuur de individuele wervels op dezelfde manier.
Sla het gecontureerde wervellichaam op als een afzonderlijk bestand door op bestand te klikken en elke paar plakjes GOBJ op te slaan. Nadat u de referentiewervel heeft ingesteld, importeert u deze naar een micro-CT-omgeving. Pas de voor de referentiewervel gedefinieerde VOI toe op de geregistreerde doelwervel door op micro-CT-evaluatieprogramma, bestand, GOBJ laden te klikken en de eerder gemaakte GOBJ te selecteren.
Stuur ten slotte de VOI voor evaluatie met behulp van een micro-CT-evaluatieprogramma. Deze frontale 3D-afbeelding toont een representatief werveldefect op een dag na degeneratie van het defect. Botformatie in het defect wordt in rood weergegeven.
Dit is een sagittale 2D-afbeelding van hetzelfde gebied, en tenslotte een axiale 2D-afbeelding. Zoals hier te zien is, vindt botformatie in de loop van de tijd plaats en wordt gedetecteerd met longitudinaal beeldvormen. Botvolumedichtheid en schijnbare dichtheid werden berekend en vergeleken met behulp van een herhaalde metingen two-way ANOVA met Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen.
Zoals hier te zien is, nemen de botvolumedichtheid en schijnbare dichtheid significant toe vanaf twee weken na het ontstaan van het werveldefect. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals histologie en immunohistochemie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke cellen aanwezig zijn en welke eiwitten in het defect worden aangemaakt. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u meerdere werveldefecten in naakte ratten kunt creëren en botregeneratie over tijd in deze defecten kunt analyseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het creëren van een naaktraattenmodel van osteoporose-gerelateerde vertebrale compressiefracturen, waardoor in vivo evaluatie met behulp van semiautomatische microcomputertomografie mogelijk is. Deze benadering faciliteert de studie naar potentiële behandelingen voor botregeneratie bij osteoporotische aandoeningen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Botregeneratie
- Osteoporose-onderzoek
Achtergrond
- Osteoporose leidt tot een verhoogd fractuurrisico, in het bijzonder in de wervels.
- Nude-ratten worden gebruikt om immuunafstoting in behandelingsstudies te voorkomen.
- Micro-computertomografie maakt gedetailleerde structurele analyse van botten mogelijk.
- Inzicht in de mechanismen van botregeneratie is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar model vast te stellen voor het bestuderen van fracturen gerelateerd aan osteoporose.
- Om de effectiviteit van nieuwe behandelingen voor botregeneratie te evalueren.
- Om de nauwkeurigheid van structurele analyse te verbeteren via semiautomatische methoden.
Gebruikte methoden
- Inductie van anesthesie met isofluraan in zuurstof.
- Het creëren van vertebrale compressiefracturen bij naakte ratten.
- Longitudinale evaluatie van botgenezing met behulp van micro-computertomografie.
- Beoordeling van de effecten van de behandeling op botregeneratie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle inductie van vertebrale compressiefracturen in het model.
- De haalbaarheid van semiautomatische analyse voor structurele evaluatie is aangetoond.
- Potentiële behandelingen bleken veelbelovend voor het verbeteren van botregeneratie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de effectiviteit van osteoporosebehandelingen.
Conclusies
- Het naakte ratmodel is effectief voor het bestuderen van fracturen gerelateerd aan osteoporose.
- Semi-geautomatiseerde microcomputertomografie verbetert de nauwkeurigheid van de analyse.
- Dit onderzoek ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor osteoporose.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Longitudinale semiautomatische microcomputertomografie (μCT) maakt een precieze, reproduceerbare kwantificering van botregeneratie mogelijk in preklinische modellen van osteoporose-gerelateerde wervelfracturen. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij het evalueren van nieuwe regeneratieve bottherapieën en vermindert de risico's bij translationele vooruitgang door het standaardiseren van structurele uitkomstmaten. De methode is bedoeld om vroege ontdekking, targetvalidatie en preklinische besluitvorming voor portfolio's op het gebied van osteoporose en botweefseltechniek te informeren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt een strikte toetsing van hypothesen over botregeneratie mogelijk in een gecontroleerd, immunodeficiënt in vivo systeem.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door de vorming van nieuw bot in de loop van de tijd te kwantificeren als reactie op kandidaat-interventies.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering door behandelingseffecten te isoleren van immuun-confounders.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, halfautomatische workflow voor het genereren en analyseren van vertebrale defecten over verschillende cohorten heen.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve μCT-resultaten die geschikt zijn voor comparatieve screening van regeneratieve verbindingen of biomaterialen.
- Maakt hoogwaardige, longitudinale beoordeling van veranderingen in botvolume en -dichtheid mogelijk, wat bijdraagt aan een robuuste assay-ontwikkeling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Slaat aan bij ziekterelevante eindpunten voor osteoporose en herstel van vertebrale fracturen.
- Garandeert continuïteit van discovery tot preklinische validatie door gebruik te maken van klinisch relevante beeldvormings- en analysemetrieken.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten met aangetoonde in vivo effectiviteit in een reproduceerbaar model.
Integratie van pijplijn en workflow
Deze semiautomatische μCT-gebaseerde analyse integreert alle stappen van vroege ontdekking tot preklinische evaluatie, waardoor een naadloze overgang van kandidaten mogelijk is van hypotheseonderzoek naar lead-identificatie en translationele validatie.
- Discovery Biology: Kwantitatieve beeldvorming ondersteunt hypothese-gestuurde beoordeling van mechanismen van botregeneratie.
- Screening: Gestandaardiseerde defectcreatie en beeldvorming faciliteren reproduceerbare en schaalbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Geautomatiseerde registratie en analyse van het volume van interesse leveren robuuste, vergelijkbare structurele metrieken op.
- Translational Research: Longitudinale beeldvorming sluit aan bij klinische eindpunten en ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers.
- Enterprise Reuse: De workflow is aanpasbaar voor andere longitudinale, op beeldvorming gebaseerde bot- en weefselmodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar botregeneratie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid van in vivo beeldanalyses.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door het bieden van robuuste kwantitatieve eindpunten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van kandidaten voor regeneratieve geneeskunde mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in kleine dierchirurgie, μCT-beeldvorming en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist toegang tot in vivo μCT-scanners en compatibele analysesoftware voor geautomatiseerde registratie en VOI-definitie.
- Maakt standaardisatie van beeldvormingsprotocollen en data-analysepipelines tussen teams noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan andere bot- of weefseldefectmodellen waarbij longitudinale beeldvorming voordelig is.
- Afhankelijk van de geschiktheid van het diermodel en de beschikbaarheid van de beeldvormingsinfrastructuur.
