Name: Experimentele modellen om de neuroprotectie van zure postconditioning te bestrijden tegen cerebrale ischemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer zure postconditioning voor neuroprotectie tegen cerebrale ischemie met in vitro corticostriatale sneden en een in vivo middelste cerebrale arterie occlusie model. Deze methode ondersteunt onderzoek naar nieuwe strategieën voor beroertetherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 en 81402907), Zhejiang Provinciale Natuurwetenschappenstichting (LR15H310001) en het Programma voor Zhejiang Leading Team van S &amp; T Innovatie Team (2011R50014).

Alle experimenten werden goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Zhejiang Experimentatie Dieren Experimentatie en waren in volledige overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. Er werden inspanningen gedaan om pijn of ongemak te minimaliseren en het minimale aantal dieren werd gebruikt. 1. OGD van Corticostriatale Plakjes <ol><li> Oplossingspreparatie: <ol><li> Bereid 1000 ml r-ACSF (124 mmol / L NaCl, 5 mmol / l KCI, 1,25 mmol / l KH 2PO 4, 2 mmol / l MgSO4, 26 mmol / l NaHCO3, 2 mmol / l CaCl2, 10 mmol / L glucose, uiteindelijke pH 7,4). Bubble met 5% CO 2 en 95% O 2 gedurende het experiment. </li><li> Bereid 200 ml glucosevrije ACSF (gf-ACSF) zoals boven maar exclusief glucose, bubbelde met 5% CO 2 en 95% N 2 . Bubbel de gassen 30 minuten voor het aanbrengen op brAi plakjes om het zuurstofgehalte in de oplossing te verminderen. Blijf doorborrelen tot de OGD procedure is voltooid. </li><li> Bereid zuur ACSF (a-ACSF) door 200 ml r-ACSF met 20% CO 2 en 80% O 2 te equilibreren. Bubbel de gassen gedurende 30 minuten voordat u op breinschijfjes aanbrengt om de pH van de oplossing tot pH 6,8 te verminderen en door te blazen tot de APC-procedure is afgerond. </li><li> Plaats drie weefselhouders in respectievelijk r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF. </li></ol></li><li> Brainschijfvoorbereiding: Opmerking: 8-jarige mannelijke C57Bl / 6J-muizen werden in deze studie gebruikt. De dieren werden onder gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 ° C) gehuisvest, met een 12-uur lange donkere cyclusperiode en toegang tot gepelleteerde voedsel en water. <ol><li> Offer een muis met een overdosis van isofluraan in een inductiekamer. Decapiteer de muis. Dissect de hersenen met behulp van kleine scharen en tang. Verwijder de hersenen met een dunne spatel en laat het zorgvuldig in een glazen bekercontact komenIjskoud r-ACSF in evenwicht gebracht met 5% CO 2 en 95% O 2 . OPMERKING: Deze stappen moeten zo snel maar nauwgezet mogelijk worden uitgevoerd. </li><li> Houd de hersenen in de ijskoude r-ACSF gedurende 5 minuten. Stel de gasdruk in om bewegingen van de hersenen te vermijden. </li><li> Plaats de cryoprecipitaatlijm op de vibratomeerplaat in twee stroken. Leg een stukje 3% agarose op de lijmstrip van het mes om de hersenen te ondersteunen. </li><li> Omkeer een 10 cm Petri-schotel op ijs en zet dan een filterpapier op de schotel. Vochtig het filterpapier met druppels ijskoud r-ACSF. </li><li> Breng de hersenen naar het filterpapier met tang. Knip de voorpaal en de cerebellum af met knip en tang. OPMERKING: De dwarsdoorsneden moeten zo glad mogelijk zijn en verticaal naar sagittaalvlak. </li><li> Plaats het resterende hersenweefsel verticaal op de andere lijmstrip en houd de hersenen tegen de agarose leunend. Voeg ijskoude r-ACSF toe aan het snijreservoirDe hersenen onderdompelen en ijs toevoegen aan het ijshoudergebied. Bewaar de r-ACSF in het reservoir met 5% CO 2 en 95% O 2 . </li><li> Verhoog het reservoir en pas de positie van de scheermes aan om de scheermes zo dicht bij de hersenen mogelijk te plaatsen en net boven de hersenen. </li><li> Kies de &quot;CONT&quot; -modus om de hersensecties continu te snijden. Stel de snijdikte in op 400 μm, trillingsfrequentie tot 6 - 8 en snelheid tot 3 - 4. Druk op de knop &quot;start / stop&quot; om automatisch te snijden. </li><li> Knip het punt van een 3 ml Pasteur pipette af om een ​​opening te maken die overeenstemt met de grootte van de hersenschijfjes. OPMERKING: De opening moet groot genoeg zijn om extra schade aan de hersenschijfjes te vermijden. </li><li> Teken vijf breinschijfjes één voor één met de tip-cutPasteur-pipet en plaats ze in de weefselhouder in ijskoude r-ACSF met 5% CO 2 en 95% O 2 . Verzamel niet de eerste geproduceerde plak. Stel de gasdruk in de luchtD bewegingen van de hersenen plakjes. OPMERKING: De breinschijfjes mogen elkaar niet bedekken. </li><li> Leg breinschijfjes met r-ACSF bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en daarna nog eens 10 minuten bij 37 ° C in een waterbad om synaptische functies te herstellen. </li></ol></li><li> OGD en APC: <ol><li> Plaats gf-ACSF en a-ACSF in een waterbad van 37 ° C en bel de buffers met de bijbehorende gassen zoals hierboven vermeld in 1.1.2 en 1.1.3 gedurende 