Experimentele modellen om de neuroprotectie van zure postconditioning te bestrijden tegen cerebrale ischemie

Het algemene doel van acidosisbehandeling in een cortico striatale plakmodel in een middelste hersenslagaderocclusiemodel is om het neuroprotectieve effect van zure postconditionering tegen cerebrale ischemie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe acidosis postconditionering ischemisch hersenletsel kan beschermen, en om een nieuwe strategie voor beroertetherapie te ontwikkelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om wijd verkrijgbare experimentmodellen te gebruiken om de neuroprotectie van acidosis postconditionering te bestuderen.

Het demonstreren van de procedure zal Yarong Zheng zijn, een afgestudeerde student uit mijn lab. Begin met het verwijderen van de hersenen uit de schedel van een onthoofde muis met een dunne spatel en laat het voorzichtig vallen in een beker met ijskoud regulier ACSF geëquilibreerd met vijf procent kooldioxide en 95% zuurstof. Breng cryoprecipitaatlijm aan op de vibratoonplaat in twee stroken.

Plaats een stuk van drie procent agarose op de lijmstrook die het verst van de mes is om de hersenen te ondersteunen. Gebruik vervolgens een pincet om de hersenen over te brengen naar filterpapier. Snijd het frontale uiteinde en het cerebellum af met een mes.

Plaats het hersenweefsel verticaal op de vrije strook lijm met de hersenen tegen de agarose geleund. Voeg ijskoud ACSF toe aan het snijreservoir om de hersenen onder te dompelen en voeg ijs toe aan het ijshoudergebied. Houd het ACSF in het reservoir geblubberd met vijf procent kooldioxide en 95% zuurstof.

Na het instellen van de vibratoon om 400 micrometer secties te snijden, en het hersenen correct te positioneren ten opzichte van het snijbladen, druk op de start-stopknop om het automatische snijden te starten. Gebruik een Pasteur-pipet met een gesneden punt om vijf hersensneden een voor een over te brengen en plaats ze in de weefselhouder in ijskoud regulier ACSF geblubberd met vijf procent kooldioxide en 95% zuurstof. Plaats de hersensneden na 30 minuten bij kamertemperatuur in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende tien minuten om de synaptische functie te herstellen.

Plaats glucosevrije ACSF en zure ACSF in het waterbad van 37 graden Celsius en blubber de oplossingen met vijf procent kooldioxide en 95% stikstof en 20 procent kooldioxide en 80% zuurstof gedurende 30 minuten. Breng voorzichtig vier van de vijf hersensneden over in een voorverwarmde glucosevrije ACSF van 37 graden Celsius en incubeer gedurende 15 minuten. Om de tijdsvenster voor zure preconditie te bestuderen, breng je één plakje direct over van glucosevrije ACSF naar zure ACSF en breng je de andere drie plakjes over naar reguliere ACSF voor reperfusion.

Na drie minuten breng je de plak in zure ACSF over naar reguliere ACSF. Breng dan na vijf minuten in reguliere ACSF een van de plakjes over van reguliere ACSF naar de weefselhouder in zure ACSF gedurende drie minuten. Breng op dezelfde manier een ander plakje over na 15 minuten reperfusion.

De resterende plak die in glucosevrije ACSF maar niet in zure ACSF werd geplaatst, wordt ingesteld als de zuurstofglucosedeprivatiegroep. Breng de plakjes van de ACSF over in de putjes van een 24-putjesplaat met TTC-oplossing. Strek de plak uit in de oplossing.

En incubeer vervolgens gedurende 30 minuten in een ondiep waterbad van 37 graden Celsius. Breng vervolgens de plakjes over in schone, gewogen, 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes bedekt met folie en meet het drooggewicht van de plakjes. Na het wegen, extraheert u Formazan door een een-op-een-oplossing van ethanol en dimethylsulfoxide toe te voegen aan de buisjes met een volume-op-gewichtsverhouding van 10 tot 1.

Incubeer uit het licht gedurende 24 uur. Breng de volgende dag de ethanol dimethylsulfoxide-oplossing van de buisjes over naar een 96-putjesplaat en meet de absorptie bij 490 nanometer met behulp van een platenlezer. Bevestig eerst de juiste anesthesie door het ontbreken van een teenprikkelrflex.

Plaats vervolgens de verdoofde muis met een LDF-sonde aan zijn schedel bevestigd in een liggende positie en fixeer deze met steriele katoenen draden. Desinfecteer de geschoren halshuid met 75% ethylalcohol. Maak vervolgens een perimidiane huidsnede in de nek en dissecteer de zachte weefsels met pincet om de bloedvaten bloot te leggen.

Voeg een druppel zoutoplossing toe aan de blootgestelde weefsels om ze gehydrateerd te houden. Gebruik vervolgens oogheelkundige pincet om de gemeenschappelijke halsslagader te dissecteren uit het omringende weefsel en de nervus vagus. Wees voorzichtig om de nervus vagus niet te beschadigen.

Plaats een microvatje aan het distale uiteinde van de gemeenschappelijke halsslagader. En knoop een dode knoop met 6-0 zijden naden aan het proximale uiteinde. Knoop vervolgens een losse knoop proximaal aan de klem als tijdelijke naad.

Gebruik vervolgens micro-oogheelkundige scharen om een kleine longitudinale incisie te maken tussen de twee knopen zo dicht mogelijk bij de dode knoop. Voer nu een 12 millimeter, geslepen monofilament door de incisie in het arteriële lumen en schuif het enkele millimeters naar voren. Trek de losse knoop strak rond de punt van het monofilament en verwijder vervolgens de klem.

Gebruik vervolgens oogheelkundig pincet om het filament in de interne halsslagader te brengen totdat de LDF-software een scherpe daling in de bloedstroom laat zien. Noteer de starttijd van de occlusie. Snijd vervolgens de LDF-sonde af en plaats de muis in een 30 graden Celsius incubator voor de duur van de occlusie van één uur.

55 minuten na het begin van de occlusie herverdoof het dier met isofluraange en positioneer het dier zoals eerder. Open vervolgens de halssnede en leg de gemeenschappelijke halsslagader opnieuw bloot. Na de occlusieperiode trekt u voorzichtig met oogheelkundig pincet het filament eruit om reperfusion te bereiken.

Verander vervolgens de tijdelijke naad in een