Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

Het algemene doel van deze procedure is om tau-fosforylering, de microtubule-bindcapaciteit van tau en de lokalisatie van tau te bestuderen, met behulp van confocale microscopie in darmkankercellen. Deze methode kan effectief zijn voor de meeste biologische onderzoeksgebieden, vooral kanker- en dementieonderzoek, waar fosforylering en microtubule-binding belangrijke factoren zijn. Het grote voordeel van de gepresenteerde fosforatase-assay is dat het een eenvoudige manier biedt om de volledige fosforylering van eiwitmonsters waar te nemen.

Het grote voordeel van de microtubule-bindassay is dat het een eenvoudige procedure is om de microtubule-bindeiwitten te scheiden van niet-bindende fracties. De belangrijkste voordelen van de tau-lokalisatietechniek zijn echter dat het relatief kleine hoeveelheden primaire en secundaire antilichamen vereist. Om deze procedure te beginnen, bereidt u alle reagentia voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Breng ongeveer een miljoen HCT 116-cellen over in kweekschalen met minimaal essentieel medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline-streptomycine. Wanneer de cellen 65% confluentie bereiken, gebruikt u een aspirator om het FBS-gesupplementeerde medium te verwijderen. Voeg vervolgens serumvrij MEM toe, dat of curcumin of lithiumchloride bevat.

Incubeer 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Was daarna de cellen met 10 milliliter ijskoud PBS. Voeg een milliliter ijskoud PBS toe en gebruik vervolgens een celschraper om de cellen te schrapen en over te brengen in 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes.

Centrifugeer gedurende vier minuten bij 1800 keer G en vier graden Celsius. We suspenderen de celpellets in 100 microliters complete RIPA-buffer bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten, waarbij we ervoor zorgen dat we de buisjes regelmatig tikken om de cellen te lyseren. Soniceer vervolgens de monsters kort op een amplitude van 10% met pulsering van 0,2 seconden aan en 0,2 seconden uit, voor een totaal van 2 seconden.

Centrifugeer het cellenhomogenaat bij 22.570 keer G en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Breng de supernatanten over in nieuwe gelabelde buisjes en meet vervolgens de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-assay, zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat u monsters hebt bereid die 20 microgram totaal eiwit bevatten, voegt u twee microliter alkalische fosfataasbuffer en 10 microliter alkalische fosfatase toe aan elk.

Voeg vervolgens gedestilleerd water toe, zodat het eindvolume van elk monster 20 microliter is. Incubeer de monsters gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Terwijl de monsters incuberen, bereidt u aanvullende monsters voor met dezelfde concentratie, maar zonder fosfatase ter vergelijking.

Na één uur stopt u de reactie door EDTA toe te voegen met een eindconcentratie van 50 millimolar of natriumorthovanadate met een eindconcentratie van 10 millimolar. Voeg vers bereid 4XSDS-gel-laadbuffer toe met 400 millimolar DTT. Gebruik een hitteblok en incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij 100 graden Celsius.

Vortex de monsters en laat ze vervolgens 10 tot 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur. Laad vervolgens 13 microliter monster per putje en de molecuulgewichtsladder op een 10% polyacrylamidegel. Sluit het elektroforesesysteem aan op een stroombron en stel de spanning in op 70 volt gedurende 20 minuten om de eiwitmonsters vanuit het stackinggel in het resolutiegel te verplaatsen.

Verhoog daarna naar 125 volt en laat de gel ongeveer 70 tot 120 minuten lopen totdat de monsters en de eiwitladder het einde van de gel bereiken. Gebruik een nat elektroblotsysteem om de gel over te brengen naar een polyvinylideenfluoride-membraan bij 100 volt gedurende ongeveer 100 minuten. Incubeer vervolgens het membraan om te blotten in 4% runder-serumalbumine gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.

Incubeer de blot overnacht in primaire antilichaamoplossing bij 4 graden Celsius. Was de blot de volgende dag drie keer in PBST, waarbij u elke keer zeven minuten wast. Incubeer in de onzekere secundaire-antilichaamoplossing gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.

Was vervolgens met PBST vier keer, waarbij elke wasbeurt zeven minuten duurt. Ontwikkel de blot met behulp van een chemiluminescentie-kit volgens de instructies van de fabrikant. Bedek de ontwikkelde blot met transparant plasticfolie en verwerf vervolgens chemiluminescentie-beelden van de blot met een commercieel verkrijgbaar chemiluminescentie-beeldvormingssysteem.

Na het bereiden van verse monsters, incubeer ze gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Ultracentrifugeer de monsters gedurende 60 minuten bij 100.000 keer G en 25 graden Celsius. Breng vervolgens 120 microliter van elk supernatant dat ongebonden tau bevat over in afzonderlijke, schone en gelabelde buisjes.

Voeg 120 microliter Fibic-stapelbuffer toe aan het pellet dat gebonden tau bevat. Na grondig mengen, door middel van vortexen en pipetteren, brengt u het mengsel over in schone, gelabelde buisjes. Nadat u monsters met gelijkwaardige eiwitconcentratie hebt bereid, voegt u vers 4XSDS-gel-laadbuffer toe met 400 millimolar DTT.

Gebruik een hitteblok om de monsters gedurende vijf minuten bij 100 graden Celsius te incuberen. Vortex de monsters en laat ze vervolgens 10 tot 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur. Laad 13 microliter monster per putje en de molecuulgewichtsladder op een 10% polyacrylamidegel.

Verbind de positieve en negatieve elektroden van het elektroforesesysteem met een stroombron en stel de spanning vervolgens in op 70 volt gedurende 20 minuten. Verhoog daarna naar 125 volt en laat de gel ongeveer 70 tot 120 minuten lopen totdat de monsters en de eiwitladder het einde van de gel bereiken. Gebruik een nat elektroblotsysteem om de gel over te brengen naar een polyvinylideenfluoride-membraan bij 100 volt gedurende ongeveer 100 minuten.

Incubeer het membra