30 minuten. </li><li> Laat een stukje in r-ACSF als een controle. Breng de andere vier breinschijfjes zorgvuldig in de weefselhouder met voorverhitte gf-ACSF en incubeer gedurende 15 minuten. Breng de plakjes terug in de weefselhouder in r-ACSF om reperfusie te bereiken. </li><li> Om het tijdvenster van APC te bestuderen, overstappen één snede rechtstreeks van gf-ACSF naar a-ACSF. Vervolgens de andere drie plakjes eerst naar r-ACSF, en verplaats daarna twee keer naar de weefselhouder in respectievelijk a-ACSF 5 en 15 minuten na reperfusie. </li><li> IncubatE de 3 plakjes in a-ACSF gedurende 3 minuten en geef ze vervolgens terug naar r-ACSF. Incubeer de drie plakjes in r-ACSF gedurende nog eens 1 uur. Stel de resterende segmenten in r-ACSF als de OGD-groep in. </li><li> Voor een dosis respons studie, verplaats alle vier plakjes aan de weefselhouder in r-ACSF, eerst na OGD en incubeer gedurende 5 minuten. Verlaat dan een snij in r-ACSF als de OGD-groep en verplaats de overige drie plakjes naar a-ACSF. Incubeer de plakjes in a-ACSF respectievelijk respectievelijk 1, 3 en 5 minuten en laat ze vervolgens terug naar r-ACSF. Incubeer de drie plakjes in r-ACSF gedurende nog eens 1 uur. </li></ol></li><li> Slice viability determination: <ol><li> Bereid 0,25% 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydrochloride (TTC) normale zoutoplossing op. Voeg 1,25 g TTC poeder toe aan 500 ml normale zoutoplossing. OPMERKING: Nadat het poeder volledig is opgelost, breng de oplossing over in een 24-putjesplaat (500 μL per putje), bedekt met folie en opslaan bij 4 ° C. TTC en weefsel gekleurd met TTC zijn licht sensitive. </li><li> Breng de plakken over in een 24-putjesplaat (een stuk per putje) die TTC-oplossing bevat en de plak in de oplossing uitrekken. Incubeer de plakjes in TTC-oplossing bij 37 ° C in een ondiep waterbad gedurende 30 minuten. </li><li> Breng de plakken over in schone 1,5 ml centrifugebuizen die in folie zijn bedekt en meet het droge gewicht van de plakjes. </li><li> Voeg ethanol / dimethylsulfoxide (1: 1) in de centrifugebuizen (v: w = 10: 1) om formazan te extraheren. Incubeer de plakjes in ethanol / dimethylsulfoxide bij kamertemperatuur weg van het licht gedurende 24 uur. </li><li> Voeg alle ethanol / dimethylsulfoxide in de buizen in een 96-putjesplaat en meet de absorptie bij 490 nm door een plaatlezer. </li><li> Normaliseer de absorptie op het droge gewicht van de plak en expresseer de levensvatbaarheid als percentage van de controleschijf. </li></ol></li></ol> 2. MCAO <ol><li> Voorbereiding: <ol><li> Desinfecteer de werkbank, het oppervlak van de Laser Doppler FlowmetrY (LDF) instrument en zijn accessoires met 70% ethyl alcohol. </li><li> Voorbereiden autoclave instrumenten: twee scharen, 10 cm; Twee tang, 10 cm; Een oftalmische tang, 11 cm; Een micro-oogschaar, 9 cm; Een microvessel klem, 1,8 cm; Oneneedle drive, r 12,5 cm; Verscheidene chirurgische hechtingen (△ 1/2 4 × 10); wattenstaafjes. </li><li> Bereid een spuit (zonder naald) op met een zoutoplossing om een ​​gehydrateerd bedieningsgebied te handhaven. </li><li> Bereid het anesthesiegas (100% O 2 + isofluraan). </li></ol></li><li> Detectie van de bloedstroom van de hersenen: <ol><li> Stel het LDF-instrument op. </li><li> Injecteer pijnstillers intraperitoneaal in de muis: metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg en buprenorfine 0,1 mg / kg. </li><li> Plaats de muis in een inductiekamer met 4% isofluraan in zuurstof om het te verdovend tot spontane beweging van het lichaam en de vibrissae stopt. </li><li> Plaats de muis in een slechte positie met zijn neus in de steek geplaatstE neuskegel en behoud van isofluraan bij 1,5% voor de daaropvolgende procedure. </li><li> Breng dexpanthenol oogsalf aan beide ogen aan. </li><li> Desinfecteer het hoofd met 70% ethyl alcohol. </li><li> Maak een juiste paramedische huidinsnijding tussen de ogen en de oren met behulp van een scalpel om de bregma bloot te stellen. </li><li> Vryf de schedel met steriele katoen. </li><li> Breng 1 tot 2 druppels chirurgische lijm aan op het oppervlak van de schedel. </li><li> Plaats de tip van de glasvezel sonde 5 mm caudal aan de bregma en 6 mm lateraal aan de middellijn. </li><li> Begin met het opnemen van de bloedstroom op de computersoftware. Wacht tot een stabiele bloedstroom basislijn optreedt en plaats dan een 20 μL katalysator op de lijm om de sonde vast te zetten. OPMERKING: een ideale basislijn moet meer dan 500 flux zijn. </li><li> Als de basislijn minder dan 200 flux is, pas de positie fijn om een ​​geschikte basislijn te krijgen. Houd de sonde vast aan de schedel voor de duur van het experiment. </li><li> Desinfecteer het hoofd met iodophor afTer bevestiging van de glasvezel sonde. </li></ol></li><li> MCAO: <ol><li> Plaats de anesthetiseerde muis (met LDF-sonde bevestigd aan de schedel) in een rustige positie en houd de lichaamstemperatuur met behulp van een warmtelamp door de operatie. Desinfecteer de nek met 70% ethyl alcohol. </li><li> Maak een paramedische huidinsnijding in de nek met behulp van een scalpel; Ontleed de zachte weefsels met pincet om de schepen bloot te stellen. Voeg een druppel zoutoplossing toe aan de blootgestelde weefsels om ze gedroogd te houden. </li><li> Dissecteer de gemeenschappelijke halsslagader van het omliggende weefsel en de vagus-zenuw met behulp van oftalmische tang. Wees voorzichtig om de vagus zenuw niet te beschadigen. Desinfecteer de huid van de nek opnieuw met iodophor na de blootstelling van de gewone halsslagader. </li><li> Plaats een microvessel klem op het distale uiteinde van de gewone halsslagader en bind dan een dode knoop met 6-0 zijden hechten aan het proximale uiteinde. Plaats de klem zo proximaal mogelijk voor de volgende werkzaamheden. Zorg ervoor dat de lengte vanHet schip tussen de klem en de dode knoop is zo lang mogelijk voor de volgende werkzaamheden. </li><li> Maak een tijdelijke hechting proximaal aan de klem door een losse knoop vast te binden. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte is tussen twee knopen voor monofilament inbrengen. </li><li> Maak een kleine lengte tussen de twee knopen met een micro-oogschaar. Zorg ervoor dat de incisie zo dicht bij de dode knoop mogelijk is voor latere operaties. Wees voorzichtig om het vaartuig niet af te snijden. </li><li> Steek een 12 mm dikke monofilament door de insnijding om het slagaderlumen in te voeren en een paar mm verder te maken. Draai de losse knop om de punt van de monofilament vast en verwijder de klem. </li><li> Bevorder het filament in de inwendige halsslagader (10 mm om de middelste hersenslagader te sluiten) met oftalmische tang totdat de LDF-software een scherpe daling (&gt; 80% reductie van de basisbloedstroom) in de bloedstroom laat zien. Noteer de starttijd van de occlusie. OPMERKING: LDF instrument setup isBeschreven in sectie 2.2. </li><li> Ontwijk de middelste hersenslagader gedurende 1 uur. Knip de LDF-sonde uit en zet de muizen in een incubator van 30 ° C gedurende de duur van de okklusie. </li></ol></li><li> Reperfusie en APC: <ol><li> Re-anesthetiseer de dieren met isofluraan zoals hierboven beschreven 55 minuten na het begin van de okklusie. Plaats en fix muizen in een rugliggende positie. Open de nekinsnijding en laat de gemeenschappelijke halsslagader terug. </li><li> Verwijder de filament voorzichtig met oogmassa na de okklusieperiode om reperfusie te bereiken en draai de tijdelijke hechting in een permanente door de knoop aan te trekken. </li><li> Voor de acidose behandeling, verander het gas dat door de neuskegel wordt ingeademd naar de menggassen die 5, 50 of 100 minuten na reperfusie bevatten met 20% CO 2 , 20% O 2 en 60% N 2 gedurende 5 minuten. Sluit de incisie met een onderbroken chirurgische hechting. </li><li> Plaats muizen in een warmtekooi van 30 ° C tot muizen het bewustzijn herstellenEn ga dan de muizen terug om schoon, individuele kooien te reinigen. Geef muizen een petrischaal water en vochtig vocht. Monitor de muizen nauw na de operatie voor overmatige pijn en dood. </li></ol></li><li> Brain Infarct volumemeting: <ol><li> Meet het infarctvolume van de hersenen door gebruik te maken van TTC-kleuring 24 uur na reperfusie. </li><li> Bereid 0,25% TTC-oplossing zoals vermeld in stap 1.4.1 voorafgaand aan de aangegeven tijd van het offeren. Breng de oplossing over in een 24-putjesplaat (1 ml per putje), bedekt met folie en sla het op bij 4 ° C. OPMERKING: TTC en weefsel gekleurd met TTC zijn lichtgevoelig. </li><li> Op 24 uur na reperfusie, offer het dier met een overdosis van isofluraan in een inductiekamer. Decapiteer de muizen. Dissect de hersenen met behulp van kleine scharen en tang. Onderzoek bloedpunten op de hersenen om de muizen die subarachnoïdale hemorragie ondergaan in de Circle of Willis uit te sluiten. </li><li> Plaats de hersenen op een schone glijbaan op -20 °<html> ; C ijspakketje Plaats de hersenen en de glazen glijbaan in een koelkast van -20 ° C gedurende 5 minuten om de hersenen makkelijker te snijden. </li><li> Verwijder de hersenen en de glazen glijbaan van -20 ° C en zet ze terug op de -20 ° C ijspak. Dissecteer de voorpaal en de cerebellum met mes en tang. </li><li> Snijd de breinsecties horizontaal tot een 1 mm dikte met een mes om 5 plakjes te produceren. Breng de plakjes in de 24-putjesplaat met TTC-oplossing (1 stuk per putje) met tang en steek de plakjes uit in de oplossing. Incubeer de plakjes in TTC-oplossing bij 37 ° C in een ondiep waterbad gedurende 30 minuten. </li><li> Aspireer de TTC oplossing. Voeg 10% formaldehyde (1 ml per putje) toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Leg de plakjes in de volgorde waarin ze op een cellofaanblad werden gesneden en scan de segmenten in de fotografische plaatbeelder. </li><li> Analyseer de infarctgrootte als een percentage van de gehele breinschijf met behulp van ImageJ analyse softwareLass = &quot;xref&quot;&gt; 8 gebaseerd op visuele identificatie; Zie figuur 2 (links). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrupting+reperfusion+as+a+stroke+therapy%3A+ischemic+postconditioning+reduces+infarct+size+after+focal+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Leconte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+hypoxic+postconditioning+protects+against+cerebral+ischemia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse.</a> Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).</li>
<li>Fan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+lack+of+glucose+but+not+O2+is+involved+in+ischemic+postconditioning-induced+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurosci+Ther%22%5BJournal%5D)">Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection.</a> CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).</li>
<li>Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+limb+perconditioning+%5Bcorrected%5D+and+postconditioning%3A+will+it+translate+into+a+promising+treatment+for+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke.</a> Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).</li>
<li>Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+remote+ischemic+postconditioning+protects+against+focal+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats.</a> Brain Res. 1288, 88-94 (2009).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+delayed+remote+limb+ischemic+postconditioning%3A+role+of+mitochondrial+K%28ATP%29+channels+in+a+rat+model+of+focal+cerebral+ischemic+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+limb+ischemic+postconditioning+protects+mouse+brain+against+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+via+upregulating+expression+of+Nrf2%2C+HO-1+and+NQO-1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice.</a> Int J Neurosci. , 1-8 (2015).</li>
<li>Fan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+neuroprotective+strategy+for+ischemic+stroke%3A+transient+mild+acidosis+treatment+by+CO2+inhalation+at+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARK2-dependent+mitophagy+induced+by+acidic+postconditioning+protects+against+focal+cerebral+ischemia+and+extends+the+reperfusion+window%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window.</a> Autophagy. 0, (2017).</li>
<li>Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oxygen+consumption+of+slices+from+kidney%2C+brain%2C+cortex+and+liver+in+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia.</a> Nature. 209 (5020), 305(1966).</li>
<li>Lynch, G., Schubert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+vitro.+brain+slices+for+multidisciplinary+studies+of+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function.</a> Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).</li>
<li>Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+preconditioning+reduces+purkinje+cell+death+in+an+in+vitro+model+of+rat+cerebellar+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia.</a> Neuroscience. 118 (1), 99-106 (2003).</li>
<li>Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+real-time+monitoring+of+glutathione+redox+status+in+single+pyramidal+neurons+in+organotypic+hippocampal+slices+during+oxygen-glucose+deprivation+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion.</a> ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).</li>
<li>Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. <a target="_blank" href="http://www.jneurosci.org/content/early/2016/12/09/JNEUROSCI.3270-16.2016">Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria.</a> J Neurosci. , (2016).</li>
<li>Pignataro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+characterization+of+a+novel+neuroprotective+strategy+for+stroke%3A+ischemic+postconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).</li>
<li>Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+the+neuroprotective+effect+of+propofol+on+hypoxic+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Inj%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice.</a> Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+profiling+with+HPLC-FTMS+of+exogenous+and+endogenous+chemicals+susceptible+to+the+administration+of+chotosan+in+an+animal+model+of+type+2+diabetes-induced+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia.</a> J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren wij twee experimentele modellen om de neuroprotectie van APC tegen cerebrale ischemie te bestuderen. In breinschijfjes wordt APC bereikt door incubatie van muizen corticostriatale plakjes in zure buffer, die met 20% CO 2 na 20 20 20 20 20 20 20 25 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 25 30 35 60 100 Beide modellen weerspiegelen de neuroprotectie van APC tegen cerebrale ischemie. De bescherming was vergelijkbaar met dat verkregen door ischemische postconditioning maar met een breder tij...

Beroerte is een van de belangrijkste oorzaken van sterfte en handicap wereldwijd. Er zijn grote inspanningen gedaan om effectieve behandelingen voor beroerte in de afgelopen decennia te vinden, maar de prestatie is nogal onbevredigend. Postconditioning is een proces gemanipuleerd door subtoxische spanningen na een ischemische aflevering. Postconditioning, met inbegrip van ischemische, hypoxische, lage glucose en afgelegen ischemische postconditioning, trigger endogene adaptieve mechanismen, en bewezen zijn veelbelovende therapieën tegen cerebrale ischemie 1 , 2 , 3 , 4 . Echter, ischemische postconditioning kan extra verwonding veroorzaken. Limb op afstand ischemische postconditioning heeft meestal verschillende cycli van 5 tot 20 minuten occlusie en reperfusie op de ipsilaterale of bilaterale achterste ledematen 5 , 6 , 7 . thDaarom zijn deze postconditioning manipulaties gevaarlijk of onpraktisch in de klinische praktijk. Om deze nadelen te overwinnen hebben we APC ontwikkeld als een therapie voor focal cerebrale ischemie bij muizen 8 . Geïnduceerd door simpelweg 20% ​​CO 2 in te ademen, vermindert APC de ischemische hersenletsel op een meer haalbare en veiliger manier. Onlangs hebben we aangetoond dat APC het reperfusievenster uitbreidt, waarbij de betekenis van APC voor beroertetherapie 9 wordt benadrukt. Hier presenteren wij twee experimentele modellen om de neuroprotectie van APC tegen cerebrale ischemie te bestuderen. De eerste is het zuurstof-glucose-deprivatie model (OGD) in muizen corticostriatale plakjes. Snelle voorbereiding en overdracht van de hersenschijfjes in een kunstmatige omgeving, meestal kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ASCF), kan de levensvatbaarheid van cellen en neuronale schakelingen handhaven, waardoor het mogelijk is om hersenfunctie in vitro te studeren 10 &lt;Sup&gt;, 11 . OGD in ASCF nabootst cerebrale ischemie en induceert ischemische schade 12 , 13 , 14 . Na OGD worden de hersenschijfjes vernieuwd in regelmatig ASCF (r-ASCF) om reperfusie te verschaffen en vervolgens met APC te behandelen met behulp van zure ASCF met 20% CO 2 geborreld. De corticostriatale plak houdt de intacte histologische karakterisering in vergelijking met primaire gekweekte cellen. Om de hersenfunctie in vivo te bestuderen wordt het muizen midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model gebruikt. De middelste hersenslagader wordt geblokkeerd door een vlamvormige monofilament via de gemeenschappelijke halsslagader in te voegen. Als een van de meest gebruikte stroke modellen, toont het MCAO-model klinische relevantie en de toepassing van een monofilament maakt het gemakkelijker om reperfusie te bereiken. Simpelweg door het inademen van normoxisch gemengd gas met 20% CO 2 na het begin van reperfusioN, APC toonde significante beschermende effecten tegen cerebrale ischemie, aangeduid door verminderde infarctvolumes van de hersenen.

<table><tbody><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Monokaliumfosfaat</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-trifenyltetrazoliумchloride</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>E111993</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler Flowmetrie</td><td>Moor Instruments Ltd</td><td>Model Moor VMS-LDF2</td><td></td></tr><tr><td>Gedehydrateerd di-ethylether</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>80059618</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetaldehyde hydraat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Corporation</td><td>30037517</td><td></td></tr><tr><td>10% Formaline</td><td>Aladdin Industrial Corporation</td><td>F111936</td><td></td></tr><tr><td>24-well platen</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP-010-024</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentele modellen om de neuroprotectie van zure postconditioning te bestrijden tegen cerebrale ischemie

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is een van de belangrijkste oorzaken van sterfte en handicap wereldwijd, met beperkte therapeutische benaderingen. Als een endogene strategie voor neuroprotectie, hebben postconditionerende behandelingen bewezen veelbelovende therapieën tegen cerebrale ischemie. Maar ingewikkelde procedures en mogelijke veiligheidsproblemen beperken hun klinische toepassing. Om deze nadelen te overwinnen hebben we een zware postconditioning ontwikkeld (APC) als een therapie voor experimentele focal cerebrale ischemie. APC verwijst naar de milde acidose behandeling door CO 2 in te ademen tijdens reperfusie na ischemie. Hier presenteren wij twee modellen om respectievelijk APC in vitro en in vivo uit te voeren. De zuurstof-glucose-deprivatie (OGD) -behandeling van muizen en de corticostriatale occlusie- en middelste cerebrale arteriële occlusie (MCAO) van muizen werden gebruikt om cerebrale ischemie te mimmen. APC kan eenvoudig worden bereikt door hersenschijfjes over te brengen naar zuurbuffer die met 20% CO 2 , o wordt geborreldR door muizen die 20% CO 2 inademen. APC vertoonde significante beschermende effecten tegen cerebrale ischemie, zoals weerspiegeld door weefsel levensvatbaarheid en het infarct volume van het hersenen.

In het hierboven beschreven corticostriatale snijmodel werd de corticostriatale snij-levensvatbaarheid gekwantificeerd door TTC-analyse op 1 uur na reperfusie. TTC-omzetting werd berekend door de absorptie bij 490 nm te normaliseren op de controleschijf. Volgens de TTC-omzetting beschermt APC tegen OGD-geïnduceerde reperfusie letsel in een aanvangstijd en duurafhankelijke wijze. In detail heeft zowel 1 en 3 min. Acidose behandeling de levensduur verbeterd na 5 minuten na 15 minuten OGD, ...

Zure postconditioning beschermt tegen cerebrale ischemie. Hier presenteren wij twee modellen om APC uit te voeren. Ze worden respectievelijk bereikt door corticostriatale plakjes over te brengen naar zure buffer na zuurstof-glucose-deprivatie in vitro en door inademing van 20% CO 2 na middelste cerebrale arterie-occlusie in vivo .

Experimentele modellen om de neuroprotectie van zure postconditioning te bestrijden tegen cerebrale ischemie

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Het algemene doel van de behandeling van acidose in een cortico-striataal slice-model in een model van occlusie van de arteria cerebri media is om het neuroprotectieve effect van zure postconditionering tegen cerebrale ischemie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe acidose-postconditionering ischemische hersenschade kan beschermen en bij het ontwikkelen van een nieuwe strategie voor berotherapie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruikgemaakt kan worden van breed beschikbare experimentele modellen om de neuroprotectie van acidose-postconditionering te bestuderen.Yarong Zheng, een promovendus uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Begin met het verwijderen van de hersenen uit de schedel van een onthoofde muis met een dunne spatel en plaats deze voorzichtig in een bekerglas met ijskoude reguliere ACSF, geëquilibreerd met 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof. Breng cryoprecipitaatlijm aan op de Vibratome-plaat in twee stroken.Plaats een stukje drie procent agarose op de lijmstrip die het verst van het mesje afligt om de hersenen te ondersteunen. Gebruik vervolgens een pincet om de hersenen over te brengen naar filterpapier. Snijd de frontale pool en het cerebellum af met een mesje.Plaats het hersenweefsel verticaal op de vrije strook lijm, waarbij de hersenen tegen de agarose aanleunen. Voeg ijskoude ACSF toe aan het snijreservoir om de hersenen onder te dompelen en voeg ijs toe aan het ijshoudergedeelte. Houd de ACSF in het reservoir verzadigd met vijf procent kooldioxide en 95% zuurstof.Nadat de vibratoom is ingesteld om secties van 400 micron te snijden en de hersenen correct ten opzichte van het snijmes zijn gepositioneerd, wordt de start-stopknop ingedrukt om het automatische snijden te starten. Gebruik een Pasteurpipet met een afgeknipt uiteinde om vijf hersencoupes één voor één over te brengen en plaats deze in de weefselhouder in ijskoude reguliere ACSF, gebubbelled met 5% kooldioxide en 95% zuurstof. Plaats de hersencoupes na 30 minuten bij kamertemperatuur gedurende tien minuten in een waterbad op 37 °C om de synaptische functie te herstellen.Plaats glucosevrije ACSF en zure ACSF in het waterbad van 37 °C en spoel de oplossingen gedurende 30 minuten respectievelijk met 5% koolstofdioxide en 95% stikstof en met 20% koolstofdioxide en 80% zuurstof. Breng voorzichtig vier van de vijf hersensecties over naar voorverwarmde glucosevrije ACSF van 37 °C en laat deze 15 minuten incuberen. Om het tijdsvenster voor zure preconditioning te bestuderen, wordt één sectie direct overgebracht van glucosevrije ACSF naar zure ACSF en worden de andere drie secties overgebracht naar reguliere ACSF voor reperfusie.Na drie minuten wordt het plakje van zure ACSF overgebracht naar normale ACSF. Na vervolgens vijf minuten in normale ACSF wordt een van de plakjes vanuit de normale ACSF gedurende drie minuten overgebracht naar de weefselhouder met zure ACSF. Breng een ander plakje op dezelfde wijze over 15 minuten na reperfusie.De overgebleven slice die in glucosevrije ACSF maar niet in zure ACSF is geplaatst, dient als de groep met zuurstof- en glucosegebrek. Verplaats de slices van de ACSF naar de wells van een 24-wellplaat die TTC-oplossing bevat. Strijk de slice uit in de oplossing.Incubeer daarna 30 minuten bij 37 °C in een ondiep waterbad. Breng de plakjes vervolgens over in schone, gewogen centrifugebuisjes van 1,5 ml die zijn afgedekt met folie en meet het droge gewicht van de plakjes. Extraheer na het wegen het formazaan door een een-op-een oplossing van ethanol en dimethylsulfoxide aan de buisjes toe te voegen, met een volume-gewichtsverhouding van 10:1.Incubeer 24 uur lang op een donkere plaats. Breng de volgende dag de ethanol dimethylsulfoxide-oplossing over van de buisjes naar een 96-wells plaat en meet de absorbentie bij 490 nanometer met een plaatlezer. Bevestig eerst de juiste anesthesie door de afwezigheid van de teenknijpreflex.Plaats vervolgens de geanestheseerde muis, met de LDF-probe bevestigd aan de schedel, in rugligging en fixeer deze met steriele katoenen draden. Desinfecteer de geschoren huid van de nek met 75% ethylalcohol. Maak vervolgens een peri-mediale huidincisie in de nek en ontleed de weke delen botstomp met een pincet om de bloedvaten bloot te leggen.Voeg één druppel zoutoplossing toe aan de blootgestelde weefsels om ze gehydrateerd te houden. Gebruik vervolgens oogheelkundige pincetten om de arteria carotis communis te dissekeren van het omringende weefsel en de nervus vagus. Wees voorzichtig om de nervus vagus niet te beschadigen.Plaats een micro-vatklem op het distale uiteinde van de arteria carotis communis. Maak vervolgens een dode knoop met 6-0 zijden hechtdraad aan het proximale uiteinde. Knoop daarna een losse knoop proximaal van de klem als tijdelijke hechting.Gebruik vervolgens micro-oftalmologische scharen om een kleine longitudinale incisie te maken tussen de twee knopen, zo dicht mogelijk bij de dode knoop. Voer nu een monofilament van 12 millimeter met stompe punt door de incisie in het lumen van de arterie in en schuif deze enkele millimeters verder. Trek de losse knoop strak rond de punt van het monofilament en verwijder daarna de klem.Gebruik vervolgens oogheelkundige pincetten om de filament verder in de arteria carotis interna te duwen totdat de LDF-software een scherpe daling in de bloedstroom laat zien. Noteer het starttijdstip van de occlusie. Verwijder daarna de LDF-probe en plaats de muis voor de duur van één uur van de occlusie in een incubator van 30 °C.55 minuten na het begin van de occlusie wordt het dier opnieuw verdoofd met isofluraan en in dezelfde positie als voorheen geplaatst. Open vervolgens de incisie in de nek en leg de arteria carotis communis opnieuw bloot. Gebruik na de occlusieperiode een oogpincet om het filament voorzichtig te verwijderen om reperfusie te bereiken.Zet vervolgens de tijdelijke hechting om in een permanente hechting door de knoop aan te trekken. Voor de behandeling van acidose moet het gas dat via de neusconus wordt ingeademd gedurende vijf minuten worden gewijzigd naar 20% koolstofdioxide, 20% zuurstof en 60% stikstof. Nadat de incisie met een onderbroken chirurgische hechting is gesloten, wordt de muis in een op 30 °C verwarmde kooi geplaatst tot de muis het bewustzijn heeft teruggewonnen.Dit histogram toont de resultaten van de TTC-assay die is uitgevoerd op corticale plakjes na zuurstof- en glucosegebrek en zure postconditionering, zoals gedemonstreerd in deze video. Drie minuten acidosebehandeling was neuroprotectief wanneer de behandeling onmiddellijk of vijf minuten na het zuurstof- en glucosegebrek werd gestart, maar niet wanneer de plakjes gedurende 15 minuten waren gereperfuseerd. Muizen werden onderworpen aan 60 minuten occlusie van de middelste cerebrale arterie en behandeld door vijf minuten lang 20% koolstofdioxide in te ademen op vijf, 50 of 100 minuten na reperfusie.Het infarctvolume werd gekwantificeerd door middel van triphenyltetrazoliumhydrochloride-kleuring 24 uur na reperfusie, zoals aangegeven door de zwarte stippellijnen. Dit histogram toont het percentage infarctvolume voor elke conditie. De neuroprotectie door zure postconditionering was robuust, zelfs wanneer de starttijd werd uitgesteld tot 50 minuten na reperfusie.Behandeling van acidose die werd gestart bij 100 minuten blokkeerde de ischemische beschadiging echter niet. Na het bekijken van de video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de neuroprotectie van acidose-postconditionering kunt bestuderen in een OGD-model van hersensecties en in een MSO-model van muizen. Bij het uitvoeren van de procedures is het belangrijk om te onthouden dat de omvang en de duur van de acidose essentieel zijn om de beschermende effecten te reproduceren.

experimental-models-to-study-neuroprotection-acidic-postconditioning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Wij streven ernaar om de neurale immuun signalering die verantwoordelijk zijn voor koude-preconditionering als middel om nieuwe targets voor geneesmiddelen ontwikkeling identificeren hersenen te beschermen voor letsel ontstaan ​​definiëren. We presenteren de strategieën voor een dergelijk werk dat biologische systemen, experimentele manipulaties plus technische capaciteiten die zeer reproduceerbare en gevoelige vereisen.

Strategieën voor de Studie van de neuronen van Cold-preconditionering

Midden cerebrale arterie (MCA) ligatie is een techniek om focale cerebrale ischemie studie in diermodellen. In deze methode wordt de middelste hersenslagader blootgesteld door craniotomie en geligeerd door cauterisatie. Deze methode geeft zeer reproduceerbare infarct volumes en hogere post-operatieve overlevingskansen in vergelijking met andere methoden beschikbaar.

De toepassing van permanente midden cerebrale slagader Ligatie in de muis

Er is een groeiend aantal aanwijzingen, dat ischemische preconditionering (PC) - een niet-schadelijk ischemische uitdaging voor de hersenen - verleent een tijdelijke bescherming aan een volgende schadelijke ischemische schade. Wij opgericht bilaterale gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader (BCCAO) als voorbehandeling stimulans voor vroege ischemische tolerantie (IT) in C57Bl6 / J muizen aanzetten tot voorbijgaande focale cerebrale ischemie (geïnduceerd door midden cerebrale slagader...

Bilaterale Gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader als een adequate Voorconditionering Stimulus naar Early ischemische tolerantie te induceren bij focale ischemie

Source: Zheng, Y., et al. Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the application of acidic postconditioning (APC) to evaluate its neuroprotective effects against ischemic injury in a mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO). It outlines the steps involved in reperfusion in the MCAO model and the application of APC during reperfusion to mitigate excitotoxicity, oxidative...

 Assessing the Neuroprotective Effects of Acidic Postconditioning in a Mouse Model of Cerebral Ischemia

Source: Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a non-invasive limb ischemic preconditioning protocol in rats to induce systemic neuroprotection. The procedure involves controlled arterial occlusion and reperfusion, triggering cellular stress pathways that release protective factors. These factors enhance resistance to ischemic and metabolic injuries in distant organs such as the brain and retina.

Non-Invasive Limb Ischemic Preconditioning in a Rat Model for Neuroprotection

We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Hier presenteren we een protocol te induceren post-takt depressie bij ratten door afsluiter het midden cerebrale slagader via de interne halsslagader. We gebruiken de Porsolt geforceerde zwem test en de sacharose voorkeur test om geïnduceerde depressieve stemmingen te bevestigen en te evalueren.

Een middelste cerebrale slagader occlusie techniek voor het induceren van post-takt depressie bij ratten

Het doel van deze studie is het vaststellen en valideren van een diermodel voor onderzoek in de herstel-en sequela stadia van hersen ischemie door het testen van herseninfarct en sensorimotorische functie na de middelste cerebrale slagader occlusion/reperfusie (MCAO/R) na 1-90 dagen bij ratten.

Een preklinisch model om hersen herstel na acute beroerte bij ratten te beoordelen

Dit protocol beschrijft het proces voor het induceren van een cerebraal ischemisch comamodel met behulp van een aangepaste occlusiemethode met vier vaten.

Cerebraal ischemisch comamodel geïnduceerd door gemodificeerde occlusie van vier bloedvaten

Leer zure postconditioning voor neuroprotectie tegen cerebrale ischemie met in vitro corticostriatale sneden en een in vivo middelste cerebrale arterie occlusie model. Deze methode ondersteunt onderzoek naar nieuwe strategieën voor beroertetherapie.

Experimentele modellen om de neuroprotectie van zure postconditioning te bestrijden tegen cerebrale ischemie

Meer video's verkennen